全 文 ：第二十一卷第三期
V勺1. 2 1 N d . 3
内蒙古大学学报 (自然科学版 )
人口. 5 汤阴它aj ur m 协扣 r目 u m U川 v . l t a t匕 nI rar m . 明叨口 。
l牙9 0年 7 月
J吐。 1的 0
裸燕麦永红 4 92 栽培种 ( A~ 撇勿 vc
·
y o n g h o n g 理9 2 )的体细胞胚胎发生
杨 平 李天然
(生物系 )
摘 要 以裸燕麦永红 ` 92 栽培种的三个发育时期的茎尖为外植体 ,研究发育时期 、基本培养
基组成 (Ms , B S , N 6) 、 激素 、 肌醇 、 含氮化合物及渗透势对体细胞胚胎发生及小植株分化的影
响 . 发现营养生长锥时期是体细胞胚胎发生最好的实验材料 , 2 , 4一。 是诱导愈伤组织必不可少
的因素 , 6一 B A 对体细胞胚胎发生没什么形响 .往培养荃中加入适 t 的肌醉和含氮化合物以及
适当地降低培养基的渗透势均有利于体细胞胚胎发生及小植株形成 . 在液体培养中 . 发现培养
基中含有 2 . 4一D 比无 2 . 4一 D 更有利于胚状体发生
关键词 裸燕麦 .茎尖 , 2 , 4一D ,体细胞胚胎发生
前言
对于单子叶植物 , 人们一直认为很难通过组织培养获得小植株 , 尤其是几类有经济价值的禾谷
类植物 . 70 年代以后 ,人们才通过组织培养诱导大多数禾本科植物产生小植株 ,并且多数是经过
体细胞胚胎发生方式 . 比如高梁 (腼咖 Jo 6必以切 . )的幼花序〔 ,。 ,粟 (占必” 沁 必以众翔 )的幼花序`川 ,黑麦 (-eS
(习如 二印之` )的幼胚 cl2 , ;小麦 (? r “~ 口么时~ L
.
) 的萌发种子和幼胚 〔 ,` , ;水稻 (份卿 刚。 L . ) 的幼花
序 ` 2, ;大麦 (刀厉由姗 乞心尹仑 L . )的幼苗〔 , , ,和稗草 (肠娜留扫公 夕如加~
M u n r o e x H o k F
.
)的幼花序`” ,
等等 . 因此 , 有些研究者〔邓 ,山认为体细胞胚胎发生在禾本科植物的组织培养中普遍存在 ,
通过体细胞胚胎发生的方式获得再分化植株具有长期保持再分化能力的潜力〔2习 , 而且一般认
为胚状体为单细胞起源的 ,有利于用作离体筛选突变体的研究与遗传分析 ,人工种子的产生以及作
为原生质体培养的可靠来源等 .
裸燕麦又名筱麦是粮草兼用的禾谷类作物 ,它是我国西北 、 华北特别是内蒙古西部农村的主要
粮食作物和饲料之一 ,如果我们能在一些常规的育种基础上 ,通过组织培养技术 , 在细胞水平上进
行诱变和选择 ,或者通过遗传工程方法在引入外源的遗传物质基础上 ,以体细胞胚胎发生方式选择
新类型的个体 , 为育种开辟新途径 . 通过胚状体进行人工种子的试制 ,对于大量增殖具有优 良种性
的植物 ,节省生产用种籽是十分重要的 ,而筱麦体细胞胚的形成 ,为进一步研究制作禾本科植物的
人工种子提供了有利的塞础 .
据文献记载 , 有人做了燕麦 (A ~ 及“如 )的幼胚 c14 〕 , 顶端分生组织cls ,
、成熟的胚〔川以及筱麦
( A~ 翻白 )的萌发种子胚和新生胚根的组织培养 ,但都是通过器宫发生方式产生植株的
. 本文用
裸燕麦的不同发育时期的茎尖进行组织培养 , 至今国内外尚未见报道 ·
,
1 材料与方法
实验材料 : 在实验室内 ,将裸燕麦种子播种到花盆里 ,待小苗长到一定时期取材 . 本实验选用
收稿日期 : 1 9 8 9一 0 8一 14
内 象 古 大 学 学 报 1 9 9 0 年
了三个不同发育时期的茎尖 : 第 I 期— 植株具有 3 ~ 月片叶子 , 刚刚拔节 , 生长锥刚开始拉长 ,但尚无称原基的分化 , 长度为 0 . 1 7m m 左右 (图 1) .第 I 期一植株具 5一 6 片叶子 ,拔 2~ 4 个节 , 小穗
原基开始分化 , 长度为 0 . 51 一 1 . 3 6 m m (图 2 ) .第 , 期一植株具 7一 8片叶子 ,拔 6一 7 个节 ,小穗已
形成 ,长度为 3一 16m (图 3 )
图 1 第一期的生长锥
曰` 1 G or 叻 n g t i P
图 2 第二期的幼稼
F堪. 2 P r im o曲 a of
图 3 第三期的幼德
R S
.
3 S P止 e le t o f A v o an n u血
of A代皿 n仪场 sP i比佃
培养基 : 基本培养基为 N 。 , B。 , .M , 三种 ,根据实验目的加入不同浓度的植物生长调节物质和
其它化学物质 , PH S . 8~ 6 . 0 , 固体培养基中加 0 . 75 %琼脂 ,最后在 1 . 2 ~ 1 . s k g / 〔c m 〕艺 下热压消毒
2 0分钟 .
固体胚胎发生的培养 :将供试植株的大部分茎叶去掉 ,只留下具茎尖的部分 , 用流水冲洗 hl 左
右 , 然后 ,在超净台上用加一滴 T w e n8 0 的 0 . 1%的升汞 (H g a Z )溶液浸泡 10 分钟 , 用无菌水漂洗 4
~ 5 次 ,然后 , 在双筒解剖镜下 , 用解剖针剥出茎尖接种到愈伤组织诱导培养基中 ,在 25 一 28 ℃下暗
处培养 , l 个月时 , 测愈伤组织鲜重 ,并将愈伤组织转移到分化培养基中 (见表 2 ,表 3 ) , 1 0 OL联 连
续光照 , 25 ~ 28 ℃下培养 ,一个月继代一次 . 待小植株长成后 ,统计小植株数 .
液体胚胎发生的培养 ,将在固体培养基 N 。 中 (附加 Zm g / L Z , 4一 D , 10 0m g / L 肌醇和 50 Om g / L 水
解酪蛋白 ) ,诱导出的愈伤组织打碎后 , 分别转入含有 5 0m l 的 sM D . (不含有任何植物生长物质 , 附
加 5 0 0m g / L 水解酪蛋白 ) 、 MS D : (附加 l m 8 / L Z , 4一 D , 5 0 0m g / L 水解酪蛋白 )和 M s D , o (附加 l m g / L
2
,
4
一
0
、
50 Omg / L 水解酪蛋 白和 10 m0 s/ L 谷 氮酞胺 )液体培养基 的 巧Oml 三角瓶中 , 在 13 0 ~
1 5 0r p m , 24 ℃士 1条件下振荡培养 ,每周转接一次培养一个月时 ,统计胚状体及小植株数 ·
(注 :每种测定均重复二次以上 ,每次取 16 ~ 24 茎尖 )
2 观察与结果
2
.
1 培养基对体细胞胚胎发生的影响
将第 I 期的茎尖接种到附加有 2 , 4一 D Zm g L/ , 肌醉 10 m盯L 及水解酪蛋白 5 0 0m盯 L 的 N . 、 sB
和 M S 三种培养基中 , 28 ℃黑暗条件下培养 , l 周后开始在伤口处长出愈伤组织 ,诱导率达 90 环以
第三期 杨 平 李天然 裸燕麦水红 492 栽培种 (南~ 汕 vc . yo ng 腼 9 4 9 2) 的体细胞胚胎发生
上 . 1个月时 ,测定愈伤组织鲜重 , 统计细胞数 . 并将愈伤组织转到上述三种培养基中进行分化培
养 , 5 个月时统计小植株数目 , 统计结果见表 l
表 1 裸燕麦茎尖在三种培并荃中愈伤组织的鲜 , ,细胞数目的增长及小植株的形成
aT b l
e 1 I n c比” 叻 I心 h we 吵 t a “ 沈u n u m比 of ca u ~ . n d p la n . xe t I o m a t lo n ol 脚川鸿 it , f r o m A倪 n a ” u d a ,
门 l t u r ed In 妞h r倪 d lf f e比 n吐m ed la
基本培养荃 愈伤组织鲜重 ( m g鲜 细胞数目 小植株数
么肠 IC m ed i u m 重 /每个外植体 ) (个 /每克鲜重 ) (株 /每个外植体 )
F r es h 锐 i助 t of 。目I此 Q U un m be r eC山 /卿 吻m加 r o f P恤 n t l e at
哪 /讲 r ex p认 nt g r a m o f f r . wt . p纽 n st /钾 r ex p恤 n 七
N - 18 0
。
6 3
.
7 6 3 X 1 0 . 6
。
0
B 5 18 9
.
5 3
.
8 7 9 X 1 0。 3
.
4
M日 1 8 3 . 2 4 . 7 8 3 X 1 0 . 7 . 4
结果表明 , 三种基本培养基对愈伤组织鲜重增长的影响上没什么 区别 ,而每克鲜重愈伤组织内的细
胞数 目的增长 , M s 培养基和 N 。 和 B S 培养明显不同 ,而在小植株的形成上 M S 培养基也明显优于
N 6和 sB .
2
.
2 不同类型的激素组合及浓度对体细胞胚胎发生的影响
2
.
2
.
1 愈伤组织的诱导 :将第 I 期的茎尖接种到不同浓度的 2 , 4一D ,并附加肌醇 1 0 Om g L/ ,水解酪
蛋白 SO0 m叮 L 的 N 。 培养基 , 培养 l 周后 , 在切中处产生 肉眼可见的愈伤组织 , l 个月时 , 除了含
2
, 刁一 D 为 0 , 0 . 0 5 、 0 . 1 、 0 . s m s / L 的培养基外 , 其它培养中均长出愈伤组织 ,在含 2 , 4一 D 10 m g / L 的培
养基中 ,愈伤组织的诱导率达 90 %以上 ,而含 2 , 4一 D 12 ~ ZOm s/ L 的培养基中 , 愈伤组织的诱导率很
低 . 实验证明 , 2 , 4一 D 是诱导愈伤组织必不可少的因素 , 并且在 l ~ 10m g L/ 浓度范围内效果较好 ,
在 10 ~ 2 0m刁 L 浓度范围内效果较差 . 图 4 是培养 1个月时测定的结果 . 在 2 , 4一D 为 Zm s/ L 时 ,愈
伤组织生长最快 .
图 峨 2 , 月一 D 又寸愈伤组织鲜重的影响
横坐标 : 2 , 一 o m g / L
纵坐标 :鲜重 mg /外植体
iF s
.
4 曰 r ec t o f Z , 4一 n i n m创五a o n r r es h we ihg t of 。红il o e m g / e x p扭 n t
A加笑 lsa in id aC est Z
,
4
一
0 m g / L
o r id n a r e i n id ca 佃 ft es h w e ig h t o f ca Uus
了’一一 2 4 6 8 10
2
.
2
。
2 胚状体及小植株的诱导 ,培养 1个月后 ,将在 N . 培养基里诱导出的愈伤组织分别转到分化
内 策 古 大 学 学 报 19 9 0年
培养基中 (表 2,表 3 ) , 1 0 0uL x 连续光照下培养 , 1个月后观察 ,发现愈伤组织可分为两种类型 : 一
种是黄白色的 ,坚实的 , 紧密的 ,不透明的有皱褶的胚性愈伤组织 , 另一种是黄色的 , 琉松的 ,半透明
的胚性愈伤组织 . 在双简解剖镜下或用手持扩大镜可以看到胚性愈伤组织表面有很多胚状体产
生 , 接着出现绿点 ,进而发育成小植株 , 多是丛生的绿色的小苗 (图版 2 ) , 只见到 1株白化苗 . 待再
生小植株长到 8一 1 3c m 高时 ,移栽到土壤里 ,大多数能成活 , 并且开花结籽 (图版 3) . 此外 ,发砚 6
一BA 的加入对胚状体的产生没什么影响 , 图 5 是培养五个月时统计的结果 .
表 2 分化培养墓配方 ` 表 3 分化培养基配方
T a b le Z C七怂 it t u e n t o f m叨 iu m T a b化 3 C o sn t i t u en t of m创五u幻.
fo r e e l id 住 e r e n t ia ti o n fo r “ 1 id f f e er n t ia it o n
基本培养基 2 , 4一 D ( m g / L ) I A A ( m g / L )
习泊 3让 m e d iU m 2 , 4一 D m吕/ L 1^ ^ m g / L
M S O l
2 1
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2
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荃本培养爹 2 , 4一D ( m g L/ ) 】人人 ( m g L/ )
加 3沁 m目 i u m 2 . 4一 D m g / L I人人 m吕/ L
M S 0 2
0
。
5
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2
4
6
· 附加 : 5 0 0m吕/ L ( c H . ) 3 %掂 . 0 . 7 5%琼脂 . 附加 ` 5 0嘛` / L c H , 3%据及 0 . 7 5%琼脂
.
uS lP
o m e n t目 iw t h S O0 m g / L C H , 3% s u e r僻 , 0 . 7 5% a助 , .
O 2 6 8 1 0
图 5 2 , 4一 D 对再生小植株诱导的影响
横坐标 : 2 , 4一D (m : / L )
纵坐标 :小植株数 (株 /每块愈切组织 )
F逗 5 hT e in fl u o n c of Z , 4一 D o n idn u ct 沁 n o f 少 n业 t
A饭沁 is a jn 山aC est Z , 4一D m g / L
O idr an et in id ca t“ ht e n u m比 r Of p画 iet st ( P la n妞 /口 u us )
从图 5 可以看出 ,以 2 , 4一 D 为 2~ 4 m g / L 时的诱导效果最好 .
2
.
3 肌醉对体细胞胚胎发生的影响
2
.
3
.
1 愈伤组织的诱导 : 将第 I 期的茎尖接种到附加不同浓度肌醇 ( O , 50 , 1 0。 , 2 0Om盯)L 50 0m g / L
水解酪蛋白及 Zm s/ L Z , 4一 D 的 N . 培养基中培养 . 1周后 ,在切 口处有愈伤组织产生 , 各种培养基的
愈伤组织的诱导率有很大差别 , 图 6 是培养 40 天时愈伤组织的诱导率及其鲜重 . 结果表明 , 愈伤
组织的诱导率及鲜重均在 1 0 m s/ L 肌醇时达到高峰 .
第三期 杨 平 李天然 裸燕麦水红 492 栽培种 (A ~ 地 vc . y on g bo n s J 9 2) 的体细胞胚胎发生
5 0 10 0 1 5 0 20 0
图 6 肌醉对愈伤组织的诱导率及其鲜重的影响
横坐标 :肌醇的浓度 (毗 / )L
左纵坐标 :愈伤组织诱导率 ( % )
右纵坐标 :鲜重 ( ngI /外植体 )
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.
6 hT
e i时 l业n , o f m” 一 i n os i ot z o n i n d u ct io n a n d f r留 h w e ihg t成 ca u us
A性沈 i SS a In dj C扭 t es CO n倪 n t r s柱O n O f主n “ i tol
助 r t o r山 n a t e in id ca t` i n dcut io n r a t io of aC山 (% )
侧 hg t o r山 n a t o i n d iaC t es f res h w e吵 t m g /e x Pal n t
2
.
3
.
2 胚状体及小植株的诱导 : 在上述培养基中分化培养 l 个月后 , 在含有四 种浓度的肌醇培养
塞中均有胚状体产生 , 但产生的数量不同 , 含 1 0 m s/ L 肌醇的培养基中产生的胚状体最多 , 含 50
和 20 0m g / L 肌醇的培养基中的胚状体较少 ,不含肌醇的培养基中的胚状体最少 . 形成小植株数有
类似的结果 . 图 7 是培养 4个月时统计的结果 . 向培养基中加入适量的肌醇可以促进体细胞胚胎
发生及小植株的形成 .
图 7 肌醇对诱导小植株的影响
横坐标 :肌醇 ( m g/ )L
纵坐标 :再生植株数 (株 /愈伤组织 )
F运 7 hT e ifn lu e n ce o f m y o 一 in os i tOl o n f o r m a t lo n o f p la n t一e t
A比c 臼劝 i n id ca tes i n o is olt ( m g / L )
o idr an t
o
in id ca r铭 ht e n u m be r of r e , n er a det P扭 n t lo st (幽 n t le st /ca l us
5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0
2
.
4 水解酪蛋白对体细胞胚胎发生的影响
2
.
4
.
1 愈伤组织的诱导 : 将第 I 期的茎尖接种到附加有不同浓度水解酪蛋白 (0 , 2 5 0 , 5 0 0 ,
7 5 o m g / L )
, 10 o m g / L 肌醉和 2 , 4一 n Zm s / L 的 N 。 培养基中 , 培养方法同上 . 培养 1个月时 ,统计愈伤
组织的诱导率并测定其鲜重 .
从图 8 上可以看出 ,在含 50 0一 75 0m g / L 水解酪蛋白的培养基中 , 愈伤组织的诱导率较高 ,而
在含 25 。一 50 0m s/ L 水解蛋白的培养基中 ,愈伤组织生长得较快 .
内 象 古 大 学 学 报 1 9 9 0年
0 25 0 5 0 0 7 5 0
图 s cH 对愈伤组织的诱导率及鲜重的影响
横坐标 :以 的浓度 (毗 / )L
左纵坐标 : 愈伤组织的诱导率 ( % )
右纵坐标 : 鲜重 ( gnI /外植体 )
lF g
.
8 T b
e 讨 lu e n倪 o f 。 ” e in h y dr o ly sa 忱 o n idn cu ti v iyt an d f ser h we i曲 t fO aC U su
A卜犯」sa In id ca tse 伪 n ce n t r a t主o n o f C H ( fn g / L )
址 f t o r山 an t e 加 id ca tse in d u ct i on r a t io of ca l l su (纬 )
几hg t o r dj n a t e in id ca 姗 f r o h w .切办 t ( m g / e x p协n t )
2
.
4
.
2 小植株的诱导 : 将上述的愈伤组织转接到附加不同浓度水解酪蛋白 ( 0 , 25 0 , 50 0 , 7 50 m s/ )L
及 Zm s/ L Z , 4一 D 的 sM 培养基中 ,进行分化培养 , 1个月后 ,虽然在四种培养基中均有胚状体产生 ,
但是在数量上是有差别的 ,在含 50 Om g L/ 水解酪蛋白的培养基中产生的胚状体最多 ,含 2 5 Om g / L
和 7 5 0 m g / L 水解酪蛋白的次之 ,不含水解酪蛋白的最少 . 图 9 是培养 刁个月时小植株形成的统计
结果 . }
1 4
1 O
图 g cH 对再生小植株诱导的影响
横坐标 : cH (mg / )L
纵坐标 :小植株数 (株 /愈伤组织 )
日9 . 9 hT e 访 f lu e n ce o f C H o n P运 n t le t in d u ct io n
A卜沁王“ 进 i n id ca tes C H (m s / L )
o r id n a r e i n d液 tes t恤 n u m比 r o f laP n t le st ( lP a n Ue t /。 U us )
·八/
0 2 5 0 5 0 0 7 5 0 邝 ( m ` / L )
2
.
5 培养基的渗透势对体细胞胚胎发生的影响
将从附加 Zm s/ L Z , 4一 D 、 l o o m s/ L 肌醇及 50 om s/ L 水解酪蛋白的 N . 培养基中诱导的愈伤组织
转接到附加不同浓度蔗搪 (3 % 、 6% 、 9% 、 12 % ) 、 Zm g / L Z , 4一 D 及 5 0 m g / L 水解酪蛋白的 M s 培养
基中进行分化培养 . 1个月后 ,在四种培养基中均有胚状体产生 ,并且在含蔗糖 6~ 9%的培养基中
产生的胚状体较多 . 大约在 40 天时 , 愈伤组织表面有很多绿点产生 ,进而发育成小植株 . 由图 10
在培养 4个月时的统计结果说明 ,蔗搪浓度在 6一 9%范围内有利于小植株的产生 .
图 10 蔗褚对分化的影响
横坐标 :蔗掩浓度 (% )
左纵坐标 :分化率 (% )
右纵坐标 :小植株数 (株 /外植体)
曰9 . 1O T扯 王时生鹅姗 of s u c了。 s e o o n份 n tr a如 n on 戊 l d让f cr o iat t io n
A卜茸 iS a In d jaC est sucr 以 。。 n ` 吧 nt ar it o n ( % )
以 n o r id an re 加山口七 d i“ 。 ern it a如 n ar U o ( % )
斑劝 t o r id n a t e In dJ aC tes het n uzn 吮 r o f p场 n业 st ( p加旧妞 /“ p恤n r )
.
0 3
第三期 杨 平 李天然 裸燕麦永红 ` , 2栽培种 (人翻 . 侧如 v.c y o n` 七加 8 ` 9 2) 的体细胞胚胎发生 4 21
2
.
6 外植体的发育时期对体细胞胚胎发生的影响
2
.
6
,
l 愈伤组织的诱导 : 与第 I 期的茎尖培养方法一样 ,将第 I 、 , 期的茎尖接种到附加不同浓度
2
,
4一 D 的 N 。 培养基中进行培养 ,二周后 ,在切 口处产生愈伤组织 ,各种培养基中的愈伤组织的诱导
率差别很大 , (图 11) . 在愈伤组织生长上 ,第 I 期的比第 I 、 , 期的生长得快 (图 1 2) . 同时还发现 ,
随着茎尖发育过程的进行 ,获得最高的愈伤组织的诱导率及其最大的生长 ,所需的 2 , 峨一 D 浓度较
高 .
, ” 0
1了一一一。
,ù、协/
.
,l卜=1”“.60拍2Q
8 1 2 1 6 2 0
2
, 4一 D ( m s / L )
图 1 2 . 4 一 0 对愈伤组织诱导率的影响 [ :一△一 图 1 2 2, 4一 D对愈伤组织鲜重的影响
I :一 O一 , :一口一 I :一△一 I :一 O一 皿 : 一口 -
横坐标 : 2 , 4一 。 (m g / L ) 横坐标 : 2 . 4一 n (m g / L )
纵坐标 : 愈伤组织诱导率 ( % ) 纵坐标 : 鲜重 ( mg /外植体 )
iF s 1 I hT
巴 i吐 l u e n ce of Z , 4 一 D co n优 n t r a t io n o n i n d u吮v i ty R g 1 2 T b O i n f lu e n沈 o f Z , 4 一 D co n “ n t r a t io n o n f r es h
of ca ll us w ie gb t 诚 ca l us
I
: 一△一 , :一 O一 l :一口一 I :一△一 l :一 O一 皿 :一口一
A咏 i哪 in id ca tes Z , 4一 D ( m g / L ) A比幼义旧 in id ca *es Z , 4一 D ( m s /L ,
o r d l n a et i n d iaC tes in d u川 o n r a t io o f ca l u s ( % ) o r id n a 宜。 i n d ica tes f r es h w e吵 t (m g /ex 幽 n t )
2
.
6
.
2 胚状体及小植株的诱导 : 将上述的愈伤组织转接到分化培养基中 (表 3) 进行分化培养 · 培
养 l 个月后 , 三个发育时期的愈伤织织均有胚状体产生 ,继续发育形成小植株 . 图 13 是培养了 5
个月时统计的结果 . 三个发育时期的茎尖产生小植株的能力有很大差别 , 第 I 期的茎尖分化小植
株的能力最强 , 第 l 期的次之 , 第 皿期的最差 ,表 4所列数据表明 , 三个发育时期的茎尖培养 ,都是
2
,
d
一
D 与认人 以 2 : 1 配合使用时诱导再生植株效果最佳 ,但在不加 认A 的情况下 , 第 I 期以 2 , d一D
为 Zm郎 L 的诱导效果最好 , 第 兀期以 2 . 4一 D 为 l ~ 4 m s/ L 范围内诱导效果较好 ,第 厄期以 2 , 4一 D
为 6一 s m g / L 范围内效果好 . 可见 ,随着茎尖发育时期的变化 ,产生最多的小植株所需 2 , 4一 D 浓度
也有愈来愈高的趋势
42 2 内 象 古 大 掌 学 报 19 9 0 年
衰 4 外植体发育时期对诱导再生植株的影响 .
T曲 le 4 升e e l f ec l of d e v e】o Pm en `目 户 . “ 成 .x 内 n 心. 口叼 u tC加 n ot 民侧勿 er 川目咖 n Ue妞
不同发育期外植体诱导小植株数
R e g e n o rt t川 内 n t狱 刃川 u伪 d 闭
d任幻甘幼 t .d v公叩me n以 户峨 吐 “ 睡阴 t
2
,
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0 0 2
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0
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0
总的小植株数 12 7 . 0 3 5 . 7 1 9 . 9
OT
r a l 皿m比 r of pal n 宝以
第 1 . 1 、 I 发育时期见图 1 . 2 . 3
反 e Fi g l , 2 . 3
2 5
图 1 3 . 2 , `一 0 对再生小植株诱导的影响
I
: 一书一 1 .一△一 ,一 。一
横坐标 . 2 , 4一 。 ( m创 L )
纵坐标 : 小植株效 (株 /愈伤级织 )
F场 1 3 1七。 加 f l u e cen of Z , 4一 D 咖 oe n rar r沁 n 如 场 du ct i佣 of p妞 n t l e t
I : 一笼一 . .一△一 : - 。一
A肠沈加. 如山口 .et 2 , 4一 D (哪 / L )
C助山 , 肠 如山 , t.e ht o n u m比若比 内 nt 场 . ( p加 n t le t /。 目】此 )
于首需葱八舞、教络诗咨给睡)
2
.
7 液体培养中的体细胞胚胎发生
将在 N . 培养基附加 Zm g L/ 2 , `一 D , 1 0 m 8 L/ 肌醉 , 50 Om口 L 水解酪蛋白中培养出的愈伤组织
第三期 杨 平 李天然 裸燕麦永红 4蛇栽培种 (翔抢湘 . 白 vc . yo ng bo 咫 ` 9 2 )的体细胞胚胎发生 423
转到三种液体培养基中 (见材料与方法 ) ,进行振荡培养 . 通过压片观察 ,发现培养 l 周后 ,三种培
养基中的细胞多为体积小 ,细胞核大 、细胞质浓的具小液泡的胚性细胞 ; 2 周后 ,在 M S D : 培养基中
出现球形胚 (图版 5) ,相继在 M S D。 与 M SDI G 中也出现少量球形胚 ; 3周后 ,三种培养基中已有很
多球形胚产生 (图版 4 ) 、 肾形胚也出现了 (图版 1 ) 月周后 ,三种培养基中均有小植株产生 (图版 6 ) ,
表 5 列举了培养 4周时统计结果 .
从表 5 可以看出 ,不含任何激素的培养基对于诱导小植株有利 ,含 2 , 4一 D l m g .I/ 的培养基有利
于产生胚状体 , 当 2 , 4一 D ( l m s/ )L 与 1 0 m g / L 谷氨酞胺混合使用时 ,诱导产生的胚状体较少 , 但对
小植株的形成可能有一些促进作用 .
表 5 28 天时各处理的体细胞胚及小植株数
aT ble 5 N um 比 r o f ` O们。 a t iC e m b yr o dsj a耐 p la n t l e st i n d if fe r e n t m侧五a o n 2 8 血邓 a f t e r e X P纽 n at t i o n
培养基 胚状体数 (个 /克鲜重 ) 成小植株数 (株 /克鲜重 ) 成株%
M曰」U m Em b r y o i山 n u m加 r / 9 f r . wt . P场 n 官一e t n u m比 r / 9 fr . wt . eP r c e n t a 8 0 f0
p la n t城 i n d u e t i o n
M s D o 16 5 6 3
.
6%
M , D - 2 7 3 3 1
.
1%
加臼 D一G 9 2 2 2 . 2%
3 讨论
3
.
1 关于基本培养基对愈伤组织及体细胞胚胎发生的影响
实验证明 , 三种基本培养基对于愈伤组织鲜重的影响没什么区别 ,而每克鲜重愈伤组织的细胞
数差别很大 , M s 培养基中的细胞数比 N 。 与 B 。 培养基的多 ,在 M s 培养基中诱导 出的愈伤组织的
细胞体积 比 N 。 和 B。 培养基的小 在诱导胚状体及再生植株方面 , M S 培养基优于 B。 和 N 。 两种培
养基 ,这说明细胞体积变小 , 细胞质浓度加大是体细胞胚胎发生的前提 , 我们对三种培养基氮源的
组成及含量作了比较 (表 6) 发现无论从总氮量及钱态氮的含量上 , B : 和 N 。 两种培养基均远 比 M S
培养基低 ,高的氮源含量特别是铁态氮的高含量对于裸燕麦体细胞胚胎发生及发育可能是有利的 .
很多研 究者认为对体细胞胚胎发生最有影响的无机盐是含氮化合物 , 还原态氮是很重要的 〔7 , , 我
们的实验结果支持了上述观点 .
表 6 三种培并荃中总氮l ,按态氮 ,硝态氮含里
T a悦 e 6 C o n沈川 r a t五o n of 吸。玄a l N 。 n l tar 它e a n d a m m o n iu m In d if f e er n右 t卜r e m de 盆.
培养基 总 N 量 钱态 N 硝态 N 按态 N /硝态 N
m目 j Um t o t a l N 口叉 n r n o n iU m in t t a t o a m们。旧 u m / in t r a玄.
M S 8 4 1 5 7 8 2 6 3 2
.
29 / 1
氏 7 0 2 8 42 l / 1 . 5
城 47 0 9 8 3 9 2 l / 4
3
.
2 激素对体细胞胚胎发生的影响
我们的实验结果表明 , 2 , 4一 D 是诱导裸燕麦茎尖愈伤组织必需的因素 ,许多人也认为从外植体
诱导愈伤组织 ,使它获得胚胎状态 , 2 , 4一 D 是必需的〔 , ,川 . 一般认为诱导禾本科植物的胚性愈伤组
织最好的生长素是低浓度的 2 , ` 一 D ( 0 . 4~ 1 . 7 m s / L ` , ’ · ’ o· 2 ` , . L u e t a一 (一9 5 2 ) ( , . ,认为较高浓度的 2 , 4-
内 象 占 大 学 学 报 1 9 9 0 年
D ( 3
.
5一 4 m盯 L )对胚性愈伤组织的诱导是无效的 . 而在我们实验室中 , 具较高浓度 2 , 4一 D (6 ~
I OgnI
.
/ L )的培养基 ,也诱导出了胚性愈伤组织 , 并诱导出各发育时期的胚状体 , 但在 Zm盯 L Z , 4一 D
的培养基中效果最好 . R en ge l et al ( 198 5) “川的实验结果也与我们的类似 ,在液体培养中也发现 , 2 ,
4一 D 对裸燕麦的胚状体的形成是十分必要的 , 而对其进一步发育不起什么抑制作用 , 为什么裸燕麦
在诱导胚状体上要求的 2 , 4一 D 浓度较高 , 很可能与其 内源激素水平有关 . v iasl l . K ( 198 2 ) 。 ,. 25J 认
为内源生长素似乎是胚状体发育的关键控制因素 . 但 由于我们没有做内源激素的测定 ,所以还不
能给予准确的解释 ,这个问题有待于深入研究 .
在我们的实验中 ,发现细胞分裂素 (6 一BA )对体细胞胚的诱导不起任何作用 ,符合一般禾本科
体细胞胚胎发生规律 .
3
.
3 含氮化合物对体细胞胚胎发生的影响
我们的实验证明 ,培养基中加入 S OOm s/ L 水解酪蛋白能促进裸燕麦体细胞胚胎发生 , 这可能
是由于增加了某些有利的氨基酸来源 ,提供了充足的按态氮 ,有利于体细胞胚胎发生 ,可是在液体
培养中 , 谷氨酞胺的加入并没有促进胚状体的产生 (表 5 ) , 但是 ,它对体细胞胚的成熟和萌发一小
植株的形成可能有一定的促进作用 , 此点有待于进一步研究 .
3
.
4 关于肌醉对于诱导愈伤组织及体细胞胚胎发生的影响
在我们的实验中发现 ,培养基中添加适量的肌醉 ( 1 0 ~ 150 m g / )L 能促进愈伤组织生长及体细
胞胚胎发生和发育 . 有些研究者认为肌醇对诱导体细胞胚胎发生有利〔 , , . 1丈旧m ic R . 5 . et . al 在萝
卜(彻神叨璐 咧~ )培养中 ,发现肌醉加强形成层的活动〔,幻 , 由此可见肌醇促进细胞分裂
.
aS l i
s bur y
,
F
.
B c5) 也认为肌醉本身无活性 ,但它在细胞分裂诱导物充分发挥活性上有增效作用 ,肌醇对愈伤组
织诱导以及胚状体胚胎发生作用的机制 目前还不清楚 ,有待于深入研究 .
3
.
5 关于培养基的渗透势对体细胞胚胎发生的影响
从实验结果得知 ,在含蔗搪 6~ 9%的培养基中 , 体细胞胚胎发生能力较强 、而含 3%与 12 %的
蔗搪浓度的培养基中 ,体细胞胚胎发生能力减弱 . 这说明蔗搪除作为碳源外 , 也降低了培养基的渗
透势 ,而一定高度的渗透势有利于体细胞胚胎发生与发育 ,很多人证明培养基中的 8~ 12 %的蔗糖
含量有利于曼陀罗属 (加如。 ) ,大麦属 (万汾幽叨刀 )和芥属 ( aC 护邵如 )的原胚的培养 〔川 , M au en y ( 1 9 6 1) 和
s m i ht ( 1 9 7 3) 等人认为这与原胚发育于较低渗透势的液体胚囊中的情况十分相似 ,降低渗透势可能
有利于内源 A B A 的产生 〔” ,有证据表明高内源 BA A 会促进体细胞胚胎发生似 , , 张怀璧等 ( 1 9 8 9) 在
胡萝 卜中也得出类似的结果 (61 .
3
.
6 关于外植体的发育时期对愈伤组织及体细胞胚胎发生的影响
实验结果表时 ,无论是愈伤组织的诱导率 、 生长速度还是胚状体及小植株产生的频率 ,都是第
I 期 比第 兀 、 可期高 , 这可能由于外植体的不同发育时期 ,有着不同的生理状态与形态发生规律 ,其
去分化和再分化的能力都会存在一定的差异 ,类似的结果也有报道 .c8 均此外 ,还发现随着外植体发
育时期的进行 ,愈伤组织的诱导及生长对培养基中的 2 , 4一 D 浓度要求越来越高 , 但诱导再生小植株
的能力却愈来愈小 类似的结果陈惠民等〔 ,J 报道过 , 我们认为一方面可能是由于不同发育时期的
茎尖在培养时 ,产生的内源植物生长物质能力不同 ,随着外植体的发育时期的进行 , 产生内源植物
生长物质能力减弱 , 另一方面 , 由于茎尖的进一步分化 , 细胞在生理和形态上均发生变化 ,特化水平
越来越高 ,因而增加了进一步脱分化的阻力 ,这是很值得深入研究的向题 .
第三期 杨 平 李天然 裸燕麦水红 月” 栽培种 (由目日 . 山 vc . yo n , ob gn 召9 2) 的体细胞胚胎发生 4 2 5
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〔 29 〕 X o Z H , a n W a n名 D Y . P肠 n t eC U 取即 r它, . 1 9 3 4 : 3 : 1 4 9~ 15 0
S o m a t ie E m b r y o g e n e s is
Y an g
o f A之笼叭 a n刀而 c v . Y o n g H o n g 4 9 2
P in g L i T ia n r a n
(肠阿。欣耐 oj 刀泌恻 )
S et m t i P o f ht r e e d e v e lo P m e n t a l s at s se w e r e u se d f o r s t u d y o f s o m e f a e t o sr a f f e e t in g t h e so m a ti e e m
-
b r y o朗 n ise s an d P la n t er g en e r a t宜o n . I t w as fo u n d th a t ve ge at t i ve gt o w j n g t lp w as th e be s t xe pe r加 e n t a l m a -
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, 2
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4
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D w as 侧洛 e n t ia l f a e ot r o f i n d u e i n g ca l l u s
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.
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4
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D 宜n th e e u l t u er m e id a er m a kr a b ly P r o m o t ed t h e e m份 y o id fo r m a ti o n .
K e y w o r山 A执 , a . 1习油书s t e m t i P子 2 , 4一D , so m a ti c e m b yr o g e n e s i s
4加 内 , 古 大 学 攀 报 i” O年
1
. 液体培养中的肾形胚 x 68
2
.丛生苗
3
.再生小植株
4
.
5液体培养中的球形胚 x 68
`
6
. 被体培养中的再生小植株
L T’O r侧目 0 em b叮 o油 in il叫 d lC l l tuer
2
.尸巨川 ltC
3
。
P加 n山仗
4
.
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.6 R铭 . n e r a加心 p画也 t
in il q川 d c u ltu r .
on il q川 d。目 t u r .