全 文 ：第 32 卷 第 4 期
2011 年 10 月
内 蒙 古 农 业 大 学 学 报
Journal of Inner Mongolia Agricultural University
Vol． 32 No． 4
Oct． 2011
向日葵黄萎病拮抗细菌 Y1 － 2 菌株的
鉴定与抑制效果
*
王 颖1， 周 臣1， 张一名1，2， 赵 君1， 周洪友1*
(1． 内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特 010019;2． 廊坊师范学院生命科学学院，河北省廊坊市 06500)
摘要: 从向日葵黄萎病病区的健康植株根际分离到 1 株对向日葵黄萎病病原菌(Verticillium dahliae Kleb．)具有较
强拮抗作用的菌株 Y1 － 2。经形态观察、生理生化测定及 16S rDNA 序列对比分析结果表明，菌株 Y1 － 2 鉴定为 Ba-
cillus subtilis，其与(CJT14XVY01S)B ． subtilis 序列相似性达 99． 96 %。菌株 Y1 － 2 与大丽轮枝菌对峙培养可以形成
4 mm的抑菌带，室内防治试验表明 Y1 － 2 菌株对向日葵黄萎病的防治效果为 75． 3 %;在田间小区防治试验中，Y1
－ 2 菌株对向日葵黄萎病的防治效果为 81． 8 %。
关键词: 大丽轮枝菌; 拮抗细菌; 筛选; 鉴定; 枯草芽孢杆菌
中图分类号: S435． 655 文献标识码: A 文章编号:1009 － 3575(2011)04 － 0116 － 05
IDENTIFICATION AND INHIBITION EFFECT OF VERTICILLIUM WILT
OF SUNFLOWER ANTAGONISM BACTERIA STRAIN Y1 － 2
WANG Ying1， ZHOU Chen1， ZHANG Yi － ming1，2， ZHAO Jun1， ZHOU Hong － you1*
(1． College of Agronomy，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010019，China;
2． Langfang Teachers College，Langfang 065000，China)
Abstract: We isolated the Verticillium wilt of sunflower pathogen(Verticillium dahliae Kleb．)antagonist bacterial stain Y1 － 2 from
the soil of sunflower roots． The identification results via morphology，physiological and biochemical characters and 16S rDNA analysis
suggested that Y1 － 2 has 99． 96% similarity with (CJT14XVY01S)B． subtilis． The mutual confrontation training of stain Y1 － 2 and
Verticillium dahliae Kleb． results showed the width of the inhibition belt is 4 mm． The greenhouse control effect of Y1 － 2 is 75． 3%，
and the field control effect reaches to 81． 8 % ．
Key words: Sunflower Verticillium wilt; Antagonist bacteria; Selection; Identification; Bacillus subtilis
向日葵黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium
dahliae Kleb．)引起的一种世界性病害，是典型系统
侵染的土传病害［1，2，3］，防治极其困难。一旦发生造
成向日葵严重减产，给农业生产造成巨大的经济损
失。当前国内外对于向日葵黄萎病的防治措施主要
是应用抗病品种、化学防治和生物防治［4］。目前，由
于杂交品种的广泛推广，致使向日葵田间抗病性严
重下降;用于防治黄萎病的化学药剂，防效也不理
想，并且田间用药十分困难。大量的生产实践和研
究证实，利用生物防治是有效控制土传维管束病害
最有潜力的防治措施之一［5，6］。现在已经从多种植
物、土壤中分离筛选到对黄萎病具有生防作用的生
防菌［7 － 9］，但关于向日葵黄萎病生防菌的研究和应
用少见报道。本文从向日葵黄萎病病区的健康植株
根际分离到对大丽轮枝菌具有较强拮抗作用的菌株
Y1 －2，对其进行了生理生化和分子鉴定，并对向日
葵黄萎病进行了室内和田间防治试验，为生防菌剂
的进一步开发应用提供理论依据。
* 收稿日期: 2011 － 04 － 01
基金项目: 向日葵产业技术体系(CARS －16) ;国家自然科学基金(30860166)资助
作者简介: 王颖(1985 －) ，女，硕士研究生，植物病害生物防治研究方向．
* 通讯作者: E － mail:hongyouzhou2002@ yahoo． com． cn
1 材料与方法
1． 1 材料
病原菌大丽轮枝菌(V． dahliae Kleb．)由本课题
组分离鉴定和保存。所用培养基为 PDA、LB 固体培
养基和 LB液体培养基。向日葵品种为益民星火(内
蒙古杭锦后旗益民种子有限责任公司)。
1． 2 方法
1． 2． 1 土样中细菌的分离 采用稀释法。将从病
区采集的植物带根土壤，抖去浮土后称取根际土壤 1
g置于盛有 9 mL 无菌水的试管内，剧烈振荡 5 min，
制成土壤悬浮液，梯度稀释 10 － 4 后，涂 LB 平板，28
℃培养箱中黑暗培养，48 h 后挑取不同菌落形态的
单个菌落，经 LB平板纯化后 4 ℃保存于 LB 斜面待
用。
1． 2． 2 大丽轮枝菌拮抗细菌的筛选 采用平板对
峙培养法，筛选拮抗菌。把 1． 2． 1 中分离到的细菌
点接到距菌大丽轮枝菌饼 2 cm处，每皿接 4 个(3 次
重复) ，设不接种拮抗菌的平板为对照(CK) ，置于 25
℃培养箱黑暗培养 48 h，观察并记录结果。
1． 2． 3 室内防效测定 将得到的具有较强拮抗作
用的菌株转接到 LB 斜面上活化，培养 48 h 接种于
装有 50 mL LB 培养液的 250 mL 三角瓶中，30℃、
180 r /min摇床培养 48 h。待向日葵苗长至两片真
叶，移出营养钵，蘸根处理 30 min，移入病土中(1． 0
× 106 个孢子 / g土) ，7 d后开始调查发病情况(每处
理 20 株，3 次重复)。设不经拮抗菌处理的病对照
(CK)。处理后正常管理，10 d 后叶面开始出现发病
症状，剖杆检查，记录发病情况。筛选出生防效果好
的菌株。
表 1 幼苗期向日葵黄萎病分级标准
Tab． 1 Seedling stage classification standards of Verticillium wilt of sunflower
级别 变色维管束占总维管束面积(%)
0 0
1 0． 1 ～ 25． 0
2 25． 1 ～ 50． 0
3 50． 1 ～ 75． 0
4 75． 1 ～ 100． 0
1． 2． 4 拮抗菌株 Y1 － 2 的田间防治效果 2010 年
在内蒙古农业大学教学农场进行小区试验，采用人
工接种黄萎病菌。田间向日葵 5 月末播种，待幼苗
生长 1 个半月 6 叶 － 8 叶期时，在根部浇灌菌株 Y1
－2 菌悬液，每株浇灌浓度为 107 cfu /mL 的菌液 50
mL，间隔 12h 后在根部 2cm － 5cm 处接入1． 0g 浓度
为 1． 0 × 106个孢子 / g 黄萎病菌麦麸培养物，每处理
30 株，3 次重复。在向日葵开花盛期时调查叶片颜
色的变化，记录发病情况。
表 2 成株期向日葵黄萎病分级标准
Tab． 2 Adult － plant stage classification standards of Verticillium wilt of sunflower
级别 变色叶片占整片叶片百分率(%)
0 0
1 0． 1 ～ 25． 0
2 25． 1 ～ 50． 0
3 50． 1 ～ 75． 0
4 75． 1 ～ 100． 0
1． 2． 5 形态鉴定和生理生化鉴定 参照《常见细菌
系统鉴定手册》［10］中的方法进行鉴定。
1． 2． 6 16S rDNA 片段的 PCR 扩增和序列分析 菌
株 Y1 －2 基因组 DNA的提取采用 CTAB法［11］。
16S rDNA 片段的 PCR 扩增的引物为通用引
物［12］，正向引物为 27F:5 ＇ － AGAGTTTGATCCTG-
GCTCAG － 3 ＇，反向引物为 1492r:5 ＇ － GGTTACCTT-
GTTACGACTT － 3 ＇。PCR 反应体系:DNA(70 ng·
μL －1)模板 2 μL ;dNTP Mixture(2． 5 mmol· L －1)
3． 5 μL;27F(20 μmol· L －1)1． 0 μL;1492r(20 μmol
· L －1)1． 0 μL;10 × Buffer(Mg2 + pluse)5 μL;Taq
DNA 聚合酶 0． 5 μL;补足 ddH2O 到 50 μL。PCR 条
件为:94 ℃预变性 5 min;然后 94 ℃变性 30 s、55 ℃
退火 30 s、72 ℃延伸 2． 0 min，共 35 个循环;最后 72
℃延伸 10 min。用 1 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增产
物。将扩增产物委托宝生物公司(TaKaRa)进行测
序。
711第 4 期 王 颖等: 向日葵黄萎病拮抗细菌 Y1 － 2 菌株的鉴定与抑制效果
所测序列递交 GenBank数据库，使用 Blast 程序
进行相似性比较。由 GenBank中得到相关菌株的序
列，与本文所测得序列一起输入 MEGA 4． 0 软件，以
UPGMA法构建系统发育树。
2 结果与分析
2． 1 土样中拮抗细菌的分离筛选
2． 1． 1 所得拮抗菌株主要类群 采用稀释涂布法，
利用 LB培养基通过检测土样中所分离菌株及以前
保存的 198 株菌株，共分离、筛选到有较强拮抗效果
的各类菌株 176 株。其中以细菌为主，有 157 株;其
次为放线菌 16 菌株，真菌 3 株。有拮抗效果的菌株
占总分离菌株数的 8． 0 %。分离结果表明，有拮抗
作用的仍以细菌为主，占拮抗菌株的 89． 2 %。部分
拮抗菌株的抑菌效果见表 3。从表 3 中可见，供试的
部分菌株对大丽轮枝菌都有较强的拮抗作用，其中
菌株 Y1 －2 和 6 － 38 的拮抗作用最强，抑菌带分别
为 4． 0 mm和 3． 8 mm。
表 3 部分菌株对大丽轮枝菌的抑制效果
Tab． 3 Inhibition effect of part strains against Verticillium dahliae Kleb．
菌株 抑菌带宽(mm) 菌株 抑菌带宽(mm)
GY －15 3． 2 + 0． 2 DQ － 18 3． 0 + 0． 1
Y1 － 2 4． 0 + 0． 3 H2 － 33 3． 0 + 0． 4
6 － 38 3． 8 + 0． 1 WY －41 3． 0 + 0． 2
H1 － 36 2． 0 + 0． 2 SX － 6 3． 0 + 0． 1
DQ － 16 2． 0 + 0． 1 WT － 17 3． 0 + 0． 3
2． 1． 2 拮抗细菌室内防治效果 通过对有拮抗作
用的 157 株细菌进行室内生防效果测定，试验部分
结果见表 4。从表 4 中可见，有 6 株拮抗细菌对向日
葵黄萎病均有较好的防治效果，其中 Y1 － 2、6 － 38
和 WT －17 等 3 株拮抗菌的防治效果在 60． 0 %以
上，其防治效果分别为 75． 3 %、71． 0 %和 66． 7 %;
另外 3 株防治效果也在 50． 0 %左右。从中选择防
效较好的 Y1 －2 和 6 － 38 菌株进一步进行田间小区
试验。
表 4 拮抗细菌对向日葵黄萎病的室内防治效果
Tab． 4 The interior control effect of antagonism bacteria against Verticillium wilt of sunflower
菌株 病情指数 防治效果(%) 菌株 病情指数 防治效果(%)
6 － 38 14． 5 71． 0 DQ － 18 22． 0 56． 0
Y1 － 2 12． 4 75． 3 WY －41 25． 3 49． 5
GY － 15 21． 0 58． 1 WT － 17 16． 7 66． 7
CK 50． 0 －
2． 1． 3 拮抗菌株的田间防治效果 从表 5 可以看
出:Y1 －2 和 6 － 38 菌株在田间对向日葵黄萎病的
防治效果明显，分别为 81． 8 %和 77． 3 %，说明 2 菌
株对向日葵黄萎病都具有很好的防治效果。
表 5 菌株 Y1 － 2 对向日葵黄萎病的田间防治效果
Tab． 5 The field of control effect of strains Y1 － 2 against Verticillium wilt of sunflower
发病率(%) 病情指数 防治效果(%)
CK 47． 0 44． 0 －
6 － 38 24． 0 10． 0 77． 3
Y1 － 2 15． 0 8． 0 81． 8
2． 2 拮抗细菌 Y1 －2 菌株的鉴定
2． 2． 1 菌株 Y1 － 2 形态学鉴定及生理生化特性测
定 菌株 Y1 －2 在 LB固体培养基平板上培养 24 h
的菌落形态呈圆形，奶油色，不透明。无荚膜，周生
鞭毛，能运动。革兰氏染色阳性;细胞呈直杆状，2． 0
～ 3． 0 μm ×7． 0 ～ 11． 0 μm，常以成对或链状排列，偶
见成短链，具圆端。芽孢椭圆到柱状，位于菌体中央
或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌株 Y1 － 2 的生
理生化特性见表 6。供试菌株与对照菌株 Bacillus
subtilis试验结果一致。根据细菌形态、染色反应、培
养性状和生理生化特征，初步确定菌株 Y1 － 2 属于
芽孢杆菌(Bacillus)。
811 内 蒙 古 农 业 大 学 学 报 2011 年
表 6 菌株 Y1 － 2 的生理生化特征
Tab． 6 Strains of Y1 － 2 physiological and biochemical characteristics
特征 菌株 Y1 － 2 对照菌株 Bacillus subtilis
革兰氏染色 + +
接触酶 + +
厌氧生长 － －
V － P 测定 + +
V － P培养物终 pH ＜ 6 d －
V － P培养物终 pH ＞ 7 － －
淀粉水解 + d
硝酸盐还原到亚硝酸盐 + d
柠檬酸盐利用 + +
明胶液化 + d
45 ℃生长 － －
酯酶(Tween 80) － －
NaCl和 KCl利用 － d
尿素利用 － －
肌醇 + +
七叶苷 + d
鸟氨酸脱羧酶 + +
非发酵半乳酶 + +
非发酵甘露醇 + +
山梨醇 + d
pH 5． 7 营养肉汤 + d
pH 6． 8 营养肉汤 + +
注:+，≥ 90 %菌株为阳性;－，≥ 90 %菌株为阴性;d，11 % － 89 %菌株为阳性． Note:+，≥ 90 % strains as positive;
－，≥ 90 % strains negatie;d，11 % －89 % strains as positive．
2． 2． 2 菌株 Y1 － 2 的系统发育分析 菌株 Y1 － 2
的 16s rDNA 在 GenBank 上进行相似性比对(Query
ID ICII32493) ，得到菌株 Y1 － 2 与芽孢杆菌属(Ba-
cillus)多个种有较高的同源性，相似率均在 99% 以
上。再以 MEGA 4． 0 构建系统发育树对照见附图，
可以看出菌株 Y1 －2 与芽孢杆菌属的细菌处于一个
大分枝内，其中又与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
遗传距离最为接近。
综合以上 Y1 －2 菌株的细菌形态、染色反应、培
养性状、生理生化性及 16S rDNA 基因序列的分析结
果，菌株 Y1 －2 鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subti-
lis)。
3 讨论
由大丽轮枝菌(V． dahliae)引起的植物黄萎病，
是一类世界性病害，可侵染多种寄主植物，使向日
葵、陆地棉、马铃薯、甘蓝、茄子、番茄、油菜、白菜、辣
椒等发生黄萎病或萎蔫病，造成巨大的经济损失，严
重影响了产量与品质。当前，国内外从抗病育种、化
学防治和农业措施等方面做了大量工作，初见防病
效果，但是由于受到诸多因素的制约，防治效果不显
著。利用生防菌来防治土传病害被认为是现在最具
发展潜力的防治方法之一，并且对于各种黄萎病的
生物防治已有很多报道。如菌株 Bv1 － 9 为花域芽
孢杆菌(Bacillus vallismortis) ，其对棉花黄萎病有较
高的拮抗活性，对不良环境有较强的抵抗能力［13］。
生防细菌 NCD －2(Bacillus subtilis)对棉花黄萎病的
田间防治效果较好［14］等。
本试验从各向日葵田地里的土样中筛选各种拮
抗菌，由于选用了 LB 培养基，主要筛选到大量的拮
抗细菌，而放线菌和真菌的数量相对较少。对筛选
到的 1 株对大丽轮枝菌有较高拮抗活性的菌株 Y1
－2，经过多次室内防治试验都能够较好的抑制向日
葵黄萎病的发生，并且田间小区防治试验有较好的
防治效果，说明该菌具有较稳定的生防作用。经 16s
rDNA序列对比和系统发育分析，其与枯草芽孢杆菌
具有 99． 96 %的同源性，且生理生化特性相一致，并
结合传统的形态观察，将菌株 Y1 － 2 鉴定为枯草芽
孢杆菌。菌株 Y1 － 2 有较广的生长温度和 pH 范
围，能够抵抗外界不良的因素，并且田间防病作用良
好而稳定，具有生产上应用的可能性，可作为微生物
911第 4 期 王 颖等: 向日葵黄萎病拮抗细菌 Y1 － 2 菌株的鉴定与抑制效果
农药进行开发。今后，还需要进行大面积的田间防
病试验，进一步检验其作用的稳定性，以便应用于生
产，发挥其生防潜能。
枯草芽孢杆菌是一类比较常见的生防菌，可产
生多种抗菌物质，主要存在于土壤和植物组织内部
并且具有较好的定殖活性，其制剂加工工艺、施用方
法已比较成熟。对该菌株所产生抗菌活性物质的组
分、结构，及其它生防机理有待进一步研究。
附图 菌株 Y1 － 2 16S rDNA 系统发育树
Fig． Phylogenetic tree constructed based on
strain Y1 － 2 16S rDNA gene sequence
Figure 注:下方标尺为遗传距离;括号中为
菌株号及 GenBank 16S rDNA登录号
Note:The number on the Ruler is the coefficient of
genetic distance;Strain No． and
GenBank accession No． in the parenthesis．
参 考 文 献:
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