全 文 ：华北农学报·2016，31(2) :60 -64
收稿日期:2016 － 02 － 28
基金项目:天津市大型科学仪器协同开放共享平台建设项目
作者简介:吕 潇(1988 －) ，女，黑龙江大庆人，在读硕士，主要从事生物化学与分子生物学研究。
通讯作者:刘海学(1965 －) ，男，内蒙古通辽人，研究员，博士，主要从事生物化学与分子生物学研究。
不同浓度铅胁迫对向日葵幼苗蛋白质结构和
表达的影响
吕 潇，王聿双，张晓倩，刘海学
(天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300384)
摘要:为揭示向日葵抗铅胁迫的分子机理，采用傅立叶红外光谱分析法和双向电泳法探讨向日葵试材 HA89 的幼
苗在不同浓度(0，400，800 mg /L)铅胁迫条件下蛋白质水平发生的变化。结果表明:向日葵幼苗根、茎、叶的蛋白质二
级结构中的 β-折叠结构和无规则卷曲结构对铅胁迫最为敏感，同时，根据 1 655 cm －1 /1 637 cm －1比值可看出向日葵
幼苗蛋白在铅胁迫浓度为 400 mg /L时蛋白质二级结构较为稳定，超过这一浓度到 800 mg /L时，蛋白二级结构则趋于
松散;试验采用 Tris酚提取法提取试验材料全蛋白，经双向电泳分析后发现差异蛋白点 9 个。经双向电泳分析后匹配
完全相同蛋白点数 65 对，差异倍数为 2 倍以上的 9 个，根据蛋白点的等电点和分子量对照蛋白库对比后，推测变化较
为显著的蛋白是与感应有关的激酶。
关键词:向日葵幼苗;铅胁迫;傅立叶红外光谱;SDS-PAGE电泳;双向电泳
中图分类号:S565． 03 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2016)02 － 0060 － 05
doi:10． 7668 /hbnxb． 2016． 02． 011
Effects of Lead Stress on Structure and Expression of Sunflower Seedlings Proteins
L Xiao，WANG Yushuang，ZHANG Xiaoqian，LIU Haixue
(College of Agronomy ＆ Ｒesources and Environment，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China)
Abstract:In order to explore the molecular mechanism of plumbum tolerance in sunflower，the alterations of
sunflower seedlings in protein level under different concentrations of lead stress (0，400，800 mg /L) ，had been ana-
lyzed by FTIＲ infrared spectrometry and two-dimensional electrophoresis． The results showed that the irregular
structurs structure in proteins from the roots，stems，and leaves of sunflower seedlings was significantly sensitive to
lead stress compared with other structures． Measurements on the ratio of 1 655 cm －1 /1 637 cm －1 under lead stress
indicated that secondary structures of proteins were relatively stable under 400 mg /L of lead solution，while the
structures were loosely organized under 800 mg /L． The total proteins of materials mentioned above were extracted by
Tris-phenol extraction method． Then 65 same protein spots were found by two-dimensional electrophoresis analysis in
comparison with control treatment，more than 9 spots were differences in two times multiples． According to the pro-
tein isoelectric and molecular mass to protein databank，speculated that change is more significant with kinase．
Key words:Sunflower seedlings;Lead stress;FTIＲ;SDS-PAGE electrophoresis;Two-dimensional electrophoresis
重金属污染系环境污染的类型之一，其污染源
能够引起植物在生长过程中出现一系列问题，如减
少生物产量，诱发植物疾病，以及一些形态上和生理
上的改变［1］。植物体本身含有金属离子，除了从根
部摄取或者迁移到根部的金属离子，还有一些存在
于植物的细胞壁中，这些金属离子属于植物矿质营
养，是植株生长发育的基本条件。然而，近些年来由
于人类过度开发(如工业、采矿业等) ，造成环境中
的无机元素迅速增长，从而出现了重金属污染这一
严重问题，影响到植株生长发育。铅(Pb)是重金属
元素中较为常见的种类之一，铅元素容易被植物吸
收，滞留时间长而且较为稳定［2］。向日葵(Helian-
2 期 吕 潇等:不同浓度铅胁迫对向日葵幼苗蛋白质结构和表达的影响 61
thus annuus L．)作为世界第五大油料作物，在正常
生长情况下可以在其根部和芽部累积高含量的金属
离子，同时，向日葵的自我修复能力很强，还可将土
壤中过多的金属离子迁移或回收再利用［3］，但过多
的铅离子会造成向日葵出现缺水、萎蔫等代谢负担
过重症状。另外，向日葵在受到铅胁迫时也会产生
一些抵御机制，这种抵御机制可以使向日葵在一定
浓度的铅胁迫下正常生长。蛋白质是较为敏感的结
构，植物在生长期间的蛋白质组会发生变化，已经有
人对这方面进行研究［4］。在不同逆境条件下(干
旱、盐胁迫、重金属胁迫等) ，蛋白质组也会发生变
化，如肖清铁等［5］对镉胁迫后水稻叶片的蛋白质组
进行研究，检测到差异表达蛋白点 31 个，并且利用
MALDI-TOF /MS分析鉴定差异蛋白。Jerusa 等［6］对
多种重金属胁迫后的向日葵叶片蛋白质组学进行研
究，发现 23 个差异显著蛋白点，12 个被成功鉴定，
其中 6 种蛋白以前在向日葵蛋白库中未发现，而 2
种蛋白在蛋白库里表现为新序列。
红外光谱是一种用来检测高分子化合物等物质
结构的仪器，尤其是本试验采用的傅立叶红外光谱
仪更是以灵敏度高、检测数值准确、高效快速等优点
而广泛应用于蛋白结构解析方面的研究。关于傅立
叶红外光谱法检测蛋白结构方面，已经有不少研究
予以应用，赵昕等［7］采用傅立叶红外光谱法对 NaCl
胁迫后的盐芥和拟南芥的蛋白结构的变化进行了研
究，发现在高浓度盐胁迫下盐芥的蛋白质结构较拟
南芥的蛋白结构更为稳定［7］;另外，胡瑞省等［8］用
红外光谱法对不同温度下的酵母蛋白二级结构进行
分析，进一步证明酵母蛋白中的 β-折叠结构热不稳
定性。
蛋白结构的变化导致其功能也随之改变，这种
调节方式是蛋白质中普遍存在的功能调节方式。所
以，任何导致蛋白质分子结构细微变化，都将导致该
蛋白质的生理功能发生相应的改变［9］。本试验结
合红外光谱法和双向电泳法对铅胁迫下的向日葵幼
苗蛋白质进行研究，从向日葵幼苗的蛋白二级结构
变化到蛋白质表达及功能上的变化，可充分得出向
日葵幼苗在响应铅胁迫后产生的分子机理。双向电
泳是研究蛋白质组的主要技术之一，在目前蛋白质
组学研究中，多采用双向电泳技术用于分析蛋白的
混合物，或者对经过特殊处理后的组织、细胞发生的
变化进行研究。本试验结合这 2 种技术来分析铅胁
迫处理后的向日葵蛋白质组发生的变化，旨在为进
一步研究向日葵抗逆境胁迫的分子生理机制及向日
葵蛋白质组学奠定可靠基础。
1 材料和方法
1． 1 试验材料
试验采用的向日葵品种为 HA89，由天津农学
院农业分析实验教学示范中心提供。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 植株培养 将向日葵种子培养在 20 cm ×
20 cm的发芽盒中，每盒放入 40 粒种子，发芽前用
纯水浸泡 8 h进行催芽，然后采用 3 种不同方式进
行处理，第 1 种是对照处理即只浇水，第 2，3 种处理
分别浇含 Pb +浓度 400，800 mg /L的溶液，所有处理
每天浇 3 mL溶液，每种处理 3 次重复。所有向日葵
种子的发芽和生长都在环境温度约25 ℃的恒温培
养箱中培养，每天日照 8 h。
1． 2． 2 向日葵幼苗傅立叶红外光谱采集 试验采用
IＲ200傅立叶红外光谱仪对不同浓度铅胁迫下 30 d
的向日葵幼苗进行红外光谱采集，分别检测铅胁迫浓
度为 0，400，800 mg /L 的向日葵幼苗及其根、茎、叶 3
个部分的蛋白二级结构变化。为避免植株中水分对
红外光谱的干扰，采集前用 60 ℃烘箱将样品烘干约
10 h，每种样品测 3 次重复，扫描次数累积为 27 次。
由于蛋白为聚酰胺化合物，所以检测蛋白结构变化主
要包括 3 段酰胺区的吸收峰值，分别为:酰胺Ⅰ区为
1 600 ～1 700 cm －1，酰胺Ⅱ区为1 600 ～ 1 500 cm －1，酰
胺Ⅲ区为 1 300 ～1 200 cm －1［10］。其中酰胺Ⅰ区对蛋白
二级结构的特征峰值最为敏感，所以本试验主要研究
蛋白在酰胺Ⅰ区的变化特点，基本可以反映出铅胁迫
后向日葵幼苗的蛋白结构变化［11］。
1． 2． 3 蛋白样品制备 参照卢丞文等［12］的 Tris饱
和酚提取法提取试验材料全蛋白。
1． 2． 4 蛋白定量 参照张云贵等［13］的生物化学实
验指导中 Bradford定量法，测定 3 次取平均值。
1． 2． 5 双向电泳 采用 pH值 3 ～ 10，长度为 11 cm
的 IPG胶条，一向 IEF聚焦时间约6． 5 h，上样量 2 mg
左右，水化 12 h，最高电压 6 000 V;第二向电泳采用
浓度为 12． 5%，厚度为 1 mm的聚丙烯酰胺凝胶，电
泳设 30 mA /100 V，时间约 4 h，考马斯亮蓝 G-250染
色约 10 h后用去离子水脱色，直到背景透明。
2 结果与分析
2． 1 不同浓度铅胁迫下向日葵幼苗的全蛋白二级
结构变化
试验采用 Origin Pro 9． 0 程序对样品原始红外
光谱图进行 Gaussian 方程拟合处理，确定样品在酰
胺 I区主要可分成 1 637，1 646，1 655，1 664 cm －1几
62 华 北 农 学 报 31 卷
个主要波峰，分别相当于蛋白二级结构中的 β-折叠、
无规则卷曲、α螺旋和 β转角结构(图 1)。
图 1 原始红外光谱图在 Origin Pro 9． 0 软件上经
Gaussian方程曲线拟合后的酰胺 I区 1 637，
1 646，1 655，1 664 cm －1的 4 个组分
Fig． 1 Original spectra after Gaussian equation on
Origin Pro 9． 0 software showing four components
with 1 637，1 646，1 655，1 664 cm －1
铅胁迫后向日葵幼苗蛋白二级结构组成变化的
4 个波峰构成见图 2-A、B、C，由图 2 看出，植株的根
茎叶之间变化不大，但能明显看出同一处理下根在
1 637 cm －1波数下的子峰占总面积比值最高，说明
同一处理中根部含有 α-螺旋的数量较茎、叶多;随
着铅胁迫浓度增加，所有根部的蛋白二级结构变化
趋势相似，但变化的比值有所差异，向日葵幼苗根受
400 mg /L铅胁迫处理后在 1 646 cm －1波数下变化
最大，与对照处理的向日葵幼苗根相比增加了
67. 6%，而胁迫浓度达到 800 mg /L的向日葵幼苗根
则增加了 278． 0%，因此，向日葵幼苗根部无规则卷
曲结构的数量随着铅胁迫浓度的增加而增加;经不
同浓度铅胁迫处理的向日葵幼苗茎部和叶部含有的
无规则卷曲结构的数量变化也较为明显，随着铅胁
迫浓度的增加，向日葵幼苗茎部无规则卷曲结构的
数量先下降后上升，与对照茎相比上升了 118． 0%;
而向日葵幼苗叶部的无规则卷曲结构的数量则随着铅
胁迫浓度增加而增加，与对照叶相比上升了 140． 9%。
因此，向日葵幼苗根、茎、叶的蛋白二级结构中 β-折
叠结构和无规则卷曲结构对铅胁迫最为敏感。
另外，2 个主要波峰面积的相对比值能更好地
反映蛋白质结构的变化趋势，所以，采取 2 个主要波
峰面积的相对比值，即通过 1 655 cm －1 /1 637 cm －1
比值的变化来研究受铅胁迫处理后向日葵幼苗蛋
白二级结构的整体变化，图 3 为向日葵幼苗的根、
茎、叶分别在不同浓度铅胁迫下的蛋白二级结构 2
个主要波峰面积的相对比值，比值越低，则维持蛋
白二级结构稳定性的 H 键数量越低，说明蛋白结
构越松散;相反，比值越高，则维持蛋白质二级结构
稳定性的 H键数量越高，说明蛋白结构越稳定［14］。
由图 3 看出，经过铅胁迫处理后向日葵幼苗根部的
1 655 cm －1 /1 637 cm －1的比值总体呈上升趋势，而
茎和叶部的比值总体呈下降趋势;而从整个植株的
比值来看，对照处理到 400 mg /L 再到 800 mg /L 铅
胁迫处理的向日葵幼苗的1 655 cm －1 /1 637 cm －1比
值则呈先上升后下降的趋势，说明向日葵幼苗蛋白
图 2 向日葵幼苗受不同浓度铅胁迫处理
后子峰面积占总面积的百分比
Fig． 2 The percentage of peak area for total area in different
concentrations of lead stress on sunflower seedling
图 3 向日葵幼苗分别在 0，400，800 mg /L铅溶液
胁迫下酰胺Ⅰ区 1 655 cm －1 /1 637 cm －1的比值
Fig． 3 The ratio of 1 655 cm －1 /1 637 cm －1 for sunflower
seedlings under lead stress in 0，400，800 mg /L
2 期 吕 潇等:不同浓度铅胁迫对向日葵幼苗蛋白质结构和表达的影响 63
在铅胁迫浓度为 400 mg /L 时蛋白质二级结构较为
稳定，当铅胁迫处理浓度达 800 mg /L 时，蛋白二级
结构趋于松散。
2． 2 蛋白定量
由于此方法采用紫外分光光度计测定，蛋白样
品中一些试剂(如尿素、Chaps等)会影响结果，出现
误差，故试验采取测定 3 次取平均值的方法，基本可
以得到可靠结果。蛋白浓度如表 1 所示。从表 1 可
以看出，经过不同浓度铅胁迫处理后，向日葵幼苗的
蛋白含量出现变化，总体表现先上升后下降的趋势，
具体变化还要经双向电泳分离蛋白后分析得出
结果。
表 1 不同浓度铅胁迫后向日葵幼苗蛋白定量
Tab． 1 Different concentrations of lead stress after sunflower seedlings protein quantitative μg /μL
测定项目
Measuring item
浓度
Concentration
对照处理的向日葵幼苗 The control process of sunflower seedlings 43． 359
铅胁迫 400 mg /L的向日葵幼苗 Lead stress sunflower seedling of 400 mg /L 48． 282
铅胁迫 800 mg /L的向日葵幼苗 Lead stress sunflower seedling of 800 mg /L 46． 221
2． 3 不同浓度铅胁迫对向日葵幼苗蛋白影响的双
向电泳分析
试验采用 ImagemasterTM2D Platinum 软件检测
分析双向电泳图谱，半自动检测蛋白点，即人工对自
动检测的蛋白点校对和剔除。试验重复 3 次双向电
泳，经软件分析结果相似，得到较为可靠的结果。软
件检测到对照处理的向日葵幼苗全蛋白双向电泳图
谱中蛋白点为 148 个，铅胁迫 400 mg /L的向日葵幼
苗蛋白点为 135 个，铅胁迫 800 mg /L的向日葵幼苗
蛋白点为 137 个;匹配完全相同蛋白点数 65 对，差
异蛋白点占总蛋白点比率分别为:56%，51． 9%，
52. 6%，差异倍数为 2 倍以上的 9 个。本试验针对
差异倍数 2 倍以上的蛋白点进行分析，蛋白点 1、2
均在图 4-A中有表达，在图 4-B、C中未见表达;蛋白
点 3、4 在图 4-B、C 中表达量明显高于 A 中的表达
量;蛋白点 5 在图 4-C中表达量明显低于在 A、B 中
的表达量;蛋白点 6 在图 4-B、C 中的表达量明显低
于在 A中的表达量;蛋白点 7、8 在图 4-C中有表达，
在 A、B中未见表达。对这些蛋白点的等电点范围
和分子量范围进行分析，与 http:/ /www． arabidopsis．
org /蛋白数据库查询对比蛋白点的基本功能后［15］，
初步推测部分蛋白点结果见表 2，其中变化最为显
著的蛋白点 8 推测为与感应蛋白有关的激酶［16］。
A、B、C 分别为铅胁迫浓度 0，400，800 mg /L向日葵幼苗全蛋白的双向电泳。
A，B，C of lead stress concentration 0，400，800 mg /L sunflower seedling protein on two-dimensional electrophoresis，respectively．
图 4 不同浓度铅胁迫后向日葵幼苗蛋白双向电泳
Fig． 4 Different concentrations of lead stress sunflower seedlings protein on two-dimensional electrophoresis
表 2 推断差异蛋白点结果
Tab． 2 Conclude of differences in protein spots results
蛋白点编号
Protein
spots No．
蛋白描述
Protein description
分子
量 /kDa
Mass
1 核糖体蛋白 Ｒibosomal protein S8 (chloroplast) 15． 678
3 MGMT家族蛋白 MGMT family protein (Pseudomonas syringae pv． helianthi) 12． 734
6 过氧化物酶 Peroxidase，partial (Helianthus annuus) 10． 337
7 假定叶绿体 ＲF1 Hypothetical chloroplast ＲF1 (chloroplast) (Helianthus annuus) 20． 458
8 双组分管理系统(感应蛋白)Two-component system regulatory protein(Pseudomonas syringae pv． helianthi)21． 197
64 华 北 农 学 报 31 卷
3 讨论
3． 1 不同浓度铅胁迫对向日葵幼苗蛋白二级结构
的影响
本试验采用傅立叶红外光谱法检测了不同浓度
铅胁迫后向日葵幼苗根、茎、叶蛋白二级结构，试验
结果发现，向日葵幼苗根、茎、叶的蛋白二级结构中
无规则卷曲结构对铅胁迫最为敏感，变化比率较大;
由整个植株的比值可看出，从对照处理到 400 mg /L再
到 800 mg /L铅胁迫处理的向日葵幼苗的 1 655 cm －1 /
1 637 cm －1比值总体呈先上升后下降的趋势，表明一
定浓度的铅胁迫处理可以使向日葵幼苗的 H 键数
增加，蛋白二级结构更加稳定，而铅胁迫超过一定程
度后，向日葵幼苗的蛋白二级结构由于受损伤程度
较为严重致使蛋白二级结构趋于松散。因此，由红
外光谱检测说明了在浓度为 400 mg /L 的铅胁迫以
内可以使向日葵幼苗的蛋白二级结构更趋于稳定。
这一结果为研究向日葵抵御逆境胁迫提供新途径。
3． 2 不同浓度铅胁迫对向日葵幼苗蛋白表达的影响
本试验综合前人经验［16 － 19］，通过对不同浓度铅
胁迫处理的向日葵幼苗全蛋白进行双向电泳分析，
经过 ImagemasterTM2D Platinum 软件匹配差异蛋白
点后，针对其中差异显著的 9 个差异蛋白点进行研
究。根据蛋白点的等电点范围和分子量范围进行分
析，与蛋白数据库查询对比蛋白点的基本功能后，初
步推测出部分蛋白点的结果，其中变化较为显著的
蛋白点推测为感应蛋白相关的激酶，蛋白激酶是基
于环境条件改变后，生物体受到刺激发生相应的改
变而产生的联合机制，主要由感应蛋白和转录激活
蛋白组成，这种蛋白可以使生物体在受到逆境环境，
如干旱、高 /低温、盐胁迫、重金属胁迫后，做出相应
的保护反应［20］。其他蛋白点还需要进一步深入研
究，例如通过质谱分析或对氨基酸序列分析，可以对
这些蛋白点的生理生化功能有更加具体的了解。
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