全 文 ：第 29卷 第 4期
2008年 10月
华南农业大学学报
JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity
Vol.29, No.4
Oct.2008
收稿日期:2007-12-07
作者简介:李拥军(1980—), 男 ,硕士; 通讯作者:谷文祥(1954—), 男 ,教授 , E-mail:wenxgu@scau.edu.cn
基金项目:华南农业大学新学科扶助基金(2003C20504)
薇甘菊化感活性成分的分离与鉴定
李拥军 1, 2 , 陈 实1 , 李春远 1 , 邓思娟 1 , 谷文祥1
(1华南农业大学 理学院 , 广东 广州 510642;2中山市农产品质量监督检验检测中心 , 广东 中山 528403)
摘要:采用生物活性跟踪法 ,对薇甘菊Mikaniamicrantha地上部化感活性成分进行分离 ,鉴定了 3个化合物 ,他们分
别是 α-香树脂醇 、豆甾醇和阿魏酸.对此 3种单体的化感作用活性研究表明:阿魏酸和 α-香树脂醇在 1.00、
0.50和 0.25 mg/mL3种质量浓度下 ,对萝卜 、菜心和水稻 3种受体的抑制作用均达到了显著水平.
关键词:薇甘菊;化感物质;分离与鉴定
中图分类号:S651 文献标识码:A 文章编号:1001-411X(2008)04-0026-05
IsolationandIdentificationofAlelochemicalsfromMikaniamicrantha
LIYong-jun1, 2 , CHENShi1 , LIChun-yuan1 , DENGSi-juan1 , GUWen-xiang1
(1 ColegeofSciences, SouthChinaAgriculturalUniversity, Guangzhou510642, China;
2ZhongshanQualitySupervision＆TestCenterofAgriculturalProducts, Zhongshan528403, China)
Abstract:ThreealelochemicalswereisolatedfromaerialpartsofMikaniamicranthabyrepeatedsilica
gelcolumnchromatographycombinedwithbioasaymethod.Theirstructureswereidentifiedasα-amyrin,
stigmasterolandferulicacidbyspectroscopicanalysis(IR, EI-MS, 1HNMR, 13CNMR).Theα-amyrinand
ferulicacidhadhighlyinhibitoryefectsontheseedlinggrowthofRaphanussativus, Brasicacampestris
andOryzasativaat1 000, 500and250 μg·mL-1 , respectively.
Keywords:Mikaniamicrantha;alelochemicals;isolationandidentification
薇甘菊学名小花假泽兰 Mikaniamicrantha,为菊
科假泽兰属植物 ,近年来成为广东省危害经济作物
和森林植被的主要害草.薇甘菊所到之处 ,本地植物
被其攀缘 、缠绕或覆盖 ,难以进行光合作用 , 可因饥
饿而死 ,或是被重压 、绞杀而死 ,或是薇甘菊通过释
放化感物质将其他植物杀死 ,因而薇甘菊被称为 “植
物杀手 ”, 是最具危害性且繁殖速度很快的恶性杂
草之一 [ 1] .前人对薇甘菊的化感作用研究已经做了
大量的工作 ,证明具有化感活性物质存在 [ 2-6] ,然而
有关薇甘菊化感活性成分分离的报道并不多见.为
了进一步揭示薇甘菊这种外来入侵杂草对其他植物
危害的化学机制 ,综合治理薇甘菊 ,达到变害为利的
目的 ,在生物活性跟踪下 ,对薇甘菊乙醇提取物石油
醚部分中的化感活性成分进行了分离 ,旨在确定薇甘
菊中的主要化感活性物质 ,阐明薇甘菊快速生长蔓延
的生态学机理 ,找出相应可行的方法消除对其他植物
的危害 ,综合开发利用薇甘菊 ,寻找除草剂先导化合
物 ,开发出高效低毒的生物源除草剂等.
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
薇甘菊 Mikaniamicrantha地上部于 2005年 12
月采自深圳市龙岗区华南农业大学生态村 ,自然阴
干 ,粉碎 ,备用.受试植物萝卜 Raphanussativa、菜心
Brassicacampestris种子购于广州市种子公司门市部.
水稻 Oryzasativa种子由华南农业大学农学院提供.
φ=95%乙醇 、磷钼酸 、石油醚 、乙酸乙酯 、二氯
甲烷 、乙醚 、丙酮和羧甲基纤维素钠(CMC)均为市售
分析纯.薄层层析硅胶(GF254)、柱层析硅胶(200 ～
300目)购自青岛海洋化工厂.
1.2 仪器设备
MFB-595显微熔点测定仪 ,温度计未校正.Per-
kin-Elmer-577型红外光谱仪 (KBr).QP5050AGC/
MS色质联用质谱仪 Finnigan-4510型质谱仪.DRX-
400型核磁共振仪.
1.3 试验方法
1.3.1 化感物质的生物活性测定方法 采用 “小杯
滤纸片 ”法测定化感物质的生物活性 [ 7] .将含有化
感物质的溶液 2.5 mL放入杯中 ,待溶剂挥干后 ,加
入 φ=0.1%的土温 -20(助溶作用)水溶液 2.5 mL,
在滤纸上放入刚发芽(露白)的受试植物种子 10粒 ,
室温培养 ,白天温度 26 ～ 30 ℃,夜间 20 ～ 25 ℃.每
处理设 3个重复 ,以清水作对照.培养期间适当补充
水分 , 5d后测量幼苗的苗高和根长.
1.3.2 化感活性成分的分离方法 薇甘菊茎叶干
粉 5 kg,用 φ=95%的乙醇 15 kg在 60℃下温浸 5
次 ,每次 3 d.过滤 ,合并浸提液 , 减压浓缩得浸膏
695g.将浸膏拌少量硅胶 , 1 000 mL石油醚浸提 3
次 ,每次 1.5 h,抽滤 ,滤液合并 ,进行生物活性测定 ,
显示对受试植物幼苗生长具有强烈的抑制作用 ,浓
缩滤液得浸膏 81.5g.将浸膏进行硅胶柱层析(石油
醚 /乙酸乙酯为淋洗剂)得到 A1 、A2 、A3 、A4、A5和 A6
6个组分 ,分别再次进行生物活性测定 ,取其中对受
试植物抑制作用最强的 2个组分(A3和 A5)进一步
柱层析 ,石油醚 -乙酸乙酯梯度洗脱 ,洗脱部分生物
活性测试 ,取对受试植物抑制作用最强的组分再次
分别进行柱层析 ,直至获得单体化合物(图 1).
图 1 薇甘菊化感活性化合物的分离途径
Fig.1 IsolationofallelochemicalsofMikaniamicrantha
1.3.3 数据分析与处理方法 利用化感作用效应
指数(RI)进行活性跟踪[ 8] , RI=1-C/T(T≥C时)
或 RI=T/C-1(T
对值的大小与作用强度一致.按文献 [ 7]方法测定
分离物质对 3种受体植物的化感作用.按下式计算
幼苗的相对苗高和相对根长:
相对苗高(或根长)=处理苗高(或根长)/对照
苗高(或根长)×100%.
试验结果进行 Duncan s分析.
2 结果与分析
2.1 薇甘菊分离各组分的化感活性
薇甘菊石油醚提取部分各分离组分的 RI值如
表 1所示.在第 1次柱层析所得各组分 A1 ～ A6中 ,
A3和 A5的化感作用效应指数均小于 -0.500,抑制
27 第 4期 李拥军等:薇甘菊化感活性成分的分离与鉴定
作用达到显著水平 ,取这 2个组分进一步进行柱层
析 ,分别得到组分 A31 ～ A35和 A51 ～ A54 ,其中 A33和
A54的 RI值分别为 -0.655和 -0.741,此 2组分均
具有显著的抑制作用 ,分别对 A33和 A54进行进一步
分离 ,其中 A33组分分离得到的 A332和 A333组分 ,重结
晶后得到化合物 I和 I;从 A54组分得到化合物 II.
表 1 薇甘菊分离组分的化感作用效应指数(RI)1)
Tab.1 Allelopathiceffectindex(RI)ofdifferentpropor-
tionsofMikaniamicrantha
组分 proportions RI 组分 proportions RI
A1 0.068 A51 0.159A2 0.048 A52 -0.106
A3 -0.673 A53 -0.185
A4 -0.303 A54 -0.741
A5 -0.563 A331 -0.173A
6 -0.167 A332 -0.596A31 0.093 A333 -0.497
A32 -0.118 A334 -0.089
A33 -0.655 A541 -0.261A
34 -0.286 A542 -0.158A35 -0.194 A543 -0.796
1)表中 RI值为萝卜 、菜心和水稻 3种受试植物苗高和根
长 2个测试项目 RI值的平均值
2.2 分离化感物质的结构鉴定
化合物 I:104 mg,淡黄色粉末 ,熔点(m.p.)178
～ 181 ℃.IR(KBr)/cm-1:3 434(—OH), 2 942、
1 379(—CH3 ), 2 869、 1 454(—CH2—), 1 639
(C C), 1 043(C—O).EI-MS(m/z):426(M+),
411(M+ -CH3), 408, 393, 218(基峰 ), 208, 203,
189, 133等系列三萜碎片峰.13CNMR(CDCl3)δ:
38.9, 27.4, 79.1, 38.3, 55.4, 18.54, 33.1, 40.2,
47.9, 37.3 , 23.5, 124.6, 139.7, 41.8, 28.9, 26.8,
34.5, 59.2, 59.2, 39.8, 31.4, 41.0, 28.2, 15.8, 16.3,
23.5, 28.3, 17.7, 21.6.根据分析测试数据与文献
[ 9]对照 ,确定化合物 I为 α-香树脂醇(α-amyrin,图
2a).
化合物 II:1.5g,白色针晶(CH2Cl2), m.p.158 ～
160℃.IR(KBr)/cm-1:3 410, 2 936, 2 862, 1 634,
1 460, 1 375, 1 056, 965.EI-MS(m/z):412(M+), 397
(M+ -CH3), 394(M+ -H2O), 379(M+ -CH3 ,
-H2O), 369 (M+ - C3H7 ), 300 [ M+ -
CH2 CHCH(CH2CH3)CH(CH3)2 ] , 273 [ M+ -
CH3CH2CH CHCH(CH2CH3)CH(CH3)2 ] , 255
[ M+- CH3CH2CH CHCH(CH2CH3)CH(CH3)2 ,
-H2O] , 112 [ CH2 CHCH(CH2CH3)CH(CH3)2 ] .
1HNMR(CDCl3)δ:0.68(3H, d, J=7.2 Hz, —CH3),
0.79(6H, d, J=6.8 Hz, 2—CH3), 1.00(6H, s,
2— CH3), 1.14(3H, d, J=9.6 Hz, —CH3),提示分子
中具有 2个甲基 , 其中 0.79(6H, d, J=6.8 Hz,
2— CH3)表明异丙基的存在 , 3.51(1H, m, C3— H),
为含氧碳上质子 , 5.00(1H, m, C23—H), 5.14(1H,
m, C22—H),为烯碳上 H, 5.34(1H, s, — OH)为羟基
H,综合分析该化合物的 1HNMR,显示该化合物为典
型的甾醇类化合物.13CNMR(CDCl3)δ:140.90,
138.50, 129.40 , 121.90, 70.25, 56.53, 55.87, 50.62,
50.13, 42.37, 42.03 , 40.33, 39.38, 37.17 , 36.32,
31.79, 31.57, 31.50, 31.26, 28.12, 24.71, 23.94,
21.04, 20.77, 20.60, 19.10, 18.90, 11.92, 11.80.其
中 δ值 140.90、121.90、138.50、 129.40为具有豆甾
醇骨架的化合物的特征双健信号 , 7l.9为含氧碳的
信号.结合熔点 、红外 、质谱 、核磁碳谱和氢谱综合分
析 ,并与文献 [ 10, 12-13]数据对照 ,确定化合物 I为
豆甾醇(C29H48O, stigmasterol,图 2b).
化合物 II:84mg,淡黄色针晶(丙酮), m.p.170 ～
172℃.IR(KBr)/cm-1:3 436, 3 016 ～ 2 500, 1 691,
1 620, 1 600, 1 516, 1 466, 1 379, 1 035 , 972.EI-MS
(m/z):194(M+), 179(M+-CH3), 177(M+-OH),
161(M+ -CH3 , -H2O), 150(M+ -CO2), 133
(M+-CH3 , -H2O, -CO), 105(133 -CO), 77
(105-CO).1HNMR(CD3COCD3)δ:3.82(3H, s,
— OCH3), 6.38(1H, d, J=16.2 Hz), 7.46(1H, d,
J=15.9 Hz), 7.03(1H, d, J=8.0, 2.1 Hz), 6.80
(1H, dd, J=8.1 Hz), 7.10(1H, d, J=2.1 Hz)和
7.03(1H, d, J=8.0, 2.1 Hz).13CNMR(CD3COCD3)
δ:168.3, 148.98, 147.80, 144.30, 125.70, 122.68,
115.54, 115.44, 111.03, 56.00.结合波谱数据分析 ,
与文献 [ 11, 13-14]中阿魏酸波谱学数据对照基本一
致 ,确定化合物 II为 3 -甲氧基 -4-羟基 -桂皮
酸 ,即阿魏酸(ferulicacid,图 2c).
2.3 α-香树脂醇 、豆甾醇和阿魏酸的化感作用
在 4种质量浓度下 , α-香树脂醇对萝卜 、菜心
和水稻的根长和苗高都有抑制作用 ,其中在 1.00、
0.50和 0.25 mg/mL3种质量浓度时 ,对 3种受试植
物的 2个测试项的抑制作用都达到了显著水平(表
2).2种受试植物的根部比地上部对 α-香树脂醇
的化感作用更敏感.
28 华 南 农 业 大 学 学 报 第 29卷
图 2 化合物 I、II、III的分子结构
Fig.2 MoleculestructureofcompoundsofⅠ , Ⅱ , Ⅲ
表 2 3种化合物对萝卜 、菜心和水稻幼苗生长的影响 1)
Tab.2 EffectofthreecompoundswithdifferentmassconcentrationsonseedlinggrowthofRaphanussativa, Brassica
campestrisandOryzasativa %
化合物
compound ρ/(mg· mL
-1)
萝卜 Raphanussativa 菜心 Brassicacampestris 水稻 Oryzasativa
相对根长
relative
rootlength
相对苗高
relative
shootheight
相对根长
relative
rootlength
相对苗高
relative
shootheight
相对根长
relative
rootlength
相对苗高
relative
shootheight
α-香树酯醇 1.00 58.6c 61.9c 50.9d 61.4b 57.4d 49.2d
α-amyrin 0.50 67.5bc 67.7bc 64.5c 68.3b 67.0c 75.4c
0.25 79.7b 77.6b 79.4b 88.1ab 81.2b 82.8b
0.01 98.2a 95.3a 91.7ab 93.4a 95.9a 96.7a
对照 control 100.0a 100.0a 100.0a 100.0a 100.0a 100.0a
豆甾醇 1.00 85.2b 76.5c 85.9c 60.7c 65.3c 58.9c
stigmasterol 0.50 88.2b 77.4c 92.1bc 79.9b 65.3c 65.1c
0.25 98.7a 88.2b 94.6b 82.2b 82.9b 81.4b
0.01 100.3a 98.3a 101.7a 84.0b 88.4b 89.1b
对照 control 100.0a 100.0a 100.0a 100.0 a 100.0a 100.0a
阿魏酸 1.00 26.0d 27.2d 35.6d 28.4c 29.1d 25.4c
ferulicacid 0.50 55.9c 46.8c 72.7c 64.1b 64.0c 52.5b
0.25 72.6b 70.1b 83.7b 89.9ab 84.2b 83.1a
0.01 97.4a 97.9a 95.5a 105.6a 101.5a 95.8a
对照 control 100.0a 100.0a 100.0a 100.0a 100.0a 100.0a
1)表中数据为 3个重复的平均数;同种化合物同列数据后面字母相同者表示差异不显著(Duncan s法 , P=0.05)
用不同质量浓度豆甾醇处理受试植物幼苗 ,结
果(表 2)发现 ,在 4种质量浓度下 ,豆甾醇对萝卜苗
高都有抑制作用 ,其中在 1.00、0.50和 0.25 mg/mL
3种质量浓度下 ,抑制作用达到显著水平 ,而在 4个
质量浓度下对萝卜根长都没有表现出较强的抑制作
用.在对菜心的测试中 , 4种质量浓度对苗高的抑制
作用均达到了显著水平 ,对根长的影响则只有在高
质量浓度时 ,抑制作用才达到显著水平 ,而低质量浓
度(0.01 mg/mL)对根长反而有促进作用 ,表现出化
感作用的典型特征———低促高抑现象.同时地上部
比根部对豆甾醇的化感作用更敏感.
用不同浓度阿魏酸处理受试幼苗 ,结果(表 2)
发现 ,在 1.00、0.50和 0.25 mg/mL3种质量浓度下 ,
对 3种受试植物的 2个测试项的抑制作用都达到了
显著水平.而在低质量浓度(0.01 mg/mL)下 ,对菜
心苗高和水稻根长反而有促进作用 ,表现出化感作
用的典型特征———低促高抑效应.
3 讨论与结论
植物在生存繁衍过程中 ,合成出次生物质以避
免动物的侵袭 ,增强与其他植物竞争的能力 ,这是生
物在其协同进化过程中获得的一种竞争机制 ,它们
不仅能抑制植物群落生长发育 ,也能驱避昆虫和影
响昆虫行为[ 15-16] .前人研究表明 ,薇甘菊中化感次
29 第 4期 李拥军等:薇甘菊化感活性成分的分离与鉴定
生物质的存在是薇甘菊在生态系统中能成为优势种
并迅速蔓延的重要原因之一[ 1-5] .
从薇甘菊地上部分中分离得到的化合物均具有
较强的化感活性 ,从而更进一步证实 ,薇甘菊杀死其
他植物的作用机制不仅仅是通过覆盖 ,使其植物失
去光合作用导致死亡 ,而且也通过释放化感物质 ,抑
制和危害其他植物生长 ,表现出争取生存机会的生
态功能.分离物阿魏酸是一种具有强烈活性的化感
物质 ,在薇甘菊的化学竞争机制中起到了重要的作
用.
本研究从薇甘菊化感活性部分分离获得了 3个
活性化合物 ,并鉴定了它们的结构 ,研究了单体化合
物对萝卜 、菜心和水稻的化感活性 ,初步确定了薇甘
菊中的主要化感活性物质为 α-香树脂醇 、豆甾醇和
阿魏酸 ,对于阐明薇甘菊快速生长蔓延机理 ,采取相
应方法消除薇甘菊对其他植物的危害 ,综合开发利
用薇甘菊 ,寻找除草剂先导化合物 ,开发出良好的生
物源除草剂等提供了重要的理论依据.
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【责任编辑 李晓卉】
30 华 南 农 业 大 学 学 报 第 29卷