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山木通叶斑病病原菌分离、鉴定与拮抗细菌的筛选



全 文 :宋 微,王 磊,张 虎,等. 山木通叶斑病病原菌分离、鉴定与拮抗细菌的筛选[J]. 江苏农业科学,2015,43(12) :172 - 174.
doi:10. 15889 / j. issn. 1002 - 1302. 2015. 12. 053
山木通叶斑病病原菌分离、鉴定与拮抗细菌的筛选
宋 微,王 磊,张 虎,潘静霞
(江苏农林职业技术学院风景园林系,江苏句容 212400)
摘要:采用组织分离法从山木通病叶上分离叶斑病病原菌并鉴定,结果表明山木通叶斑病的病原真菌为镰刀菌
(Fusarium sp.)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum )、链格孢(Alternaria sp.),根据柯氏法则此 3 种真菌均为叶斑病的致
病菌,混合致病性最高可达 100%。通过室内平板的对峙培养,初步筛选出对叶斑病有拮抗作用的菌株,其中,对镰刀
菌有较强拮抗性的细菌有 6 株,对尖镰孢菌有拮抗性的细菌有 8 株,对链格孢菌 As1、As2 这 2 株真菌分别有 11、7 株
细菌对其有较强拮抗作用,具有一定的生防潜力,有进一步研究的价值。
关键词:山木通;叶斑病;拮抗细菌
中图分类号:S182 文献标志码:A 文章编号:1002 - 1302(2015)12 - 0172 - 03
收稿日期:2014 - 12 - 22
基金项目:江苏省自然科学基金(编号:BK2011498) ;江苏省林业三
新工程(编号:lysx[2013]15) ;江苏农林职业技术学院课题。
作者简介:宋 微(1978—) ,女,博士,副教授,主要从事微生物学和
植物病理学研究。E - mail:13360790@ qq. com。
山木通(Clematis finetiana)为毛茛科铁线莲属植物,常绿
木质藤本,园林中常用于垂直绿化,若其叶部病害严重将影响
其观赏性。目前,对病害的防治主要以化学防治和营林措施
为主,且很大程度上依赖于化学防治,但化学防治有许多不足
之处,目前有益微生物介导的生物防治是人们比较感兴趣的
一种方法,这种方法能改善作物生长和产量,同时确保人们消
费安全和自然环境的安全[1 - 3]。现今对山木通叶部病害的研
究鲜有报道,笔者在分离得到叶斑病病原菌的基础上,筛选出
对叶部病原菌有明显拮抗作用的细菌,以期在生物防治上进
一步研究和应用。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
研究材料山木通种植于江苏农林职业技术学院苗圃地,
2013 年 7—9 月每月取病叶样,置于消毒后的塑封袋中,带回
实验室进行分离纯化。供试细菌为宝华玉兰根际土壤中分离
筛选的具有解磷活性的益生土壤细菌。真菌和细菌基础培养
基分别为 PDA 培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。
1. 2 测定指标及方法
采样选取发病样株,从上至下取病叶,采用组织分离法分
离叶部病原微生物,所得真菌菌株采用尖端菌丝挑取法纯化。
真菌根据菌落培养性状、产孢结构及孢子特点等进行鉴定,并
同时委托南京金斯瑞生物科技有限公司利用 rDNA的保守序
列设计引物,PCR 扩增未知真菌的 ITS 区,测序后与 GenBank
中已知的序列进行同源性比较,对未知真菌进行鉴定。
1. 2. 1 病原菌拮抗微生物的筛选 将活化的待选细菌制成
3 × 108 CFU /mL 菌悬液,病原菌接种于 PDA 平板中间,取
0. 1 mL细菌菌悬液接种于平板四周成梅花状,以单纯接病原
菌为对照组,每个处理 3 次重复,25 ℃下培养 3 d,以游标卡
尺测量其抑菌环半径。
1. 2. 2 山木通病原菌致病性试验 将山木通叶表面先用
70%乙醇消毒,无菌水反复冲洗,待叶表面游离水风干后,用
灭菌后接种针接种,分别挑取病原菌针刺接种,处理为 1 种病
原菌单独接种,2 种病原菌混合接种,3 种病原菌混合接种,每
处理 10 株苗,重复 3 次,以灭过菌的塑料袋进行密封,7 d 后
统计发病率。
2 结果与分析
2. 1 病原真菌分离与鉴定
将组织分离法获得的叶部病原真菌按照形态学与分子生
物学进行初步分离鉴定(图 1、表 1),结果表明此次分离纯化
出的真菌为镰刀菌(Fusarium sp.,简称 Fs) ;尖镰孢菌
(Fusarium oxysporum,简称 Fo);菌落颜色呈现黑色的链格胞
菌(Alternaria sp.)、菌落呈现灰色的链格胞菌(Alternaria
sp.) ,分别编号为 As1、As2,共 4 类病原真菌。
2. 2 4 种病原菌拮抗微生物的筛选
2. 2. 1 细菌对 Fs拮抗结果 拮抗试验结果表明,试验筛选
的 40 株细菌中存有病原菌的拮抗菌,以拮抗圈的大小来衡量
拮抗性的强弱(表 2),其中 X5、X7、X16、X17、X32、X38,6 株细菌
与病原菌可形成大而明显的抑菌环,对 Fs菌落生长有较强的
拮抗作用,X2、X3、X4、X6、X11、X14、X18、X19、X21、X22、X26、X27、
X28、X31、X35、X39、X40对 Fs有拮抗作用,但比前 6 种拮抗性弱,
其余 17 株细菌 X1、X8、X10、X12、X13、X15、X19、X20、X23、X24、
X25、X29、X30、X33、X34、X36、X37对 Fs无拮抗作用。
2. 2. 2 细菌对真菌 Fo的拮抗结果 由表 3 可见,对病菌 Fo
有抑制作用的细菌有 27 株,其中 X7、X8、X11、X15、X16、X19、
X22、X38的拮抗性表现较强,抑菌环明显。其余 13 株细菌 X9、
X10、X12、X13、X18、X20、X23、X24、X25、X34、X35、X37、X39对 Fo无拮
抗作用。
2. 2. 3 细菌对链格孢(黑色菌落)As1 的拮抗结果 通过拮
抗试验筛选出以下细菌菌株:X1、X2、X5、X7、X11、X15、X16、
X17、X19、X21、X40对 AS1 有较强抑制作用(图 2、表 4),抑菌环
—271— 江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 12 期
表 1 山木通病叶真菌的分离率与菌落特征
分离真菌
分离率
(%) 菌落颜色 菌落形态
Fs 20 白色 菌落白色,致密分散
Fo 5 黄色 菌落黄色,绒毛状疏松
As1 40 黑褐色 菌落黑褐色,质地紧密
As2 35 灰色 菌落灰色,质地紧密
表 2 细菌对 Fs的拮抗效果
细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性
X1 - - X11 0. 263 + X21 0. 263 + X31 0. 475 +
X2 0. 494 + X12 - - X22 0. 413 + X32 2. 100 +++
X3 0. 542 ++ X13 - - X23 - - X33 - -
X4 0. 413 + X14 0. 400 + X24 - - X34 - -
X5 1. 133 +++ X15 - - X25 - - X35 0. 638 ++
X6 0. 358 + X16 0. 988 +++ X26 0. 200 + X36 - -
X7 0. 900 +++ X17 0. 900 +++ X27 0. 238 + X37 - -
X8 - - X18 0. 300 + X28 0. 525 ++ X38 1. 000 +++
X9 0. 413 + X19 - - X29 - - X39 0. 675 ++
X10 - - X20 - - X30 - - X40 0. 550 ++
表 3 细菌对真菌 Fo的拮抗效果
细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性
X1 0. 756 ++ X21 0. 334 +
X2 0. 547 ++ X22 1. 117 +++
X3 0. 517 ++ X26 0. 333 +
X4 0. 43 + X27 0. 606 ++
X5 0. 658 ++ X28 0. 4 +
X6 0. 875 ++ X29 0. 4 +
X7 1. 458 +++ X30 0. 3 +
X8 1. 05 +++ X31 0. 3 +
X11 1. 017 +++ X32 0. 2 +
X14 0. 65 ++ X33 0. 334 +
X15 1. 25 +++ X36 0. 65 ++
X16 0. 884 ++ X38 1. 367 +++
X17 0. 344 + X40 0. 7 ++
X19 0. 825 ++
大且明显。对链格孢(黑色)有抑制作用的细菌以及拮抗圈
的大小和强弱见表 4,其中 X9、X10、X12、X13、X18、X20、X23、X24、
X25、X26、X29、X31、X32、X36、X37、X39,16 株细菌对病菌胶链格孢
(黑色)无拮抗性,其余菌株对病原菌虽有拮抗性,但效果
较弱。
表 4 细菌对链格孢 As1 的拮抗效果
细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性
X1 1. 192 +++ X17 0. 858 ++
X2 0. 850 ++ X19 0. 900 ++
X3 0. 597 ++ X21 0. 700 ++
X4 0. 533 ++ X22 0. 669 ++
X5 1. 025 +++ X27 0. 488 ++
X6 0. 630 ++ X28 0. 525 ++
X7 1. 150 +++ X30 0. 600 ++
X8 0. 333 + X33 0. 500 ++
X11 0. 917 ++ X34 0. 533 ++
X14 0. 400 + X35 0. 394 +
X15 1. 042 +++ X38 0. 575 ++
X16 1. 000 +++ X40 1. 096 +++
2. 2. 4 细菌对 As2(灰色菌落)的拮抗结果 拮抗试验表明,
在山木通叶部、宝华玉兰根部和红叶石楠叶部表面微生物中
存在对病菌胶链格孢(灰色)有一定抑制作用的拮抗细菌,且
有些细菌的拮抗作用较强。细菌对病原菌灰色菌落链格孢拮
抗效果比较(表 5),其中 X1、X9、X14、X15、X16、X38、X40对胶链
格孢有较强的抑制作用,抑菌圈大且明显,其余对病原菌链格
孢(灰色菌落)有抑制作用的细菌菌株为 X2、X3、X4、X5、X6、
X7、X8、X10、X11、X13、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X26、X27、X28、
X31、X32、X33、X34、X39,9 株细菌 X12、X23、X24、X25、X29、X30、X35、
X36、X37对病原菌链格孢(灰色)无拮抗作用。
2. 3. 1 病原菌回接健康叶片的长势 回接病原菌试验观察
发现,无论是单一接种还是混合接种均可使健康叶片发生病
变,回接 2 周后可明显观察到叶片逐渐褪绿,健康叶片明显变
色,后期出现黑斑症状(图 3)。
—371—江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 12 期
表 5 细菌对链格孢 As2 的拮抗效果
细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性 细菌
拮抗圈直径
(cm) 拮抗性
X1 1. 433 +++ X11 0. 200 + X21 0. 683 ++ X31 0. 481 +
X2 0. 738 ++ X12 - - X22 0. 417 + X32 0. 175 +
X3 0. 433 + X13 0. 863 ++ X23 - - X33 0. 388 +
X4 0. 400 + X14 1. 075 +++ X24 - - X34 0. 400 +
X5 0. 713 ++ X15 1. 100 +++ X25 - - X35 - -
X6 0. 583 ++ X16 1. 373 +++ X26 0. 400 + X36 - -
X7 0. 500 ++ X17 0. 242 + X27 0. 300 + X37 - -
X8 0. 400 + X18 0. 950 ++ X28 0. 400 + X38 1. 025 +++
X9 1. 300 +++ X19 0. 217 + X29 - - X39 0. 500 ++
X10 0. 400 + X20 0. 500 ++ X30 - - X40 1. 000 +++
2. 3. 2 不同病原菌接种结果 不同病原菌回接健康叶片,发
病率不同(表 6),预试验中灰色菌落的 As2 回接叶片发病率
为 0,因此后期试验只统计了其他 3 种病原真菌对山木通叶
片的回接后感病的发病率,As1 回接后病发率为 44. 4%,Fs
回接后的病发率为 55. 6%,Fo回接后的病发率为 44. 4%。Fs
和 Fo混合回接导致健康叶片感染的病发率为 22. 2%,Fo 和
As混合回接导致健康叶片感染的病发率为 22. 2%,As 和 Fs
混合回接导致健康叶片感染的病发率为 100%。Fs、Fo、As3
者混合回接导致健康叶片感染的病发率为 100%,接种病叶
经过实验室再次分离纯化获得病原菌均为试验前期接种病原
菌,具柯氏法则可证明 As、Fo、Fs 均为山木通叶斑病的致病
菌,根据发病率可知 Fs致病率最高。
表 6 病原菌接种健康叶片病发率
接种病
原真菌
发病率
(%)
接种病
原真菌
发病率
(%)
接种病
原真菌
发病率
(%)
As 44. 4% As和 Fo 22. 2 As、Fo、Fs 100
Fo 44. 4 Fs和 Fo 22. 2
Fs 55. 6 As和 Fs 100
3 结论与讨论
山木通叶斑病病原菌组织分离结果表明,其主要的致病
菌为 3 种类型,即镰刀菌(Fusarium sp.)、尖镰孢菌(Fusarium
oxysporum )、链格孢(Alternaria sp.)。众多试验表明[4 - 9],拮
抗菌的筛选是一切生物防治的基础,部分学者应用拮抗细菌
防治农业上的病害已取得成效[7 - 9],但在园林植物上的研究
鲜有报道。本试验中筛选出细菌菌株 16 号对 4 株病原真菌
均有较强的拮抗作用,2 株细菌(7、38 号)对 3 株病原真菌有
明显拮抗作用,6 株细菌(1、7、11、15、17、19 号)对其中 2 株
病原真菌有显著拮抗作用,有进一步深入研究的价值,其他的
细菌只对其中 1 种病原菌有拮抗作用。
植物病害生物防治研究已有很长的历史,利用拮抗微生
物防治植物病害已取得部分成绩,众多研究已证明某些拮抗
性微生物对于病原菌具有抑制性[10 - 11],本研究从山木通叶病
叶组织中分离得到致病菌镰刀菌、尖镰孢菌、链格孢,以及对
它们有拮抗作用的细菌,但生防试验结果处于室内初步试验
阶段,在生产实践中应用以有效地控制植物病害,还有待于进
一步验证。
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