全 文 ：向日葵 BADH基因表达的定量
PCＲ检测方法建立与初步应用
易乐飞 周科峰 王 萍
(淮海工学院海洋学院，222005，江苏连云港)
摘 要 向日葵不是盐生作物，但具有较强的
耐盐和耐旱能力。甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)是
植物重要的抗逆基因之一。检测 BADH基因表达有
助于研究向日葵对逆境胁迫的响应机制。因此本文
以真核延伸因子 1A(eEF1A)为内参，采用 SYBＲ
Green I荧光染料法，建立向日葵 BADH 基因表达的
定量 PCＲ检测方法。BADH和eEF1A的扩增曲线基
线平整、指数区明显，熔解曲线上仅显示单一特异
峰，扩增效率分别为 1. 90 和 1. 96，Cq值平均变异系
数分别为 0. 51%和 0. 65%。这些数据表明检测方
法特异性强、重复性好、结果可靠。应用建立的检测
方法初步检测了盐和干旱胁迫对向日葵 BADH基因
表达的影响，结果显示 BADH 受盐和干旱胁迫的诱
导表达。
关键词 向日葵;甜菜碱醛脱氢酶;BADH 基
因;定量 PCＲ;盐胁迫;干旱胁迫
作者简介:易乐飞，副教授，主要从事分子遗传学研究
王萍为通信作者，教授，主要从事植物基因工程研究
基金项目:教育部大豆重点实验室开放课题(SB08A03)
收稿日期:2013 － 05 － 01;修回日期:2013 － 07 － 04
在植物细胞内甜菜碱醛脱氢酶(betaine alde-
hyde dehydrogenase，BADH)催化甜菜碱醛(betaine
aldehyde)生成甘氨酸甜菜碱(glycine betaine)［1］。
甘氨酸甜菜碱被认为是植物重要的抗逆物质，参与
植物耐盐、耐旱过程，在干旱和盐碱下维持细胞渗透
平衡［2］，因此各国学者对甘氨酸甜菜碱和 BADH 产
生了浓厚的兴趣。1981 年 Pan 等［3］首次分析了
BADH的酶活，1990 年 Weretilnyk 等［4］克隆了菠菜
(Spinacia oleracea)的 BADH 基因。此后，大量
BADH基因被陆续克隆，基因功能被进一步研究，研
究表明 BADH受到盐、旱和温度胁迫的诱导表达，在
植物抗逆过程中发挥积极作用，超表达外源 BADH
基因显著提高了转基因植物的耐盐和耐旱能力［1］。
向日葵(Helianthus annuus)是重要的油料作物，
在盐碱地开发利用中发挥着重要作用。向日葵具备
较强的耐盐碱、耐干旱和耐瘠薄能力，能使土壤脱盐
进而改良土壤，因此不少学者对向日葵在盐胁迫下
的反应及其抗盐机理进行了大量研究［5］。目前，向
日葵 BADH基因序列已经被成功预测［6］，
櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓
其部分序
Application of TILLING Technology in Ｒice Salt
Tolerance Gene SKC1 Mutant Screening
Wang Caifen1，Ma Xiaoling2，An Yongping1，
Zhang Wenyin1，Ma Jing1，Liu Dongcheng2
(1Crop Institute of Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yinchuan 750105，Ningxia，China;
2 Institute of Genetics and Developmental Biology，China Academy of Sciences，Beijing 100101，China)
Abstract TILLING technology is an efficient reverse genetics method to detect SNP． According to the sequence of
the rice main salt tolerance gene SKC1，the specific primers were designed． Mutation sites of 1310 M2 materials in-
duced by EMS (ethyl methane sulfonate)have been detected． After 2011 － 2012 two years sequencing analysis of
M2 － M3 generation，we obtained 5 homozygous and 14 heterozygous SKC1 gene mutants． The results showed that the
TILLING technology was an effective method to detect rice salt-tolerant mutant．
Key words Ｒice;TILLING technology;SKC1 gene;Mutant (责任编辑:郭子锋)
07
作物杂志 Crops2013. 5
列也已被测定［7］，但是该 BADH 与向日葵抗逆之间
的关系未见报道。本文以eEF1A(eukaryotic transla-
tion elongation factor 1A)为内参，拟建立向日葵
BADH基因的实时荧光定量 PCＲ(real-time fluores-
cence quantitative PCＲ)检测方法，并初步分析盐和
干旱胁迫下 BADH 的响应，为进一步探索向日葵的
抗逆机理及相关调控过程奠定基础，对向日葵抗逆
品系选育也具有一定意义。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
参考王萍等［8］的研究结果，向日葵选用具有良
好耐盐性的长岭白品种。种子先于室温下浸泡
24h，然后播种于黄沙中，每天浇灌 Hoagland 营养
液。向日葵长至四叶期时，分别用足量的 100mmol /
L、200mmol /L 和 300mmol /L NaCl 浇灌以进行盐胁
迫，用 10%和 20% PEG 8000 浇灌以进行模拟干旱
胁迫，对照组不做处理，胁迫 4h 后剪取幼嫩叶片用
于总 ＲNA抽提。
1. 2 总 ＲNA抽提与反转录反应
参照周向红等［9］的方法，采用改良的 CTAB 法
提取叶片总 ＲNA。用液氮将 100mg 叶片研磨成粉，
随后加入 CTAB裂解液进行裂解，加入氯仿进行抽
提，最后用 LiCl 选择性沉淀总 ＲNA，总 ＲNA 用
ＲNase-free水溶解后立刻进行 DNase 处理。DNase
处理参照 DNase I(Fermentas)说明书进行，但在反
应体系中额外添加 ＲiboLock ＲNase inhibitor(Fer-
mentas)以保护 ＲNA。处理后按常规苯酚 /氯仿抽提
方法纯化总 ＲNA。最后，总 ＲNA 质量采用凝胶电
泳和核酸蛋白测定仪(Bio-Ｒad)检测。
反转录反应按 ＲevertAidTM H Minus First Strand
cDNA Synthesis kit(Fermentas)说明书操作，以 2μg
总 ＲNA为模板，以 Oligo(dT)为引物进行反转录反
应，反应生成第一链 cDNA，10 ×稀释后备用。
1. 3 BADH基因的克隆
根据已预测的向日葵 BADH 序列［6］设计引物，
上游引物:5 TAACTTTCACTCACCGACTC 3，下游
引物:5 GTGCCAAACGGTACAGAC 3，预期扩增大
小为 1 640bp。PCＲ 体系总体积为 20μL，其中含有
1 × PCＲ Buffer、2mmol /L MgCl2、200μmol /L dNTP、
0. 5μmol /L上、下游引物、1U Dream Taq DNA Poly-
merase(Fermentas)和 1μL cDNA模板。PCＲ仪(Ep-
pendorf)上的反应条件设置为:先 95℃预变性 5min，
然后 30 个循环扩增，每个循环中包括 95℃变性
30s，51℃退火 30s，72℃延伸 1min 40s，最后 72℃充
分延伸 5min。扩增产物进行电泳检测并正反双向
测序。
1. 4 内参基因eEF1A的电子克隆与序列分析
电子克隆技术路线参照易乐飞等［6］的方法，
EST(expressed sequence tag)序列拼接后用 OＲF
finder (http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov /projects /
gorf /)和 Blast［10］对拼接结果进行简单分析。
1. 5 定量 PCＲ反应体系与条件
根据测序得到的 BADH序列设计 BADH的定量
PCＲ 引 物，上 游 引 物:5 AACTTTCACTCAC-
CGACTCTTAC 3，下游引物:5 GCAGGATTGATGA-
CAGGGATG 3，预期扩增大小为 189bp。根据预测
的eEF1A 序列设计定量 PCＲ 引物，上游引物:5
AGCCCAAGAGACCCTCAGACAAG 3，下游引物:5
CCCTGATGGTCCGAAGGTAACAAC 3，预期扩增大
小为 143bp。本实验所有引物均由生工生物工程
(上海)股份有限公司合成。
定量 PCＲ 反应体系为 20μL，其中包含 10μL
2 × SYBＲ Premix Ex TaqTM II (Tli ＲNaseH Plus)
(TaKaＲa)、0. 4μmol /L定量 PCＲ 引物和 1μL cDNA
模板。扩增反应在 Bio-Ｒad的 IQ5 定量 PCＲ仪上进
行。采用两步 PCＲ 法进行扩增，即 95℃ 预变性
30s，然后进入 40 个循环，每个循环中 95℃ 变性
10s，退火延伸 30s;循环结束后，从 55℃缓慢升温至
95℃，制备熔解曲线。采用实时荧光定量梯度 PCＲ
优化退火延伸温度，温度梯度范围为 54 ～ 64℃，观
察温度对荧光信号的影响，选取循环阈值 Cq 最小
且扩增曲线最好的温度用于后续实验。反应还设有
无模板对照(NTC) ，每个反应设 3 个重复。
1. 6 数据处理
将定量 PCＲ 仪记录到的所有原始荧光数据从
iQ5 Optical System Software v2. 1(Bio-Ｒad)导入到
LinＲegPCＲ软件［11］，并由 LinＲegPCＲ计算得到平均
扩增效率(E)、循环阈值 Cq，最后应用 Pfaffl［12］建立
的数学模型进行相对定量分析。
2 结果与分析
2. 1 总 ＲNA质量
分别在 280nm、260nm 和 230nm 波长下测量了
总 ＲNA 的吸光值，计算得到 A260 /A230 = 2. 61 ±
0. 18，A260 /A280 = 1. 98 ± 0. 02。电泳图上呈现出明
17
作物杂志 Crops 2013. 5
亮、清晰的 28S 和 18S rＲNA 条带以及一些细胞器
rＲNA(图 1，仅显示部分电泳结果)。这些数据表明
提取的向日葵总 ＲNA样品质量良好，其纯度和完整
性适合后续实验的要求。
图 1 总 ＲNA的琼脂糖凝胶电泳
2. 2 BADH基因克隆与测序
扩增产物经电泳后呈现出 1 条长约 1 600bp 的
单一特异性片段(图 2) ，其长度与预期大小相符。
双向测序获得了向日葵 BADH 的核酸序列，Gen-
Bank索引号为 GQ381273。实际测序结果与电子克
隆预测结果之间的序列一致性高达 99. 2%。
1:BADH基因的扩增产物;M:DNA Marker
图 2 扩增产物电泳图
2. 3 eEF1A电子克隆
以 烟 草 (Nicotiana tabacum )的 eEF1A
(BAA09709)为种子序列搜索向日葵 EST 数据库，
从中筛选出了 15 条高度相似性的 EST 序列
(DY914550，DY913972，DY911283，DY907214，
BU028740， DY919836， DY911976， DY904052，
DY903925， DY909098， AJ828756， BQ970284，
DY912224，CD852411，GE512287) ，拼接后获得了向
日葵eEF1A的部分序列(图 3)。该序列长 1 265bp，
在第 62 个核苷酸处含有起始密码子 ATG，编码了
364 个氨基酸，氨基酸序列与烟草、甜叶菊(Stevia re-
baudiana)、马铃薯(Solanum tuberosum)和水稻(Ory-
za sativa)等高等植物的 eEF1A 之间具有高达
95% ～99%的序列一致性。
图 3 EST拼接示意图
2. 4 定量 PCＲ退火延伸温度的筛选
梯度 PCＲ 结果显示 2 组定量引物在 54 ～ 64℃
温度范围内都扩增得到了“S”形曲线，扩增曲线基
线平整、指数区明显、斜率大(图 4)。2 组引物在
64℃扩增时 Cq值最大，随着温度的降低 Cq 值逐渐
缩小，在温度为 56. 1℃和 54. 8℃时 Cq值最小，温度
继续下降时 Cq值略有增加。再结合熔解曲线数据
(图 5) ，我们确定 2 组定量引物的最佳退火延伸温
度为 56℃，此温度下扩增特异性强、灵敏度高、Cq
值小。
图 4 梯度 PCＲ的扩增曲线
2. 5 定量 PCＲ检测方法的可靠性
高质量的定量 PCＲ 检测体系应该具备高重复
性、高特异性和高效性等特点。为了验证重复性，我
们对每个 ＲNA 样品同时进行 3 次独立的定量 ＲT-
PCＲ检测，同一 ＲNA样品的扩增曲线在荧光阈值附
近基本重叠。对 BADH和eEF1A基因表达重复检测
的结果显示，重复间的 Cq 值极差(最大值与最小值
的差异)的范围分别为 0. 10 ～ 0. 34 和 0. 03 ～ 0. 35，
Cq值极差的平均值为 0. 22 和 0. 18，变异系数的范
围分别为 0. 22% ～0. 74%和 0. 10% ～ 1. 67%，变异
系数的平均值为 0. 51%和 0. 65%。这些数据表明
检测方法的重复性好，结果可靠。
27
作物杂志 Crops2013. 5
为了验证特异性，我们检测了无模板对照的扩
增曲线和扩增产物的熔解曲线。无模板对照的扩增
曲线呈水平直线状，无起飞曲线;每对基因的熔解曲
线上都只具有特异的单一峰(图 5)。这些数据说明
扩增产物中不存在引物二聚体或非特异性产物，定
量体系的特异性较高、无污染。
图 5 定量 PCＲ反应特异性检测
标准曲线常被用来计算扩增效率，但在实践中
标准曲线法受到多种因素的影响。若 ＲNA 中含有
微量的聚合酶抑制剂，随着模板的不断稀释，抑制剂
也被不断稀释，扩增效率就不断增加，从而出现了扩
增效率被放大的现象;此外，构建标准曲线的重复数
不同，计算得到的扩增效率也会不同［13］。因此 Ｒui-
jter等［11］设计了 LinＲegPCＲ软件从单个扩增曲线来
计算扩增效率，该方法被证明比标准曲线法偏差更
小［14］。Tong等［15］和 Cordoba 等［16］采用 LinＲegPCＲ
计算得到的平均扩增效率分别介于 1. 671 ～ 1. 828
和 1. 83 ～ 1. 93。本研究中，BADH 和eEF1A 基因的
平均扩增效率分别为 1. 90 和 1. 96，这些数据表明
本实验的扩增效率良好。
2. 6 BADH基因表达的初步检测
按照本研究建立的实时荧光定量 PCＲ 检测方
法，以eEF1A为内参，对不同 NaCl和 PEG 处理下的
向日葵 BADH基因表达进行了定量分析。结果表明
随着盐和干旱胁迫的加剧 BADH表达量逐渐增加。
图 6 不同盐度下 BADH的相对表达差异
200 和 300mmol /L NaCl处理 4h 后 BADH 表达量分
别是对照的 2. 03 和 3. 22 倍，但是 100mmol /L NaCl
处理 4h没有增加 BADH 的表达量(图 6)。10%和
20% PEG 8000 处理 4h后 BADH表达量分别是对照
的 1. 2. 和 1. 6 倍(图 7)。
图 7 不同 PEG 8000 浓度下 BADH的相对表达差异
3 讨论
1986 年 Weigel等［17］发现盐胁迫下的菠菜(Spi-
nacia oleracea)叶片具有更高的 BADH活性，首次表
明 BADH参与植物对盐胁迫的响应过程，此后大量
的实验也验证了这一观点［1］。但是不同 BADH 同
工酶具有不同的组织表达特异性，如在水稻成熟叶
片中 BADH1 受盐胁迫诱导，BADH2 则不受诱
导［18］。虽然还有学者研究表明在苋菜(Amaranthus
tricolor)的叶、茎、根、花等主要组织中 BADH含量不
受盐胁迫影响［19］。但是由于缺乏系统的比较研究，
目前还是普遍认为 BADH受盐胁迫诱导并参与植物
的盐胁迫响应过程［1］。本文研究结果也显示了
BADH受盐和干旱胁迫的诱导表达(图 6、图 7) ，暗
示着其参与了向日葵的盐和干旱胁迫的响应。但是
100mmol /L NaCl浸泡向日葵根系 4h 没有增加叶片
BADH的表达量，表明向日葵具备较高的耐盐特性，
这种胁迫强度不足以影响到茎稍的幼嫩叶片。
除了实时荧光定量 PCＲ以外，在转录水平检测
基因表达量还有多种方法，比如传统的 Northern 杂
交、经济简便的半定量 ＲT-PCＲ。但是 Northern杂交
操作繁琐、灵敏度低，半定量 ＲT-PCＲ 结果易受电泳
等多种因素影响。因此实时荧光定量 PCＲ 检测技
术以其特异性强、敏感性高的优点，迅速成为目前最
灵敏、最准确的基因表达量检测技术。由于核酸染
料 SYBＲ Green I 能非特异性地掺入到所有双链
DNA中，激发后发出荧光，因此它不能区分非特异
扩增。所以为了充分发挥定量 PCＲ的优点，消除非
37
作物杂志 Crops 2013. 5
特异性扩增的影响，必须对定量 PCＲ体系和反应条
件进行优化。又由于 ＲNA抽提效率不同、反转录效
率不同、扩增效率不同，因此目的基因无法直接比
较，需要内参基因来校正目的基因的表达量。本研
究中的内参基因选择了在植物中最稳定表达的
eEF1A基因［20］，本文建立的定量 PCＲ 检测方法可
靠有效，已经达到了优化的目的。
参考文献
［1］Fitzgerald T L，Waters D L，Henry Ｒ J． Betaine aldehyde dehydrogen-
ase in plants． Plant Biology，2009，11(2) :119 － 130．
［2］Ｒhodes D，Hanson A D． Quaternary ammonium and tertiary sulfonium
compounds in higher plants． Annual Ｒeview of Plant Physiology and
Plant Molecular Biology，1993，44(1) :357 － 384．
［3］Pan S M，Moreau Ｒ A，Yu C，et al． Betaine accumulation and betaine-
aldehyde dehydrogenase in spinach leaves． Plant Physiology，1981，67
(6) :1105 － 1108．
［4］Weretilnyk E A，Hanson A D． Molecular cloning of a plant betaine-al-
dehyde dehydrogenase，an enzyme implicated in adaptation to salinity
and drought． Proc Natl Acad Sci U S A，1990，87(7) :2745 － 2749．
［5］聂惠，于海峰，刘浩明． 向日葵对盐胁迫的反应及其抗盐机理的
研究进展．内蒙古农业科技，2008(6) :17 － 19．
［6］易乐飞，王萍，孟鹏．向日葵甜菜碱醛脱氢酶的电子克隆与分析．
作物杂志，2007(6) :45 － 47．
［7］易乐飞，王萍，周向红． 向日葵 BADH 基因部分序列的克隆与分
析．安徽农业科学，2008，36(32) :14003 － 14004．
［8］王萍，赵欢，易乐飞，等．三个向日葵品种在培养基中的耐盐性鉴
定．作物杂志，2008(6) :19 － 21．
［9］周向红，易乐飞，王萍．桑椹总 ＲNA抽提方法的比较．食品科学，
2011，32(12) :209 － 212．
［10］Altschul S F，Madden T L，Schaffer A A，et al． Gapped BLAST and
PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs．
Nucleic Acids Ｒesearch，1997，25(17) :3389 － 3402．
［11］Ｒuijter J M，Ｒamakers C，Hoogaars W M H，et al． Amplification effi-
ciency:linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCＲ
data． Nucleic Acids Ｒesearch，2009，37(6) :e45．
［12］Pfaffl M W． A new mathematical model for relative quantification in
real-time ＲT-PCＲ． Nucleic Acids Ｒesearch，2001，29(9) :e45．
［13］Ｒamakers C，Ｒuijter J M，Deprez Ｒ H，et al． Assumption-free analy-
sis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCＲ)data．
Neuroscience Letters，2003，339(1) :62 － 66．
［14］Schefe J H，Lehmann K E，Buschmann I Ｒ，et al． Quantitative real-
time ＲT-PCＲ data analysis:current concepts and the novel“gene
expressions CT difference”formula． Journal of Molecular Medicine，
2006，84(11) :901 － 910．
［15］Tong Z，Gao Z，Wang F，et al． Selection of reliable reference genes
for gene expression studies in peach using real-time PCＲ． BMC Mo-
lecular Biology，2009，10:71．
［16］Cordoba E M，Die J V，Gonzalez-Verdejo C I，et al． Selection of ref-
erence genes in Hedysarum coronarium under various stresses and
stages of development． Analytical Biochemistry，2011，409 (2) :
236 － 243．
［17］Weigel P，Weretilnyk E A，Hanson A D． Betaine aldehyde oxidation
by spinach chloroplasts． Plant Physiology，1986，82(3) :753 － 759．
［18］Fitzgerald T L，Waters D L E，Henry Ｒ J． The effect of salt on beta-
ine aldehyde dehydrogenase transcript levels and 2-acetyl-1-pyrro-
line concentration in fragrant and non-fragrant rice (Oryza sativa)．
Plant Science，2008，175(4) :539 － 546．
［19］Wang Y M，Meng Y L，Nii N． Changes in glycine betaine and related
enzyme contents in Amaranthus tricolor under salt stress． Journal of
Plant Physiology and Molecular Biology，2004，30(5) :496 － 502．
［20］Nicot N，Hausman J F，Hoffmann L，et al． Housekeeping gene selec-
tion for real-time ＲT-PCＲ normalization in potato during biotic and
abiotic stress． Journal of Experimental Botany，2005，56(421) :
2907 － 2914．
Development and Application of a Ｒeal-time
ＲT-PCＲ Approach for Quantification of BADH
gene Expression in Helianthus annuus
Yi Lefei，Zhou Kefeng，Wang Ping
(School of Marine Science ＆ Technology，HuaiHai Institute of Technology，Lianyungang 222005，Jiangsu，China)
Abstract Sunflower (Helianthus annuus)possesses the ability to tolerate salt and drought stress，although it is not
a halophyte． BADH (betaine aldehyde dehydrogenase)gene is one of the most important stress-resistant genes in
plant． Detecting BADH gene expression is useful for researchers to characterize the stress-resistant mechanism of
sunflower． Ｒeal-time quantitative PCＲ assay conditions should be properly evaluated before detecting BADH gene
expression． So the aim of this study was to develop a real-time PCＲ approach to detect BADH gene expression in
sunflower． A real-time PCＲ approach for quantification of BADH gene expression was developed with eEF1A(eu-
karyotic translation elongation factor 1A)as reference gene，using SYBＲ Green I． All amplification curves were S-
shaped with three phases:flat baseline，exponential amplification phase and plateau． All melting curves showed only
a single peak． The amplification efficiencies of BADH and eEF1A were 1． 90 and 1． 96 respectively． The average
variation coefficients of Cq value were 0． 51%和 0． 65% respectively． The developed approach had advantage of
specific，accurate and reproducible． The mＲNA expression levels of BADH gene in sunflower were preliminarily de-
tected using the approach． The result showed salt and drought stress induced the expression of BADH gene in leaf．
Key words Helianthus annuus;Betaine aldehyde dehydrogenase;BADH;Ｒeal-time PCＲ;Salt stress;Drought
stress (责任编辑:郭子锋)
47
作物杂志 Crops2013. 5