全 文 ：宋 微，王 磊，张 虎，等． 山木通叶斑病病原菌分离、鉴定与拮抗细菌的筛选［J］． 江苏农业科学，2015，43(12) :172 － 174．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2015． 12． 053
山木通叶斑病病原菌分离、鉴定与拮抗细菌的筛选
宋 微，王 磊，张 虎，潘静霞
(江苏农林职业技术学院风景园林系，江苏句容 212400)
摘要:采用组织分离法从山木通病叶上分离叶斑病病原菌并鉴定，结果表明山木通叶斑病的病原真菌为镰刀菌
(Fusarium sp．)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum )、链格孢(Alternaria sp．)，根据柯氏法则此 3 种真菌均为叶斑病的致
病菌，混合致病性最高可达 100%。通过室内平板的对峙培养，初步筛选出对叶斑病有拮抗作用的菌株，其中，对镰刀
菌有较强拮抗性的细菌有 6 株，对尖镰孢菌有拮抗性的细菌有 8 株，对链格孢菌 As1、As2 这 2 株真菌分别有 11、7 株
细菌对其有较强拮抗作用，具有一定的生防潜力，有进一步研究的价值。
关键词:山木通;叶斑病;拮抗细菌
中图分类号:S182 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2015)12 － 0172 － 03
收稿日期:2014 － 12 － 22
基金项目:江苏省自然科学基金(编号:BK2011498) ;江苏省林业三
新工程(编号:lysx［2013］15) ;江苏农林职业技术学院课题。
作者简介:宋 微(1978—) ，女，博士，副教授，主要从事微生物学和
植物病理学研究。E － mail:13360790@ qq． com。
山木通(Clematis finetiana)为毛茛科铁线莲属植物，常绿
木质藤本，园林中常用于垂直绿化，若其叶部病害严重将影响
其观赏性。目前，对病害的防治主要以化学防治和营林措施
为主，且很大程度上依赖于化学防治，但化学防治有许多不足
之处，目前有益微生物介导的生物防治是人们比较感兴趣的
一种方法，这种方法能改善作物生长和产量，同时确保人们消
费安全和自然环境的安全［1 － 3］。现今对山木通叶部病害的研
究鲜有报道，笔者在分离得到叶斑病病原菌的基础上，筛选出
对叶部病原菌有明显拮抗作用的细菌，以期在生物防治上进
一步研究和应用。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
研究材料山木通种植于江苏农林职业技术学院苗圃地，
2013 年 7—9 月每月取病叶样，置于消毒后的塑封袋中，带回
实验室进行分离纯化。供试细菌为宝华玉兰根际土壤中分离
筛选的具有解磷活性的益生土壤细菌。真菌和细菌基础培养
基分别为 PDA 培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。
1． 2 测定指标及方法
采样选取发病样株，从上至下取病叶，采用组织分离法分
离叶部病原微生物，所得真菌菌株采用尖端菌丝挑取法纯化。
真菌根据菌落培养性状、产孢结构及孢子特点等进行鉴定，并
同时委托南京金斯瑞生物科技有限公司利用 rDNA的保守序
列设计引物，PCＲ 扩增未知真菌的 ITS 区，测序后与 GenBank
中已知的序列进行同源性比较，对未知真菌进行鉴定。
1． 2． 1 病原菌拮抗微生物的筛选 将活化的待选细菌制成
3 × 108 CFU /mL 菌悬液，病原菌接种于 PDA 平板中间，取
0． 1 mL细菌菌悬液接种于平板四周成梅花状，以单纯接病原
菌为对照组，每个处理 3 次重复，25 ℃下培养 3 d，以游标卡
尺测量其抑菌环半径。
1． 2． 2 山木通病原菌致病性试验 将山木通叶表面先用
70%乙醇消毒，无菌水反复冲洗，待叶表面游离水风干后，用
灭菌后接种针接种，分别挑取病原菌针刺接种，处理为 1 种病
原菌单独接种，2 种病原菌混合接种，3 种病原菌混合接种，每
处理 10 株苗，重复 3 次，以灭过菌的塑料袋进行密封，7 d 后
统计发病率。
2 结果与分析
2． 1 病原真菌分离与鉴定
将组织分离法获得的叶部病原真菌按照形态学与分子生
物学进行初步分离鉴定(图 1、表 1)，结果表明此次分离纯化
出的真菌为镰刀菌(Fusarium sp．，简称 Fs) ;尖镰孢菌
(Fusarium oxysporum，简称 Fo);菌落颜色呈现黑色的链格胞
菌(Alternaria sp．)、菌落呈现灰色的链格胞菌(Alternaria
sp．) ，分别编号为 As1、As2，共 4 类病原真菌。
2． 2 4 种病原菌拮抗微生物的筛选
2． 2． 1 细菌对 Fs拮抗结果 拮抗试验结果表明，试验筛选
的 40 株细菌中存有病原菌的拮抗菌，以拮抗圈的大小来衡量
拮抗性的强弱(表 2)，其中 X5、X7、X16、X17、X32、X38，6 株细菌
与病原菌可形成大而明显的抑菌环，对 Fs菌落生长有较强的
拮抗作用，X2、X3、X4、X6、X11、X14、X18、X19、X21、X22、X26、X27、
X28、X31、X35、X39、X40对 Fs有拮抗作用，但比前 6 种拮抗性弱，
其余 17 株细菌 X1、X8、X10、X12、X13、X15、X19、X20、X23、X24、
X25、X29、X30、X33、X34、X36、X37对 Fs无拮抗作用。
2． 2． 2 细菌对真菌 Fo的拮抗结果 由表 3 可见，对病菌 Fo
有抑制作用的细菌有 27 株，其中 X7、X8、X11、X15、X16、X19、
X22、X38的拮抗性表现较强，抑菌环明显。其余 13 株细菌 X9、
X10、X12、X13、X18、X20、X23、X24、X25、X34、X35、X37、X39对 Fo无拮
抗作用。
2． 2． 3 细菌对链格孢(黑色菌落)As1 的拮抗结果 通过拮
抗试验筛选出以下细菌菌株:X1、X2、X5、X7、X11、X15、X16、
X17、X19、X21、X40对 AS1 有较强抑制作用(图 2、表 4)，抑菌环
—271— 江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 12 期
表 1 山木通病叶真菌的分离率与菌落特征
分离真菌
分离率
(%) 菌落颜色 菌落形态
Fs 20 白色 菌落白色，致密分散
Fo 5 黄色 菌落黄色，绒毛状疏松
As1 40 黑褐色 菌落黑褐色，质地紧密
As2 35 灰色 菌落灰色，质地紧密
表 2 细菌对 Fs的拮抗效果
细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性
X1 － － X11 0． 263 + X21 0． 263 + X31 0． 475 +
X2 0． 494 + X12 － － X22 0． 413 + X32 2． 100 +++
X3 0． 542 ++ X13 － － X23 － － X33 － －
X4 0． 413 + X14 0． 400 + X24 － － X34 － －
X5 1． 133 +++ X15 － － X25 － － X35 0． 638 ++
X6 0． 358 + X16 0． 988 +++ X26 0． 200 + X36 － －
X7 0． 900 +++ X17 0． 900 +++ X27 0． 238 + X37 － －
X8 － － X18 0． 300 + X28 0． 525 ++ X38 1． 000 +++
X9 0． 413 + X19 － － X29 － － X39 0． 675 ++
X10 － － X20 － － X30 － － X40 0． 550 ++
表 3 细菌对真菌 Fo的拮抗效果
细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性
X1 0． 756 ++ X21 0． 334 +
X2 0． 547 ++ X22 1． 117 +++
X3 0． 517 ++ X26 0． 333 +
X4 0． 43 + X27 0． 606 ++
X5 0． 658 ++ X28 0． 4 +
X6 0． 875 ++ X29 0． 4 +
X7 1． 458 +++ X30 0． 3 +
X8 1． 05 +++ X31 0． 3 +
X11 1． 017 +++ X32 0． 2 +
X14 0． 65 ++ X33 0． 334 +
X15 1． 25 +++ X36 0． 65 ++
X16 0． 884 ++ X38 1． 367 +++
X17 0． 344 + X40 0． 7 ++
X19 0． 825 ++
大且明显。对链格孢(黑色)有抑制作用的细菌以及拮抗圈
的大小和强弱见表 4，其中 X9、X10、X12、X13、X18、X20、X23、X24、
X25、X26、X29、X31、X32、X36、X37、X39，16 株细菌对病菌胶链格孢
(黑色)无拮抗性，其余菌株对病原菌虽有拮抗性，但效果
较弱。
表 4 细菌对链格孢 As1 的拮抗效果
细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性
X1 1． 192 +++ X17 0． 858 ++
X2 0． 850 ++ X19 0． 900 ++
X3 0． 597 ++ X21 0． 700 ++
X4 0． 533 ++ X22 0． 669 ++
X5 1． 025 +++ X27 0． 488 ++
X6 0． 630 ++ X28 0． 525 ++
X7 1． 150 +++ X30 0． 600 ++
X8 0． 333 + X33 0． 500 ++
X11 0． 917 ++ X34 0． 533 ++
X14 0． 400 + X35 0． 394 +
X15 1． 042 +++ X38 0． 575 ++
X16 1． 000 +++ X40 1． 096 +++
2． 2． 4 细菌对 As2(灰色菌落)的拮抗结果 拮抗试验表明，
在山木通叶部、宝华玉兰根部和红叶石楠叶部表面微生物中
存在对病菌胶链格孢(灰色)有一定抑制作用的拮抗细菌，且
有些细菌的拮抗作用较强。细菌对病原菌灰色菌落链格孢拮
抗效果比较(表 5)，其中 X1、X9、X14、X15、X16、X38、X40对胶链
格孢有较强的抑制作用，抑菌圈大且明显，其余对病原菌链格
孢(灰色菌落)有抑制作用的细菌菌株为 X2、X3、X4、X5、X6、
X7、X8、X10、X11、X13、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X26、X27、X28、
X31、X32、X33、X34、X39，9 株细菌 X12、X23、X24、X25、X29、X30、X35、
X36、X37对病原菌链格孢(灰色)无拮抗作用。
2． 3． 1 病原菌回接健康叶片的长势 回接病原菌试验观察
发现，无论是单一接种还是混合接种均可使健康叶片发生病
变，回接 2 周后可明显观察到叶片逐渐褪绿，健康叶片明显变
色，后期出现黑斑症状(图 3)。
—371—江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 12 期
表 5 细菌对链格孢 As2 的拮抗效果
细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性
X1 1． 433 +++ X11 0． 200 + X21 0． 683 ++ X31 0． 481 +
X2 0． 738 ++ X12 － － X22 0． 417 + X32 0． 175 +
X3 0． 433 + X13 0． 863 ++ X23 － － X33 0． 388 +
X4 0． 400 + X14 1． 075 +++ X24 － － X34 0． 400 +
X5 0． 713 ++ X15 1． 100 +++ X25 － － X35 － －
X6 0． 583 ++ X16 1． 373 +++ X26 0． 400 + X36 － －
X7 0． 500 ++ X17 0． 242 + X27 0． 300 + X37 － －
X8 0． 400 + X18 0． 950 ++ X28 0． 400 + X38 1． 025 +++
X9 1． 300 +++ X19 0． 217 + X29 － － X39 0． 500 ++
X10 0． 400 + X20 0． 500 ++ X30 － － X40 1． 000 +++
2． 3． 2 不同病原菌接种结果 不同病原菌回接健康叶片，发
病率不同(表 6)，预试验中灰色菌落的 As2 回接叶片发病率
为 0，因此后期试验只统计了其他 3 种病原真菌对山木通叶
片的回接后感病的发病率，As1 回接后病发率为 44． 4%，Fs
回接后的病发率为 55． 6%，Fo回接后的病发率为 44． 4%。Fs
和 Fo混合回接导致健康叶片感染的病发率为 22． 2%，Fo 和
As混合回接导致健康叶片感染的病发率为 22． 2%，As 和 Fs
混合回接导致健康叶片感染的病发率为 100%。Fs、Fo、As3
者混合回接导致健康叶片感染的病发率为 100%，接种病叶
经过实验室再次分离纯化获得病原菌均为试验前期接种病原
菌，具柯氏法则可证明 As、Fo、Fs 均为山木通叶斑病的致病
菌，根据发病率可知 Fs致病率最高。
表 6 病原菌接种健康叶片病发率
接种病
原真菌
发病率
(%)
接种病
原真菌
发病率
(%)
接种病
原真菌
发病率
(%)
As 44． 4% As和 Fo 22． 2 As、Fo、Fs 100
Fo 44． 4 Fs和 Fo 22． 2
Fs 55． 6 As和 Fs 100
3 结论与讨论
山木通叶斑病病原菌组织分离结果表明，其主要的致病
菌为 3 种类型，即镰刀菌(Fusarium sp．)、尖镰孢菌(Fusarium
oxysporum )、链格孢(Alternaria sp．)。众多试验表明［4 － 9］，拮
抗菌的筛选是一切生物防治的基础，部分学者应用拮抗细菌
防治农业上的病害已取得成效［7 － 9］，但在园林植物上的研究
鲜有报道。本试验中筛选出细菌菌株 16 号对 4 株病原真菌
均有较强的拮抗作用，2 株细菌(7、38 号)对 3 株病原真菌有
明显拮抗作用，6 株细菌(1、7、11、15、17、19 号)对其中 2 株
病原真菌有显著拮抗作用，有进一步深入研究的价值，其他的
细菌只对其中 1 种病原菌有拮抗作用。
植物病害生物防治研究已有很长的历史，利用拮抗微生
物防治植物病害已取得部分成绩，众多研究已证明某些拮抗
性微生物对于病原菌具有抑制性［10 － 11］，本研究从山木通叶病
叶组织中分离得到致病菌镰刀菌、尖镰孢菌、链格孢，以及对
它们有拮抗作用的细菌，但生防试验结果处于室内初步试验
阶段，在生产实践中应用以有效地控制植物病害，还有待于进
一步验证。
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