全 文 ：基金项目：植物学重点学科建设项目(No.2013zdxk-01)和合肥市科技局重点项目[2007]第15号
收稿日期：2013-11-26 接受日期：2013-12-23
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2014, 22(5): 580~589
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2014.05.006
洋甘菊细胞色素P450还原酶基因(CPR)的分子克隆及表达分析
凌淑萍 张会敏 苏闪闪 张晓溯 刘雪艳 潘桂芳 袁艺*
安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036
*通讯作者，zhiwuxue239@163.com
摘 要 细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase, CPR)是生物体内氧化系统中的电子供体，在
细胞色素P450介导的氧化还原反应中起限速作用，是氧化反应中的关键酶。本研究根据已经报道的其
他植物的CPR基因设计简并引物，并在洋甘菊(Matricaria recutita L.)中克隆CPR基因的部分片段，然后通
过RACE扩增得到CPR基因全长。结果表明，克隆得到洋甘菊的CPR基因，提交至GenBank，得到登录号
KJ004519，其 cDNA全长 2 272 bp，包含 2 106 bp的编码区，翻译 701个氨基酸序列；生物信息学分析表
明，洋甘菊与青蒿(Artemisia annua)的亲缘关系最近，CPR基因氨基酸序列有94%的相似性，CPR蛋白质结
构包括结合P450结构域和辅因子黄素腺嘌呤二核甘酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)和黄素单核甘酸
(flavin mononucleotide, FAM)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,
NADP)结构域；通过qRT-PCR检测CPR基因在洋甘菊开花阶段舌状花冠、管状花冠、茎和叶中的表达量，
结果表明，CPR mRNA转录本积累量在管状花冠中表达量最高，是叶中表达量的20多倍，在舌状花冠和
茎中有微量表达量。本研究首次克隆了洋甘菊中CPR基因，CPR基因是植物萜类的氧化修饰过程中关
键酶，为进一步研究细胞色素P450氧化酶系在洋甘菊中萜类的生物合成途径中的具体作用提供了基础
资料。
关键词 洋甘菊，细胞色素P450还原酶(CPR)，RACE，qRT-PCR
Molecular Cloning and Characterization of a Cytochrome P450
Reductase Gene(CPR) Full-length in Matricaria recutita
LING Shu-Ping ZHANG Hui-Min SU Shan-Shan ZHANG Xiao-Su LIU Xue-Yan PAN Gui-Fang
Yuan Yi*
School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
* Corresponding author, zhiwuxue239@163.com
Abstract Cytochrome P450 reductase (CPR) is a kind of electron donor in the oxidation system, which is a
rate-limiting enzyme in the cytochrome P450-mediated redox reactions. CPR is the key enzyme in oxidation
reaction in vivo. In this study, two degenerate primers were designed according to the sequence of CPR gene
from other species, and partial sequence of CPR gene from Matricaria recutita was obtained. By RACE
technologies, the 2 272 bp full-length cDNA sequence of CPR gene from Matricaria recutita was isolated, and
GenBank accession was KJ004519. The full length CDs of CPR contained 2 106 bp nucleotides, which
encoded a protein of 701 amino acids. The CPR protein was closely clustered with Artemisia annua in a
phylogenetic tree, and they had 94% similarity of the amino acid sequence. The transcriptional expression of
CPR was analysed with quantitative Real- time PCR. The results showed that the chamomile CPR mRNA
0 引言
细胞色素P450氧化酶系(cytochrome P450 oxi-
doreductase system, P450s)是一类以血红素作为辅
基的氧化酶，在植物中催化多种初级和次级代谢反
应，主要表现在植物激素和次生代谢产物的生物合
成及降解除草剂等外源化学物质的脱毒(Schuler,
Werck-Reichhart, 2003)。P450s包括羟基化作用的
P450单氧化酶(cytochrome P450 monooxygenases,
CYP)和细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 re-
ductase, CPR)。1990年首次在植物中发现了P450s
基因，随后P450s基因在各种植物中被大量得鉴定
出来(Clint, 1998)。目前，已经从小麦、红豆杉、青
蒿和檀香木等植物中克隆出CPR，关于CPR的研究
主要集中在基因片段的克隆，蛋白质结构以及电子
传递的研究。CPR在氧化系统中作为P450氧化酶
的电子供体，通过辅因子黄素腺嘌呤二核甘酸(fla-
vin adenine dinucleotide, FAD)和黄素单核甘酸(fla-
vin mononucleotide, FAM)从 NADPH得到两个电
子，然后转移给含有血红素的细胞色素 P450氧化
酶，进而使O2分子还原活化，一个氧原子进攻底
物，使底物氧化(Smith, 1994;程婕等, 2006)。
德国洋甘菊又称母菊 (Matricaria recutita L.)，
为菊科母菊属(Matricaria Linn)草本植物，全草芳
香，含有挥发性芳香油。洋甘菊最早种植在欧洲
的南部和亚洲西部(Shiva et al., 2002 )，几百年前，
人们就用母菊的花作为消炎止痛的良药(夏秋香
等, 2012)。洋甘菊中含有丰富的母菊素、没药醇、
芹菜素等倍半萜和黄酮类的药用活性物质，因此
具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癫痫的药用活性
(Shipochliev et al., 1981; Maschi et al., 2008; Lis-
Balchin et al., 1998; Aggag et al., 1972; Koch et al.,
2008)。目前洋甘菊被广泛地应用于药品、营养品
和化妆品等领域(岳跃冲, 范燕萍, 2011)。洋甘菊
精油具有很大的市场应用价值，精油主要从花中
提取，但花中精油含量在 0.2%~0.8%(Berthold et
al., 2012)，远远不能满足市场需求。并且 CPR参
加重要抗炎物质母菊薁的生物合成(Sandra et al.,
2012)，但迄今为止在洋甘菊中尚未见关于CPR的
研究报道。因此本研究根据已报道的长春花(C.
roseus, GenBank登录号: X69791)，青蒿 (A. annua,
GenBank登录号: EF197890)，东北红豆杉(T. cuspi⁃
date, GenBank 登录号: AY571340)和中国红豆杉
(Taxus wallichiana var. Chinensis, GenBank 登录
号: AY959320)CPR基因(阮仁余, 2010)，保守区域
设计简并引物，并且通过同源克隆和RACE技术，
从洋甘菊中克隆得到 CPR基因 cDNA序列全长，
并用实时荧光定量测定开花期洋甘菊管状花冠、
舌状花冠、叶和茎的相对表达量，分析 CPR基因
的表达量与挥发油产量的关系。旨在为研究母菊
薁等中间产物的代谢途径以及提高萜类等次级代
谢产物的积累提供了基础资料。
1 材料与方法
1.1 实验材料
洋甘菊(Matricaria chamomilla L.)由宣城跃平生
态有限公司提供，露天生长于安徽农业大学农萃
园。花用于CPR基因的克隆研究，开花期的洋甘菊
管状花冠、舌状花冠、茎和叶用于CPR mRNA的表
达分析。取样后立即提取RNA，或者立即经过液氮
冷冻后，保存在-80℃冰箱中备用。
expression was the highest in disc flower. Bioinformatics analysis showed that they had the most intimate
relationship between Matricaria recutita and Artemisia annua, for 94% similarity of CPR amino acid sequence.
The structure of CPR included P450, flavin mononucleotide(FMN), flavin adenine dinucleotide(FAD) and
nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(NADP) binding domains; The expressions of CPR were
detected from radial flower, disk flower, stem and leave by qRT-PCR in Matricaria recutita, and the results
showed that the expression of CPR in disk flower was the highest, which was 20 times higher than leaves,
while radial corolla and stems had little expression of CPR. In this study, we had cloned the CPR gene from
chamomile the first time, as we know, CPR was a key enzyme in the oxidative modification process of plant
terpenes. So our results of the study may provide a molecular basis for the further research of the functions of
cytochrome P450 oxidoreductase system in terpenes biosynthetic pathway in chamomile.
Keywords Matricaria recutita, Cytochrome P450 reductase(CPR), RACE, qRT-PCR
洋甘菊细胞色素P450还原酶基因(CPR)的分子克隆及表达分析
Molecular Cloning and Characterization of a Cytochrome P450 Reductase Gene(CPR) Full-length in Matricaria recutita 581
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
1.2 主要试剂
RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、
primerSTAR、LATaq聚合酶、rTaq DNA聚合酶、
Prime ScriptTM RT Master Mix、SYBR Premix Ex Taq
Ⅱ购自Takara(日本)，胶回收试剂盒和RACE试剂
盒购自Clontech(日本)，pEASY-T1 Simple、Trans1-
T1感受态和 Transetta(DE3)购自 TransGen(中国)，
本研究中所有引物的合成和测序在上海生工完成。
1.3 实验方法
1.3.1 洋甘菊CPR基因cDNA全长的获得
用RNA提取试剂盒提取洋甘菊花冠中的的总
RNA，用反转录试剂盒将其反转录成cDNA。
由于洋甘菊与青蒿(Artemisia apiacea)的亲缘性
最高(Irmisch et al., 2012)，因此根据青蒿的CPR序
列(GenBank登录号: ABC47946.1)作为主要参考，
经Blastp比对，下载一系列其他CPR序列，根据他
们的保守区设计简并引物degF和degR (表1)。
以洋甘菊的 cDNA为模版，用简并引物 degF
与degR扩增CPR的部分片段。PCR反应体系：2.0
μL 10 × buffer，1.6 μL dNTP Mixture(2.5 μmol/L)，
0.8 μL degF(10 μmol/L)，0.8 μL degR(10 μmol/L)，1
μL模板，0.1 μL rTaq聚合酶，用去离子无菌水补足
至 20 μL。梯度 PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min，
94 ℃ 30 s，46、45.7、45.2、44.5、43.6、42.9、42.4和
42 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34个循环，72 ℃ 10 min，
4℃保存。
用凝胶回收试剂盒对 PCR产物进行回收纯
化，将纯化后的DNA片段连接到pEASY-T1 Simple
载体，反应体系为 4 μL PCR 产物，加入 1 μL
pEASY-T1 Simple载体，25℃ 10 min，然后转化到
Trans1-T1感受态，过夜培养，选取单克隆进行菌液
PCR鉴定，阳性菌送至上海生工测序。
根据所得的部分片段序列，设计RACE引物
gsp3outer、gsp3inner、gsp5outer和 gsp3inner(表 1)。
根据RACE试剂盒说明书，得到 5RACE-1st-strand
cDNA和 3 RACE- 1st- strand cDNA，通过用巢式
PCR技术分别得到CPR 5与3端cDNA的序列。巢
式 PCR 扩增CPR 5端序列，首先利用 gsp5outer作
为引物，5 RACE-1st-strand cDNA为模版进行第一
轮 PCR，PCR扩增体系：5′-RACE-Ready cDNA 1.0
μL，gsp5outer(10 μmol/L) 1.0 μL，10 × Universal
Primer Mix(UPM) 2.5 μL，dNTP Mix(2.5 μmol/L)
2.5 μL，10×LA PCR Buffer 2.5 μL，LA Taq聚合酶
0.25 μL，用去离子无菌水补足至 25 μL。PCR扩增
程序为 94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1
min；34个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃，预计得到约
800 bp的PCR产物。将第一轮扩增产物稀释50倍
作为嵌套 PCR反应模板，利用 gsp5inner引物进行
第二轮PCR扩增，反应体系与程序同第一轮，预计
得到约 700 bp的PCR产物。CPR 3端巢式PCR扩
增方法参照与 5-RACE方法，得到约 1 500 bp的
表1 实验用引物
Table 1 Primer sequences used in the experiment
名称
Name
degF
degR
gsp3outer
gsp3inner
gsp5outer
gsp5inner
ideF
ideR
qRT-F
qRT-R
actinQF
actinQR
引物序列(5~3)
Primer sequences
AGARATAGADTGGTTGA
CAWAAGCRTCATAHG TGTC
ATAAACTTGTGGAGCAGGGTGCAAAGCG
GGAAAGAGTTAGTGTGGCCCGAGTTGGA
GAAGTAACTGATCCAACTCGGGCCAC
CAACAGGAACAAGACGCTTTGCACC
CATCAATAACAAATTTCTAGAGAGAG
TTCCCATCCTCAAATAGCTG
TGATACATCTGTTGCCACTCC
AGATTCTCACAGTAGACTCCAA
GCTAACAGGGAAAAGATGACTC
ACTGGCATAAAGAGAAAGCACG
用途
Purpose
获得CPR部分片段
Obtaining partial sequence of CPR gene
CPR 3端cDNA克隆
3-RACE of CPR gene
CPR 5端cDNA克隆
5-RACE of CPR gene
CDS的鉴定
Identification CDS of CPR gene
CPR实时定量表达
qRT-PCR of CPR gene
CPR实时定量表达内参
Internal reference of qRT-PCR of CPR gene
R=A/G, Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, W= A/T, H= A/C/T, B= C/G/T, V=A/C/G, D=A/G /T
582
PCR产物。将第二轮PCR产物通过上述方法进行
测序分析。洋甘菊 CPR 3与 5的RACE测序结果
进行拼接，然后进行NCBI比对 CPR基因的同源
性，以确定RACE所获的是洋甘菊的CPR基因。
为了进一步验证洋甘菊CPR基因 cDNA全长
以及开放式阅读框(opening reading frame, ORF)的
正确性，在预测ORF两端外侧设计引物 ideF和 id-
eR(表 1)，以 cDNA作为模板，用 primerSTAR高保
真酶进行 PCR扩增。PCR扩增体系：cDNA(2.5
μmol/L) 1.0 μL，ideF Primer(10 μmol/L) 0.6 μL，id-
eR Primer(10 μmol/L) 0.6 μL，2×primer STAR Max
Premix 12.5 μL，用去离子无菌水补足至 25 μL。
PCR扩增程序：98 ℃ 10 s；55 ℃ 15 s，72 ℃ 10
min；34个循环；4℃保存。PCR产物加0.1 μL rTaq
聚合酶，混合均匀，72℃ 20 min；使得PCR产物带
有A末端，以方便与T载体连接。PCR产物通过以
上方法连接转化，并得到单克隆样本，单克隆菌送
至生工测序。
1.3.2 洋甘菊CPR基因生物信息学分析
测序结果在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/
orfig.cgi网页上进行ORF框分析，并在NCBI上进
行 blast比对来确定CPR基因ORF框的位置，并将
其翻译成对应的氨基酸序列。利用 NCBI Blast
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对和
结 构 分 析 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/
cdd)。使用BioEdit软件，将洋甘菊的CPR分别与
其他物种的CPR进行同源比对。使用DNAMAN
软件，所得到的洋甘菊CPR基因以及其他植物的该
基因的氨基酸序列进行 clustalx排序，然后在 Phy-
logenetic tree Observed Divergency模型下，各个分
支的Bootstrap置信度用 1 000自导复制建立它们
的系统进化树。
1.3.3 qRT-PCR检测洋甘菊CPR在开花期不同器
官的表达量
根据所得的CPR基因 cDNA的全长，设计实时
荧光定量引物 qRT-F与 qRT-R检测CPR在洋甘菊
开花期不同器官的相对表达量，引物序列见表 1。
用RNA提取试剂盒分别提取开花期洋甘菊舌状花
冠、管状花冠、叶和茎中的的总RNA，用反转录试
剂盒将其反转录成 cDNA。qRT-PCR分别使用洋
甘菊盘状花冠、舌状花冠、叶和茎的 cDNA为模板，
根据说明书的方法进行PCR，并绘制熔化曲线来分
析验证反应的特异性。内参基因为actin，每个实验
重复 3次。PCR扩增体系：SYBR Prime Ex TaqⅡ
12.5 μL，qRT-F(10 μmol/L) 1 μL，qRT-R(10 μmol/L)
1 μL，cDNA solution 2 μL，用去离子无菌水补足至
25 μL；每组做3个平行组。PCR扩增程序为：95℃
30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环；4℃保存。
CPR mRNA的相对表达量根据 2-ΔΔCt计算(Li-
vak, Schmittgen, 2001)。
2 结果与分析
2.1 洋甘菊CPR基因的克隆与序列分析
以合成的 cDNA为模板，通过简并引物进行梯
度PCR扩增，扩产物经琼脂糖凝胶电泳检测，大小
约为 250 bp(图 1A)，与预期大小一致。通过Blast
发现所得片段与植物CPR基因序列具较高同源性，
说明获得片段是洋甘菊CPR基因部分序列，可进行
2000
1000
750
500
100
A
bp 1 2 3 4 5 6 7 8M
250
2000
1000
750
500
100
bp 1M
250
C
2000
1000
750
500
bp 1M
250
D
2000
1000
750
500
bp 1M
250
B
2000
1000
750
500
bp 1M
E
图1 洋甘菊CPR基因部分序列、5-RACE和3-RACE电泳
Figure 1 Electrophoresis analysis of CPR gene fragment, 5-RACE and 3-RACE product fromMatricaria recutita
A：简并PCR产物，1~8退火温度分别是 46.0、45.7、45.2、44.5、43.6、42.9、42.4和 42.0℃；B：5外侧-RACE产物片段；C：3外
侧-RACE产物片段；D：5内侧-RACE产物；E：3内侧-RACE产物。M：DNA标准分子量
A: Degenerate PCR products, annealing temperature of lane 1~8 were 46.0, 45.7, 45.2 44.5, 43.6, 42.9, 42.4 and 42.0℃, respec-
tively; B: 5outer- RACE products; C: 3outer- RACE products; D: 5inner- RACE products; E: 3inner- RACE products. M: DL
2000 DNA marker
洋甘菊细胞色素P450还原酶基因(CPR)的分子克隆及表达分析
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ACTACCCTCACCAATTTCATTTCTTCACATCAATAACAAATTTCTAGAGAGAGAAAACTTTATAAAAAAAACCCCAATTTTTT
ATAAAAACTTTCTCTCTCTAAAAACTCAAACT
1 ATGCAATCAACAAACTCCGACAAGCTATCAACCTTCGATCTAATGACGGCGTTACTTAACGGCAAGGTATTCGAC
1 M Q S T N S D K L S T F D L M T A L L N G K V F D
76 ACATCAAACACATCGGAAGCGAATATTCCATTAGCCTTGATTATGGAGAACCGTGAGCTTTTGATGATTTTAACG
26 T S N T S E A N I P L A L I M E N R E L L M I L T
151 ACTTCAGTTGCCGTTTTGATCGGATGCGTTGTGGTGCTTGCTTGGAGACGATCGTCGTCGTCGAAGAAAGCGGAA
51 T S V A V L I G C V V V L A W R R S S S S K K A E
226 GCTCCGGTGATTGTTGTTCCGAAGAGAGTGGCGGAGGAGGAGGTTGACGATGGCCGAAAAAAAGTTACCGTGTTT
76 A P V I V V P K R V A E E E V D D G R K K V T V F
301 TTTGGTACTCAGACTGGTACTGCTGAAGGTTTTGCTAAGGCGCTTGTTGAAGAAGCCAAAGTGAGATATGAAAAG
101 F G T Q T G T A E G F A K A L V E E A K V R Y E K
376 GCGGTGTTTAAAGTGATTGATTTGGACGATTATGCTGCTGAGGATGATGAGTATGAGGAGAAGTTAAAGAAAGAA
126 A V F K V I D L D D Y A A E D D E Y E E K L K K E
451 TCTCTTGCTTTTTTCTTTTTAGCTACATATGGAGATGGTGAGCCGACCGATAATGCTGCTAGATTTTATAAATGG
151 S L A F F F L A T Y G D G E P T D N A A R F Y K W
526 TTTACCGAGGGAGAAGAGAAAGGTGAATGGCTGGATAAGCTTCAGTACGGAGTGTTTGGACTTGGTAACAGACAG
176 F T E G E E K G E W L D K L Q Y G V F G L G N R Q
601 TACGAGCATTTCAACAAGATTGCGAAGGTGGTTGATGATAAACTTGTGGAGCAGGGTGCAAAGCGTCTTGTTCCT
201 Y E H F N K I A K V V D D K L V E Q G A K R L V P
676 GTTGGCATGGGAGATGATGATCAATGTATTGAAGATGACTTCACTGCATGGAAAGAGTTAGTGTGGCCCGAGTTG
226 V G M G D D D Q C I E D D F T A W K E L V W P E L
751 GATCAGTTACTTCGTGACGAGGATGATACATCTGTTGCCACACCATACACAGCTGCTGTTTCAGAATACCGTGTC
251 D Q L L R D E D D T S V A T P Y T A A V S E Y R V
826 GTCTTTCATGACAAACCAGACACATATGATGCGGATCAAATGACAAATGGCCATGCAGTTCATGATGCTCAACAT
276 V F H D K P D T Y D A D Q M T N G H A V H D A Q H
901 CCATGCAGATCCAATGTCGCTGTCAAAAAGGAGCTCCATTCACCTGAATCTGACCGGCCTTGCACTCATTTGGAA
301 P C R S N V A V K K E L H S P E S D R P C T H L E
976 TTTGACATCTCTAATACTGGATTATCGTATGAAACCGGGGACCATGTTGGAGTCTACTGTGAGAATCTAAGTGAA
326 F D I S N T G L S Y E T G D H V G V Y C E N L S E
1051 GTTGTCGACGAAGCTGAAAAATTAATAGGTTTACCGCCACACACATACTTCTCAGTACACACTGATAACGAAGAC
351 V V D E A E K L I G L P P H T Y F S V H T D N E D
1126 GGGACACCACTTGGTGGAGCCTCTTTGCCACCTCCTTTCCCTCCATGCACTTTAAAAAAAGCATTGGCTTCCTAT
376 G T P L G G A S L P P P F P P C T L K K A L A S Y
1201 GCCGATGTCTTGAGCTCTCCCAAAAAGTCAGCTTTGCTTGCTTTAGCTGCTCATGCTACTGATGAAACTGAAGCT
401 A D V L S S P K K S A L L A L A A H A T D E T E A
1276 GAAAGACTGAAATTTCTTGCGTCTCCTGCTGGAAAGGATGAATATGCTCAGTGGATAGTTGCAAGCCAAAGAAGT
426 E R L K F L A S P A G K D E Y A Q W I V A S Q R S
1351 CTCCTTGAGGTCATGGAGGCCTTCCCATCAGCTAAGCCTCCACTTGGTGTCTTTGTTGCATCTGTCGCCCCACGC
451 L L E V M E A F P S A K P P L G V F V A S V A P R
1426 TTGCAGCCGAGATACTATTCTATCTCTTCTTCCCCAAAGTTTGCGCCAAATAGGATTCATGTAACTTGTGCATTA
476 L Q P R Y Y S I S S S P K F A P N R I H V T C A L
1501 GTGCATGAGCAAACACCATCAGGCCGCGTTCACAAGGGAGTCTGTTCAACATGGATGAAGAATGCCGTACCTGCT
501 V H E Q T P S G R V H K G V C S T W M K N A V P A
1576 ACAGAAAGCCAGGATTGCAGTTGGGCCCCAATCTATGTTAGAACATCCAATTTCAGACTTCCTTCTGATCCTAGG
526 T E S Q D C S W A P I Y V R T S N F R L P S D P R
1651 GTGCCAGTTATCATGATCGGCCCAGGCACTGGATTGGCTCCATTTAGAGGTTTCCTTCAGGAAAGGTTAGCTCAG
551 V P V I M I G P G T G L A P F R G F L Q E R L A Q
1726 AAGGAAGCTGGGACTGAGCTCGGAACATCCATCTTATTCTTCGGATGCAGGAATCGCAAAGTGGATTTCATATAT
576 K E A G T E L G T S I L F F G C R N R K V D F I Y
1801 GCGGACGAGCTTAATAATTTCGTGGAGACTGGTGCTCTTTCCGAGCTTATTACAGCCTTCTCTCGTGAAAGTGCT
601 A D E L N N F V E T G A L S E L I T A F S R E S A
1876 ACTAAGGAGTACGTGCAACACAAGATGAATCAAAAGGCTTCGGAAATCTGGAATTTACTTTCTGAGGGAGCATAT
626 T K E Y V Q H K M N Q K A S E I W N L L S E G A Y
1951 TTGTATGTTTGTGGTGATGCCAAAGGCATGGCCAGAGATGTACATCGAACTCTGCACACTATTGCGCAAGAACAG
651 L Y V C G D A K G M A R D V H R T L H T I A Q E Q
2026 GGATCTCTAGACTCGTCAAAGGCGGAGCTCTTCGTTAAGAATTTACAAATGGCAGGAAGATATCTCCGTGATGTA
676 G S L D S S K A E L F V K N L Q M A G R Y L R D V
2101 TGGTAA
701 W *
ATAGTATCACAGCTATTTGAGGATGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
图2 洋甘菊CPR基因的cDNA及氨基酸序列
Figure 2 cDNA and deduced amino acids sequences of CPR fromMatricaria recutita
加粗字体分别表示是起始密码子与终止密码子；*：氨基酸翻译终止
Bold fonts are the initiation codon and termination codon, *: The translation termination of amino acids
584
下一步RACE扩增。采用RACE方法分别克隆洋
甘菊 CPR基因 5和 3末端序列，通过巢式 PCR扩
增，经过电泳检测，获得 5和 3目的片段(图 1B、C、
D和E)。测序后将得到RACE结果进行软件拼接，
在3端序列均存在Poly(A)尾巴。通过Blast比对确
认是CPR基因序列。
序列分析表明德国洋甘菊的 CPR基因序列
(GenBank登录号: KJ004519)，包括 2 106 bp编码
区，5端非编码区(untranslated regions, UTR)有 115
bp碱基，3端UTR有 51 bp碱基(图 2)。 该基因编
码 701个氨基酸，经分析不包含信号肽序列，分子
量为 77.8 kD，包含 75个强碱性氨基酸(K、R)，103
个强酸性氨基酸(D、E)，249个疏水性氨基酸(A、I、
L、F、W、V)，168个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)，等
电点 pI 5.09，不包含信号肽。将 CPR编码序列与
NCBI数据库进行Blast比对。结果显示，本研究克
隆的CPR基因氨基酸序列与已公布的青蒿CPR基
因相似度在 93%~94%，其中艾菊(Tanacetum bal⁃
samit)86%，甜菊 (Stevia rebaudiana)81%，野甘草
(Scoparia dulcis)76%，陆地棉 (Gossypium hirsutum)
76%。蛋白结构分析结果表明，N末端氨基酸残基
与黄素氧还蛋白相似，N端至 C端具有典型的
FMN、FAD和NADPH的结合位点。选取大鼠(Rat⁃
tus norvegicus)、酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、
牛(Bos taurus)、兔(Oryctolagus cuniculus)、曼氏裂体吸
虫(Schistosoma mansoni)和果蝇 (Drosophila melano⁃
gaster)CPR基因的氨基酸序列与洋甘菊的进行对
比。结果表明，洋甘菊CPR与P450、黄素腺嘌呤二
核甘酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)和黄素单
核甘酸(flavin mononucleotide, FAM)和烟酰胺腺嘌
呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate, NADP)结构域保守性良好(图3)。另外，
选取18种植物的CPR基因氨基酸序列与洋甘菊的
CPR基因做系统进化树分析，以大鼠CPR基因作为
外群。结果表明，洋甘菊与青蒿的亲缘关系最近，
与除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)和菊芋(Helian⁃
thus tuberosus)也有很高亲缘性(图 4)，因此洋甘菊
CPR基因在菊科植物中进化保守。
2.2 洋甘菊CPR基因在各个组织中的表达量
本研究选取开花期的洋甘菊新鲜叶子、茎、管
状花冠和舌状花冠，分别提取mRNA，用荧光定量
PCR分析方法检测CPR基因在各组织中相对表达
量(图 5)。结果表明，不同器官CPR基因的表达量
呈现差异性。CPR基因在管状花冠中表达量极显
著高于舌状花冠和茎(P<0.01)，是舌状花冠的中该
基因表达量的105倍；CPR基因在叶子中有少量表
达，是舌状花冠的表达量的5.5倍，显著高于舌状花
冠和茎中的表达量(P<0.05)；CPR基因在茎中表达
量最少，不及管状花冠中的百分之一，是舌状花冠
中表达量的0.77。
3 讨论
洋甘菊精油呈现特殊的深蓝色，是因为其中含
有一种有色成分——母菊薁。母菊薁是一种愈创
木烷类型的倍半萜，是由一种倍半萜内酯母菊素在
蒸馏过程中自发形成的深蓝色物质，其单体成分具
有显著的抗炎、抗痉挛和抑菌的活性(Schilcher et
al., 2005)。通过分子生物学的方法提高洋甘菊中
母菊薁的产量具有非常重要的研究价值。已有研
究表明，各种倍半萜的生物合成途径非常的复杂，
人们对不同倍半萜的生物氧化修饰途径了解不
多。目前研究最为清楚的是青蒿素的合成途径，青
蒿素与母菊薁都是属于倍半萜类化合物。倍半萜
是由法呢基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate syn-
thase, FPS)以牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyro-
phosphate, GPP)为底物合成法呢基焦磷酸(farnesyl
pyrophosphate, FPP)，FPP再通过各自的倍半萜合
酶合成倍半萜的碳骨架(马靓等, 2006)，然后经过
一系列的氧化修饰形成各自的倍半萜结构。研究
表明，青蒿与洋甘菊都为菊科植物，青蒿素与母菊
素的氧化合成途径相似，都是先由FPP通过各自的
倍半萜合酶分别合成紫穗-4,11-二烯和香叶烯A
(germacrene A)。P450s将青蒿素的前体物质紫穗-
4,11-二烯氧化成青蒿酸，将香叶烯A催化香叶烯
酸 (germacrene A acid)。进一步氧化的 6-α羟基化
的香叶烯酸能自发地内酯化生成木香烃内酯
(Nguyen et al., 2010; Ikezawa et al., 2011)，而木香烃
内酯是生物合成母菊薁的前提物质(Irmisch et al.,
2012)。目前研究证实将细胞色素 P450单氧化酶
和细胞色素 P450还原酶基因转入到青蒿植株中，
能有效提高青蒿素的含量(Shen et al., 2012;景福远
等, 2008)，而且用荧光定量检测CPY和CPR的表达
量和HPLC分析青蒿素的表达量呈现出密切的相
关性(Shen et al., 2012)。洋甘菊CPR是合成母菊薁
洋甘菊细胞色素P450还原酶基因(CPR)的分子克隆及表达分析
Molecular Cloning and Characterization of a Cytochrome P450 Reductase Gene(CPR) Full-length in Matricaria recutita 585
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
FAM binding
FAM binding P450 binding
P450 binding
FAD binding
FAD binding
NADPH binding
Matricaria recutita
113764.1
ACI43097.1
001030467.1
001153762.1
002574520.1
AGB92665.1
Matricaria recutita
113764.1
ACI43097.1
001030467.1
001153762.1
002574520.1
AGB92665.1
Matricaria recutita
113764.1
ACI43097.1
001030467.1
001153762.1
002574520.1
AGB92665.1
Matricaria recutita
113764.1
ACI43097.1
001030467.1
001153762.1
002574520.1
AGB92665.1
Matricaria recutita
113764.1
ACI43097.1
001030467.1
001153762.1
002574520.1
AGB92665.1
Matricaria recutita
113764.1
ACI43097.1
001030467.1
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002574520.1
AGB92665.1
Matricaria recutita
113764.1
ACI43097.1
001030467.1
001153762.1
002574520.1
AGB92665.1
Matricaria recutita
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洋甘菊 Matricaria recutita KJ004519
青蒿 Artemisia annua ABC47946.1
除虫菊 Tanacetum cinerariifolium AGO03799.1
菊芋 Helianthus tuberosus CAA81209.1
大阿美 Ammi majus AAS90127.1
欧芹 Petroselinum crispum AAB97736.1
矮牵牛 Petunia×hybrida AAZ39649.1
紫苏 Perilla frutescens ADC94831.1
臭味假柴龙树 Nothapodytes foetida ACF35280.1
花菱草 Eschscholzia californica AAC05022.1
小麦 Triticum aestivum AC83301.1
花旗松 Pseudotsuga menziesii CAA89837.3
紫杉 Taxus cuspidata AAT76449.1
红豆杉 Taxus wallichiana var. Chinensis AAX59902.1
陆地棉 Gossypium hirsutum ACN54323.1
金丝桃 Hypericum androsaemumAAS00459.1
大豆 Glycine max NP_001236742.1
百金花 Centaurium erythraea AAS92623.1
鼠 Rattus norvegicus NP_113764.1
100
99
100
92
84
100
94
100
97
100
92
100
100
0.05
的关键酶，因此提高CPR蛋白的表达水平可能有
效地提高洋甘菊母菊薁的含量。
本研究通过简并PCR和RACE技术首次从洋
甘 菊 中 克 隆 了 CPR 基 因 ，GenBank 登 录 号
KJ004519，该基因 cDNA全长 2 272 bp，包含 2 106
bp的编码区，翻译701个氨基酸序列。经过同源比
对分析表明洋甘菊中CPR基因与青蒿的CPR基因
亲缘关系最近。蛋白结构分析表明，CPR蛋白N端
至C端包含FMN、FAD和NADP的结合域。N末端
氨基酸残基与黄素氧还蛋白相似，C末端 FAD和
NADP结合域的氨基酸残基于与铁氧还蛋白 -
NADP+还原酶(ferredoxin-NADP+reductase, FNR)
NADPH binding
113764.1
ACI43097.1
001030467.1
001153762.1
002574520.1
AGB92665.1
Matricaria recutita
113764.1
ACI43097.1
001030467.1
001153762.1
002574520.1
AGB92665.1
NADPH binding
Matricaria recutita
113764.1
001030467.1
001153762.1
002574520.1
AGB92665.1
ACI43097.1
图3 洋甘菊与其他物种的CPR氨基酸序列同源性分析
Figure 3 Homology analysis of the amino acid sequence of CPR between Matricaria recutita and other species
洋甘菊：Matricaria recutita，KJ004519；大鼠：Rattus norvegicus，NP_113764.1；酵母：Xanthophyllomyces dendrorhous，
ACI43097.1；牛：Bos taurus，NP_001030467.1；兔：Oryctolagus cuniculus，NP_001153762.1；曼氏裂体吸虫：Schistosoma manso⁃
ni，XP_002574520.1；果蝇：Drosophila melanogaster，AGB92665.1。
方框：分别为P450、FMN、FAD和NADPH结合域
Black block: Binging domain of P450, FMN FAD and NADPH, respectively
图4 洋甘菊CPR基因编码蛋白的系统发育树
Figure 4 The phylogenetic tree of CPR gene encoded amino acid sequence from Matricaria recutita
洋甘菊细胞色素P450还原酶基因(CPR)的分子克隆及表达分析
Molecular Cloning and Characterization of a Cytochrome P450 Reductase Gene(CPR) Full-length in Matricaria recutita 587
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
120
110
100
90
8
6
4
2
0
DF RF L S
器官Organ
CP
R相
对
表
达
量
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
of
CP
R **
*
相似，而且CPR与FNR都能将电子从NADPH传递
到细胞色素P450氧化酶，因此有学者从CPR的结
构上推测，CPR可能来源于黄素蛋白和铁氧化还原
蛋白的融合(程婕,杨凌, 2006)。
本研究结果表明，不同器官CPR基因的表达量
呈现明显的差异性，其中在管状花冠中表达量明显
高于其他器官，在舌状花冠和茎中的CPR基因表达
量最少，在叶子中有少量表达。洋甘菊挥发油在花
中含量最高(Schilcher et al., 2005)，暗示了 CPR基
因的表达与植物中萜类的实际积累量有密切的联
系。成分分析表明，花、茎、叶和根挥发油的成分有
明显差异，只有在花中检测到母菊薁 (2.3% ~
10.9%)，而 CPR是合成母菊薁必须的酶 (Kumar,
2001)。本研究通过调控CPR基因的表达量，可试
图提高母菊薁等倍半萜物质的含量。
综上所述，CPR与 P450s的电子传递反应是
P450s氧化还原反应的关键限速酶 (阮仁余等,
2010)，而且是合成母菊薁过程中氧化修饰反应所
需的电子传递酶，因此CPR在菊科植物中与萜类物
质的氧化修饰具有非常重要的作用。
4 结论
本研究首次克隆了洋甘菊中CPR基因，该基因
翻译 701个氨基酸序列。用荧光定量PCR分析方
法检测CPR基因在各组织中相对表达量。结果表
明，不同器官CPR基因的表达量呈现差异性，其中
在管状花冠中表达量明显高于其他器官。CPR是
植物萜类的氧化修饰过程中关键的酶，为提高洋甘
菊中萜类的产量以及研究萜类的生物合成途径提
供了基础资料。
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图5 洋甘菊CPR基因在各器官中的表达量
Figure 5 Expression of CPR in various organs of Matri⁃
caria recutita
DF：管状花冠；RF：舌状花冠；L：叶子；S：茎。**：P<0.01，差
异极显著；*：P<0.05，差异显著。内参基因：actin，n=3
DF: Disk flower; RF: Radial flower; L: Leaf; S: Stem. **: P<
0.01, extremely significant difference; *: P<0.05, significant
difference. Internal reference gene: actin, n=3
588
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(责任编辑 靳晓霞)
洋甘菊细胞色素P450还原酶基因(CPR)的分子克隆及表达分析
Molecular Cloning and Characterization of a Cytochrome P450 Reductase Gene(CPR) Full-length in Matricaria recutita 589