全 文 ：第 28卷　第 4期
2007年 12月
内 蒙 古 农 业 大 学 学 报
JournalofInnerMongoliaAgriculturalUniversity
Vol.28　No.4
Dec.2007
向日葵遗传转化影响因素研究＊
沙日娜 , 　景岚＊ , 　张少英
(内蒙古农业大学农学院 ,呼和浩特　010019)
摘要:　以向日葵茎尖为外植体 , 通过农杆菌介导转化 ,将草酸氧化酶基因 (OXO)导入向日葵 , 对影响转化频率的
因素:卡那霉素浓度 , 头孢霉素浓度 ,农杆菌感染时间和浓度等进行了探讨。当卡那霉素浓度为 50mg/L,头孢霉素浓
度为 500 mg/L, 农杆菌菌液浓度 OD600 =0.3 ～ 0.4, 感染时间为 9min～ 10 min时 , 抗性芽比率可达 7.4%。对抗性苗
进行 PCR检测 , 初步证明草酸氧化酶基因 (OXO)已整合到向日葵的基因组中。
关键词:　向日葵;　遗传转化;　影响因素
中图分类号:　S565.501　　　文献标识码:　A　　　文章编号:1009-3575(2007)04-0120-05
RESEARCHOFINFLUNCEFACTORSONSUNFLOWER(HELIANTHUSANNUUSL.)TRANSFORMATIONMEDIATEDBYAGROBACTERIUM
SHARi-na, 　JINGLan＊ , 　ZHANGShao-ying
(CollegeofAgronomy, InnerMongoliaAgriculturalUniversity, Huhhot　010019, China)
Abstract:　OXOgenewastransferedintoHelianthusannuusviaAgrobacteriumusingshootapicesasexplants.Thefactorsthatmay
affecttransformationfrequencywereinvestigated, suchasconcentrationofkanamycin(Kan)andcefazolinsodium(Cef), infection
timeandinfectionconcentrationofAgrobacterium.WheninfectionconcentrationwasOD600 =0.3 ～ 0.4, infectiontimewas9 minutes～ 10 minutes, 50mg/LKanand500mg/Lcefwereaddedintotheselectivemedium, thefrequencyofputativetransformantsreached
7.4%.PCRanalysisshowedthattheOXOgenehadbeenintegratedintosunflowergenome.
Keywords:　 Helianthusannuus;　Genetictransformation;　Influencefactors
　　向日葵(Helianthusannuus)是世界第二大油料
作物 ,也是我国北方重要的油料作物 ,在为人类提供
食用油方面具有特别重要的地位 。向日葵菌核病
(SclerotiniaScerotitorum)是世界范围的主要病害[ 1] ,
我国的东北 、内蒙古 、山西和西北等地该病危害也十
分严重 。目前 , 向日葵菌核病的防治主要依靠农药
或轮作 ,但这些措施对该病害防治效果不理想 ,况且
农药的使用既增加生产成本又加重环境污染。因
此 ,解决向日葵菌核病病害最根本的途径是培育抗
病品种 ,通过遗传转化将外源抗病基因导入植物细
胞 ,可为品种改良提供新的途径 [ 2 ～ 4] 。
菌核病发病机理是病菌首先在寄主细胞膜内产
生草酸毒素 ,引起细胞内的酸度增加及水分关系失
调 ,因此 ,可通过膜脂过氧化物水平升高 ,细胞膜结
构损坏 ,膜透性增大 ,导致病原菌进入寄主细胞内侵
染发病 。引入特异性降解草酸的基因可降低营养胁
迫 ,并对病原真菌发挥抗性 [ 5] 。
在利用农杆菌转化向日葵的过程中 ,再生频率
低和转化率低是获得转基因植株的主要障碍。本研
究将针对菌核病病原菌分泌草酸这一致病机制利用
来自于小麦的草酸氧化酶基因 ,通过农杆菌转化体
系以茎尖为受体进行遗传转化 ,对农杆菌转化条件
和方法进行较为系统的比较研究 ,对向日葵茎尖再
生体系建立及农杆菌介导转化的影响因子进行了探
讨 ,为向日葵的遗传转化及抗病育种方面提供参考 。
＊ 收稿日期:　2006-11-23基金项目:　内蒙古自然科学基金项目(200508010307)作者简介:　沙日娜(1982-),女 ,硕士研究生 ,主要从事植物生理生化研究.＊通讯作者　
1　材料和方法
1.1　供试材料及工程菌株
星火花葵 ,购自内蒙古巴盟科河种业有限公司。
本试验 采 用根 癌 农 杆菌 菌 株 (Agrobacterium
tumefaciens)LBA4404菌系 ,其中含有质粒 Ox0 -
pGPTV-KAN。其上带有编码抗草酸毒素的草酸氧
化酶(Oxalateoxidase)基因 OxO、抗卡那霉素(Kan)
筛选剂的新霉素磷酸转移酶 CNPTI)基因 nptl。具
体结构如图 1所示 。
pAnos:T-DNA胭脂碱合成酶;pAg7:基因 7多聚腺苷酸;35S:35SCaMV启动子;Pnos:胭脂碱合成酶启动子;nptII:新霉素磷
酸转移酶;gf-2.8:草酸氧化酶;箭头表示转录方向;RB:T-DNA右边界;LB:T-DNA左边界
pAnos:T-DNAnopalinesynthase;pAg7:gene7 poly(A)signal;35S:35SCaMVpromotor;Pnos:nopalinesynthasepromotor;
nptII:neomycinphosphotransferaseII;gf-2.8:oxalateoxidase.Arrowsindicatethedirectionoftranscription;RB:rightT-
DNAborder;LB:leftT-DNAborder
图 1　植物表达载体 OxO-pGPTV-KAN的结构
Fig.1 DiagramofthevectorOxO-pGPTV-KAN
1.2　农杆菌的活化
在含抗生素的 LB(利福平 Rifampicin100mg/L
+Kan100mg/L+链霉素 Streptomycin100 mg/L)
固体培养基上划线活化农杆菌 , 在进行转化的前 1
天 ,挑取单菌落接种于 20 mLYEB(Rif20 mg/L+
Kan50mg/L)液体培养基中 , 28℃、200 r/min震荡
培养过夜 , 4 000 r/min离心 1min收集菌体 ,用无菌
水稀释至 OD600 =0.1 ～ 1作为工作浓度备用 。
1.3　培养基
基础培养基 MS0:MS基本成分 +3 %蔗糖 +
0.8 %琼脂;共培养培养基 MS1:MS0 +乙酰丁香酮
(ACS)100μmol/LpH=5.8;分化培养基 MS2:MS0 +
0.5 mg/L6 -BA + 0.25 mg/LIAA + 0.1 mg/
LGA。
1.3.1　筛选培养基中卡那霉素 (Kan)浓度的选择
　在筛选培养基中将卡那霉素浓度设为 10 mg/L、20
mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L5个水平 ,观察外
植体生长情况 ,确定最适的卡那霉素浓度 。
1.3.2　不同浓度头孢霉素(Cef)对转化茎尖的影响
　用头孢霉素分别配制 0、200 mg/L、300 mg/L、400
mg/L、500mg/L5个浓度梯度 ,观察转化茎尖生长状
况 ,确定适宜的杀菌剂浓度 。
1.3.3　生根培养基的选择　参照前人的实验选用
了 3种生根培养基:(1)1/2 MS0 +20 mg/LKan+
300mg/LCef+ 0.2mg/LNAA、(2)1/2 MS0 +20
mg/LKan+300mg/LCef+0.5mg/LIBA、(3)1/2
MS0 +20 mg/LKan+300 mg/LCef进行比较 ,统计
生根率 ,确定最佳生根培养基。
1.4　外植体的制备
挑选饱满 、大小均匀和无病虫害的向日葵种子 ,
剥壳后用 70%乙醇消毒 1min,再用 0.1%升汞消毒
30S, 之后用无菌蒸馏水冲洗 3次 ～ 5次 ,在无菌滤
纸上吸干水分;茎尖外植体制备:将种子浸泡于无菌
水中 , 28℃黑暗中发芽 ,浸泡 36h～ 48h后 ,切去无菌
苗的根 、子叶和叶原基露出茎尖 ,然后横向切取茎
尖 。下胚轴外植体制备:将消好毒的种子种到 1/2
MS上 , 3d～ 5d后取下胚轴。
1.5　转化方法
将制备的茎尖外植体置于不同浓度的(OD600值
分别为 0.1、0.3 ～ 0.4、0.6 ～ 0.8、1)菌液中浸泡 ,浸
染时间设置 5 min～ 6 min、7min～ 8 min、9 min～ 10
min、11 min～ 12 min4个水平。然后弃去菌液 ,用无
菌滤纸将外植体表面的多余的菌液吸干后接种于
MS1培养基上 , 28℃黑暗条件下共培养 3d, 并设对
照 。将 3d后的茎尖用灭菌的 MS液体冲洗后吸干水
分 ,移置到加有抗生素的 MS2培养基上进行选择培
养 ,每隔 15d左右继代 1次 。当选择的抗性芽长到
2cm左右时移入生根培养基上 ,诱导生根 。
1.6　转基因植株的 PCR检测
采用 CTAB法提取植物总 DNA。向日葵再生
苗的 PCR检测:取上述制备的总 DNA40 ng～ 150
ng,在 25μ1的反应体系中.进行基因的 PCR扩增。
具体的反应循环体系条件为:①热启动 94℃ 3 min;
②变性 94℃ 1min;③退火 55℃ 1 min;④延伸 73℃
121第 4期　　　　　　　　　　　　　　　　沙日娜等:　向日葵遗传转化影响因素研究
2.5min,最后 1个循环延伸 10 min,共 35个循环。
PCR阳性对照的模板为含草酸氧化酶基因的大肠杆
菌质粒(克隆载体),阴性对照的模板分别为未转基
因的向日葵基因组 DNA。
2　结果与分析
2.1　转化外植体的选择
目前 ,用于向日葵遗传转化的受体主要有原生
质体 、下胚轴 、茎尖等[ 6 ～ 8] 。本实验也试用下胚轴为
受体进行转化 ,但最终分化率为 0,可能因抗性愈伤
难分化 ,导致培养周期变长而受到了限制。直接分
化再生系统因可以缩短培养时间 ,防止体细胞变异
而越来越受到重视。所以本实验最终选择茎尖为向
日葵转化受体。
2.2　卡那霉素(Kan)浓度的筛选
由表 1可见 ,当卡那霉素浓度为 20 mg/L以下
时大部分茎尖可以正常生长 ,显然卡那霉素没有起
到抑制作用;随着卡那霉素浓度的提高 ,茎尖生长受
抑制的程度也在增加 。当 30 mg/L时部分白化 ,但
仍有一部分芽可以生存 , 40 mg/L时大部分白化死
亡 ,只有少数继续生长 。 50 mg/L时几乎全部白化 ,
但这其中只有极少数能生长。为保证获得的茎尖大
部分是转化芽 ,本试验选择卡那霉素浓度 50 mg/L
作为筛选转化芽的适宜浓度 。
表 1　不同浓度卡那霉素对向日葵转化茎尖的影响
Tab.1 EffectofdiferentconcentrationofKanonthetransformationshoottipofsunflower
Kan浓度 (mg/L)
Concentration(mg/L)
生长状态
Growthcondition
组织颜色
Colorsofexplants
存活率 (%)
Survivalrate(%)
10 继续生长 绿色 37.3
20 部分生长缓慢 有白色出现 15.8
30 生长较缓慢 部分白化 8.4
40 生长缓慢 大部分白化 4.5
50 几乎停止生长 绝大部分白化 0.6
2.3　头孢霉素(Cef)浓度的筛选
表 2　不同浓度头孢霉素的抑菌效果
Tab.2EfectoftheconcentrationsofCboninhibitingAgrobacterium
Cef浓度(mg/L)
Concentrations(mg/L)
接种数
Numberofexplants
侵染致死率%
Deathfrequency
afterinfecting%
0 100 100
200 100 71
300 100 49
400 100 16
500 100 0
　　用根癌农杆菌或发根农杆菌进行植物遗传转化
时 ,一般常用羧苄青霉素(Cb)或头孢霉素(Cef)抑
制农杆菌的生长 。本试验采用头孢霉素 ,结果表明
只有将头孢霉素的浓度提高到 500 mg/L时 ,才能完
全抑制农杆菌 (表 2)。同时在其培养结束 ,接入选
择培养基之前 ,需加 MS液体清洗受体材料茎尖 ,防
止农杆菌感染外植体 。
2.4　不同农杆菌感染浓度和感染时间对茎尖转化
的影响
农杆菌介导转化时 ,一般将外植体浸入一定浓
度的菌液中 1段时间后 ,再在共培养基上共培养数
天 。感染时菌液的浓度 、活性和感染的时间会直接
影响转化效率 。菌液浓度过低或感染时间过短 ,茎
尖周围农杆菌生长稀少 ,转化频率低 。反之 ,则难以
抑制农杆菌的过度生长 ,外植体细胞受到农杆菌的
伤害而死亡 。因此 ,应该选择合适的感染时间和与
之相适应的菌液浓度 。本实验表明 ,当农杆菌感染
浓度为 OD600 =0.3 ～ 0.4、感染时间为 9min～ 10 min
时比较适宜 。在此条件下 ,既可保证适宜菌量 ,又容
易抑制菌的生长 ,获得的抗性芽达 7.4%(表 3)。
表 3　农杆菌感染浓度和感染时间对转化茎尖的影响
Tab.3 EfectofinfectiontimeandinfectionconcentrationofAgrobacteriumonthetransformationshoottipofsunflower
感染时间(min)
Infectiontime
不同菌液浓度(OD600)下抗性芽出现率(%)
Frequencyofresistanceshoots(%)withdifferentconcentrationofAgrobacterium
0.1 0.3 ～ 0.4 0.6 ～ 0.8 1
5 ～ 6 1.3 3.6 2.4 0 .2
7 ～ 8 1.6 6.3 2.6 0.2
9 ～ 10 2.5 7.4 1.4 0.6
11 ～ 12 3 6.2 0.7 0
122 内 蒙 古 农 业 大 学 学 报　　　　 　　　　　　　　2007年
2.5　生根培养基的选择
在进行根诱导时 ,降低卡那霉素和头孢霉素的
浓度是为了减轻其对再生芽的抑制作用从而有利于
获得较健壮的转基因再生植株 。 (1)1/2 MS0 +20
mg/LKan+300mg/LCef+0.2mg/LNAA、(2)1/
2 MS0 +20 mg/LKan+300mg/LCef+0.5mg/L
IBA、(3)1/2 MS0 +20 mg/LKan+300 mg/LCef3
种生根培养基中只有另加 0.2 mg/LNAA或 0.5mg/
LIBA的培养基有生根现象 。由表 4可见 , 1号生根
率为 50%, 2号为 23%。结果表明:生根培养基中选
用 0.2 mg/LNAA要比 0.5mg/LIBAIBA效果好。
而未加 NAA、IBA的 3号生根培养基中没有生根 。
表 4　3种生根培养基生根状况比较
Tab.4 Comparisonofthreerootingmedium
培养基类型
Typesofmedium
接种数
No.ofexplants
生根率%
Frequencyofrooting%
1 29 50
2 29 23
3 29 0
2.6　再生植株的 PCR检测结果分析
A.转基因植株。 B抗性植株的 PCR鉴定。 M:DL2000DNA分子量标记物;1:阳性对照;2:非转基因植株;3 ～ 5:质粒 OXO-
pGPTV-KAN的转基因植株
A.Transgenicplant.B.PCRidentificationofputaLivetransformants.M:DNAMarkerDL2000;1:positivecontrol;2:non-trans-
genicplant;3 ～ 5:transgenicplantsofOXO-pGPTV-KAN
图 2　转基因植株和具有抗性的再生植株 PCR鉴定
Fig.2 TransgenicplantandPCRandcharacterizationofputativetransformants
　　对初步筛选的 14株转化植株进行了草酸氧化
酶基因的 PCR检测。如果外源基因已整和到向日
葵基因组中 ,则在对草酸氧化酶基因检测时应表现
为阳性 ,检测如图 2所示 。结果表明有 2株转化植
株表现阳性(假阳性率 82.7),这初步说明草酸氧化
酶基因已整和到向日葵植株基因组中 。
3　讨论与结论
向日葵是双子叶植物 ,可用根癌农杆菌介导转
化 ,早在 1983年开始大量的外源基因通过农杆菌介
导被转入向日葵的细胞 (Murai1983、Matzke1984、
Goldsbrough1986[ 9 ～ 11] )。但是 ,转化的细胞无法再生
植株 ,因此 ,农杆菌介导的向日葵遗传转化方法受到
限制。直到 1987年 Everet等 [ 17]利用农杆菌浸染向
日葵的下胚轴 ,通过愈伤组织获得第 1例转基因向
日葵 ,这为向日葵转化工作提供了良好的开端。
Schrarnmeijer等 [ 12]认为如果能选择合适的农杆菌菌
株 、向日葵的基因型 、以及合适的 DNA转化方式 ,以
茎尖为外植体建立向日葵遗传转化系统是很有前景
的 。郝彦玲 [ 13]的实验中用茎尖进行转化 ,最后 GUS
基因纯和表达率达 32.8%。
农杆菌介导的外源基因转化是农杆菌与植物细
胞之间相互作用的结果 ,凡是能够影响植物细胞转
化应答能力和农杆菌感染能力以及转化子再生能力
的各种因素 ,都会对其转化效果产生影响 。诸如材
料的不同取材时间 、筛选过程中卡那霉素和头孢霉
素的浓度 、共培养的时间等等 。因此 ,农杆菌介导外
源基因转化效率的提高依赖于各种影响因子的优化
和转化条件的改善 [ 14] 。本实验建立向日葵遗传体
系是以向日葵的茎尖为外植体 ,不经过愈伤组织直
接形成再生植株 。
在农杆菌介导 OXO基因转化向日葵茎尖的的
过程中 ,我们的试验表明 ,选取浸泡于无菌水 48h的
种子茎尖作为受体材料 ,这样不仅可以增加材料数
量而且操作方便 ,便于大量地进行转化 。农杆菌感
染时菌液浓度稀释至 OD600 =0.3 ～ 0.4、感染时间控
制在 9 min～ 10min,并且在感染过程中进行一定程
度的摇动处理 ,能够有效地提高转化率 ,抗性芽率达
到 7.4%。本试验中也证明 ,卡那霉素对再生定芽有
强烈的抑制作用 [ 15] 。当卡那霉素浓度大于 50 mg/L
123第 4期　　　　　　　　　　　　　　　　沙日娜等:　向日葵遗传转化影响因素研究
时没有抗性芽出现。当浓度较低时 ,在前 1周 ～ 2周
内产生大量的假抗性芽 ,但随着继代 ,这些假抗性芽
渐渐褪绿变白 ,最后褐化死亡 。因此本试验选用 50
mg/L卡那霉素作为抗性芽的筛选浓度 。而杀菌剂
Cef的使用浓度选定在 500mg/L, 若浓度过低 ,杀不
死多余的菌而农杆菌很快在培养基上形成菌落 ,污
染了转化受体 ,也抑制了生长。另外在生根培养基
中选用 0.2mg/LNAA要比 0.5mg/LIBA效果好 。
由于大多数双子叶植物组织在受到创伤后 ,细
胞分泌某些酚类物质 ,农杆菌对这些物质具有趋化
性化 ,而且它们可作为创伤诱导分子诱导农杆菌 Vic
基因活化及表达 。用农杆菌侵染外植体时加入适当
的乙酰丁香酮(AS)或羟乙酰丁香酮 (OH-AS)可
诱导 Vic基因的活化 , 增进转化频率 , 有利于转
化 [ 13] 。所以我们在 MS1 共培养基中加入了 100
μmol/L乙酰丁香酮。最终共获得了 26株抗卡那再
生植株 ,但是表型观察全部为绿色的仅有 14株 ,最
后经 PCR检测阳性为 2株 ,假阳性率为 82.7%,初
步证明 2株中草酸氧化酶基因有暂时的表达 ,转化
率低于 1%。但实验中未能获得可育性的转基因向
日葵植株。
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