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扁穗牛鞭草花粉生活力检测方法的比较
陈灵鸷 ,杨春华 ,黄慧君
(四川农业大学 动物科技学院 ,四川 雅安　625014)
摘　要:利用碘-碘化钾(I2 -KI)法 、氯化三苯基四氮唑(TTC)法及过氧化物酶法测定了扁穗牛鞭草(hem-
ar thria compressa)的花粉生活力。结果表明:碘-碘化钾法不适合扁穗牛鞭草花粉生活力的检测 , TTC 法和
过氧化物酶法能有效快速的测定花粉活力 ,适合扁穗牛鞭草花粉生活力的检测和定性分析。
关键词:扁穗牛鞭草;花粉;生活力;检测方法
中图分类号:Q- 33;S54　　文献标识码:B　　文章编号:1002-4956(2009)01- 0039- 03
Comparison of detection methods for pollen viability of Hemarthria compressa
Chen Lingzhi , Yang Chunhua , Huang Huijun
(College o f Animal Science and Technolog y , Sichuan Ag ricultural Univer sity , Yaan 625014 , China)
Abstract:The po llen v iability o f Hema rthria compressa w as de tected by methods of iodine-io dide kalium , t ri-
pheny ltet razo lium chlo ride(TTC), and ox ide-enzyme method.The results show that the me thod of iodine-io-
dide kalium was not able to de tect the pollen viability of H emarthria compressa.The me thods of t ripheny ltet-
razo lium chlo ride and oxide-enzyme w ere suitable for detection of pollen v iability o f Hemar thria compressa and
qualita tive analy sis.
Key words:hemar thria compre ssa;pollen;v iability;de tection methodÈ
收稿日期:2007- 09- 26　修改日期:2007- 12- 14
作者简介:陈灵鸷(1983—),女 , 四川省成都市人 ,硕士研究生 , 从事草
地生态与草坪学研究
通信作者:杨春华(1969—),女 ,四川省绵阳市人 ,博士 ,教授
基金项目:四川省科技厅应用基础研究项目(05JY029- 034- 2);四川省
科技厅农转资金项目(05EFN21510024).
　　扁穗牛鞭草(hemar thria compressa)是目前南方
地区人工草地建植及生态恢复重建的主打草种。由于
扁穗牛鞭草在野生状态和人工栽培条件下结实率很
低 ,生产上广泛使用的扁穗牛鞭草品种均由无性系选
择产生 ,也多采用无性繁殖的方式进行扩繁 。但无性
繁殖耗费大量人力 、物力和财力 ,给生产实际应用带来
了困难。生产上迫切需要扁穗牛鞭草种子。花粉是种
子植物的雄配子体 ,在有性繁殖中扮演着重要角色 ,对
扁穗牛鞭草花粉的研究对其繁殖特性 、结实率等方面
具有重要的理论和现实意义。
测定花粉生活力的方法有很多 ,国外报道的方法
主要包括染色法 、离体萌发法和活体萌发法等 3
类[ 1-3] 。每种方法都有不同的使用范围 , 不同特性的
花粉应选择不同的方法[ 2] 。目前 ,对于扁穗牛鞭草花
粉生活力的研究很少[ 4] ,研究者均采用 I2 -KI 法进行
染色 ,得到的结论有一定差异 ,因此 ,有必要对扁穗牛
鞭草花粉生活力的测定方法进行比较。本研究用 I2 -
KI法 、TTC 法及过氧化物酶测定法对扁穗牛鞭草花
粉生活力进行测定 ,以期筛选出快速准确地测定其花
粉生活力的方法 ,为扁穗牛鞭草繁殖特性研究提供理
论和实验依据。
1　材料
2007年 7月至 8月 ,采集四川农业大学草业科学
基地上种植 3年的“广益”扁穗牛鞭草花序。取花序中
上部无柄小穗小花颖片展开后露出的尚未开裂的
花药 。
2　实验方法
2.1　I2 -KI法
配制 I2 -KI溶液:将 3 g 碘化钾溶于蒸馏水中 ,
再加入 1 g 碘 ,然后定容至 100 mL。取尚未开裂花药
于干洁载玻片上 ,滴加 I2 -KI溶液 1滴 。用解剖针将
花药壁撕裂 ,充分释放出花粉粒后用盖玻片盖上待
观察 。
2.2　氯化三笨基四氮唑染色法(TTC法)
染色溶液配制:在 100 mL 蒸馏水中 ,溶解 0.832
ISSN 1002-4956
CN11-2034/ TÈ 　　　　　　　　 　　　 实　验　技　术　与　管　理E xperim ental Technology and Managem ent　　　　　　第 26卷　第 1期　2009年 1月Vol.26　No.1　Jan.2009
　　　
g 磷酸氢二钠和 0.273 g 磷酸二氢钾 ,调整 pH 值为
7.17 ,制得磷酸缓冲液。然后 ,称取 0.02 g T TC并溶
解在 10 mL 的磷酸缓冲液中 ,溶液配好后装入棕色滴
瓶内 ,置于暗处 。
取尚未开裂花药于干洁载玻片上 ,滴上述 T TC
溶液 1滴 。用解剖针将花药壁撕裂 ,充分释放出花粉
粒后用盖玻片盖上待观察 。
2.3　过氧化物酶测定法
试剂 Ⅰ为 0.5%联苯胺 、0.5%α-萘酚和 0.25%
碳酸钠的等体积混合溶液 ,试剂 Ⅱ为 0.3%过氧化氢
溶液 。
取尚未开裂花药于干洁载玻片上 ,分别滴加试剂
Ⅰ和试剂 Ⅱ各 1滴 。用解剖针将花药壁撕裂 ,充分释
放出花粉粒后用盖玻片盖上待观察 。
2.4　热杀死处理对照
准备 3张撒有花粉的载玻片置于铺有湿润滤纸的
培养皿中 ,置于 80 ℃恒温烘箱中进行热杀死处理 ,2 h
后取出 ,滴加以上 3种试剂 ,在显微镜下统计花粉生
活力 。
在 Olympus显微镜 40倍视野下观察 ,每张载玻
片观察 5个视野 ,统计着色花粉粒数和未着色花粉粒
数。每个视野花粉粒总数应大于 50 ,每种染色方法重
复 3次 ,结果取平均 ,用以下公式计算花粉生活力百分
比:花粉生活力(%)=(被染色花粉粒数/花粉粒总数)
×100%。
运用 Excel进行数据整理和统计分析 ,其中差异
性检验均采用 t -检验。
3　结果与分析
正常的`广益扁穗牛鞭草花粉粒通常呈球形或椭
球形 ,具有较光滑的外壁纹饰 ,稍有起伏 ,个体大小近
似 ,自然状态下呈淡黄色 。多数植物正常的成熟花粉
粒积累较多的淀粉 , I2 -KI 溶液可以将其染成蓝色 ,
发育不良的花粉常呈畸形 ,往往不含淀粉或积累淀粉
极少 , I2 -KI 溶液染色呈黄褐色[ 5] 。
在显微镜下观察到 ,经 TTC染色后花粉粒出现红
色 、淡红色和无色3种颜色反应。这是因为具有活性的
花粉细胞产生的辅酶———烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
(NADH2或 NADPH2)可以将无色的 TTC 还原成红色
的 TTF而使本身染成红色 ,活力较差的被染成淡红色 ,
而无活力的花粉因呼吸作用较弱 ,颜色变化不明显[ 5] 。
关于 TTC染色剂的配置方法有很多种 ,通过多次预备
实验后发现 0.2%的 T TC溶液(0.02 g TTC粉 10 mL ,
pH=7.17磷酸缓冲液)着色效果最佳 ,但是由于呼吸作
用还原需要一定时间 ,实验时需染色 10 ～ 30 min。
过氧化物酶测定法处理的花粉在显微镜下同样出
现红色 、浅红色和无色 3种颜色反应。分析认为:具有
生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶 ,此酶能催化过
氧化物多酚和芳香族胺产生红色物质而将花粉染成红
色[ 6] ;活力弱的花粉含有过氧化物酶较少 ,只能催化少
量过氧化物多酚和芳香族胺而被染为淡红色;无活力
的花粉不含过氧化物酶 ,因此不能产生催化反应。
通过以上 3种方法测定同样的 6份扁穗牛鞭草花
粉样品得到的数据见表 1。经统计分析 , I2 -KI 法与
T TC法 、过氧化物酶测定法在测定扁穗牛鞭草花粉生
活力时存在极显著差异(p <0.05),而 TTC 法和过氧
化物酶法差异不显著(p >0.05)。
表 1　3 种方法测定扁穗牛鞭草花粉生活力差异检验
染色方法 平均值% 标准差%È 样本量
I2-KI 法 90.36 3.77 6È
TTC法 77.85 3.04 6
过氧化物酶法 81.99 4.17 6È
　　对照实验用高温杀死花粉后 ,没有花粉粒能与
T TC和过氧化物多酚 -芳香族胺产生红色反应 ,而
I2 -KI法染色后仍有大部分的花粉粒被 I2 -KI 染上
蓝黑色 。分析认为:花粉细胞在退化 、失活后 ,其细胞
中积累的淀粉并未解离 ,遇碘同样呈蓝黑色反应 ,因而
I2 -KI溶液染色法不适用于对扁穗牛鞭草花粉活力的
测定。相对而言 , TTC 法和过氧化物酶测定法能更有
效地反映扁穗牛鞭草花粉的生活力状况 。
4　讨论
花粉是种子的雄配子体 ,在有性繁殖中发挥着重
要作用 ,花粉具有活力是完成受精的必要条件[ 7] 。因
此 ,准确测定花粉的活力在植物有性生殖研究中十分
重要 。利用染色法进行花粉生活力测定具有快速简便
的优点 ,但受花粉自身特性的影响较大 ,如:花粉壁的
厚薄 ,花粉外壁的组成物质 ,花粉内各种酶活性的强弱
以及实验环境等[ 2 , 8] 。因此不同的染色法只适合某些
植物花粉生活力的测定。 I2 -KI 法 、TTC 法检测花粉
生活力因其简单易操作 ,是应用较多的 ,但是很多研究
都认为 I2 -KI法并不适合做花粉活力的测定[ 2 , 5] 。 I2
-KI法测定花粉活力时 ,其着色程度受花粉壁的厚薄
和花粉内支链淀粉和直链淀粉比例高低决定 。棉花花
粉用 I2 -KI 染色就不着色[ 9-10] 。对羊草[ 11] 、牛尾
草[ 12] 、俄罗斯新麦草[ 13] 的研究表明 ,失活和退化的花
粉细胞中含有的淀粉仍然会被染为蓝黑色。同时 ,花
粉粒的结构对染色效果也有影响 ,如紫薇花粉外壁有
许多细长的绒毛会影响 I2 -KI 和 T TC溶液的染色效
果[ 14] 。T TC法对很多植物的花粉均能达到较好的染
色效果 ,如羊草[ 11] ,重楼[ 15] ,百合花[ 5] ,芍药[ 16] ,刺五
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加[ 17]等 。也有研究表明 , T TC 法不能用于无芒稗 、高
羊茅的花粉生活力测定[ 1 , 8] 。红雨[ 18] 等运用过氧化物
酶法测定了蒙古扁桃花粉活力 ,汤日圣[ 19] 等将该法用
于测定高温对不同水稻品种花粉活力的影响 ,而宋小
林[ 8]等认为过氧化物酶法对不同的植物花粉染色深浅
不同 ,且对不同植物有活力的花粉和没有活力的花粉
着色差异很大。有时对一种植物而言被染色的为有活
力的 ,有时对另外一种植物则不被着色的为有活力
的[ 20] 。杨琴军[ 21] 等人对含笑花粉活力的测定中得
出 , TTC 法与萌发测定不相关 ,且染色的界限不明显 ,
可能造成测定值存在一定的误差 ,因此这种方法只适
合做定性分析。
对于花粉生活力的定量分析 ,常采用培养基培养
法[ 1 , 22] 。国外也有学者利用粒子计数器测量花粉大小
来研究其生活力的[ 23] 。培养基培养法被认为适合于
任何植物花粉生活力的测定[ 22] 。对高羊茅[ 1] 、匍匐翦
股颍[ 24] 、水稻[ 25] 、玉米[ 26] 的研究表明 ,不同花粉适用
的培养基构成不同 。目前 ,还没有扁穗牛鞭草适合的
花粉培养基的研究 ,在这方面需要进一步努力 ,以期为
进一步的定量分析做铺垫 。
5　结论
I2 -KI法与另外 2种染色法在测定扁穗牛鞭草
花粉生活力时存在显著差异。花粉热杀死对照实验表
明 , I2 -KI 法不适合用于扁穗牛鞭草花粉活力的测
定。T TC法和过氧化物酶法操作快速简单 ,可作为测
定扁穗牛鞭草花粉生活力的简便方法。但是由于环境
因素对该方法的测定结果有一定影响 ,故只能用于做
定性分析 。用 TTC 法测得扁穗牛鞭草花序中上部无
柄小穗小花花粉生活力为 77.85%。
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