全 文 ：　 　 2011 , Vol.28 No.1化学与生物工程
Chemistry &Bioengineering50
基金项目:陕西省教育厅重点实验室基金资助项目(08JZ08),宝鸡文理学院院级重点项目(ZK0844)
收稿日期:2010-09-26
作者简介:王晓梅(1962-),女 , 陕西宝鸡人 ,博士 , 副教授 ,从事植物药的基础与应用研究。
doi:10.3969/ j.issn.1672-5425.2011.01.016
火焰子生物碱对酪氨酸酶的抑制作用
王晓梅 ,赵立芳 ,罗小林
(宝鸡文理学院化学化工系 陕西省植物化学重点实验室 ,陕西 宝鸡 721013)
摘　要:以磷酸缓冲溶液为反应体系 、以左旋多巴为底物 , 采用分光光度法研究了火焰子生物碱对马铃薯酪氨酸酶
活性的影响。结果表明 ,火焰子生物碱对马铃薯酪氨酸酶有抑制作用 , 抑制作用随着浓度的增大而增强 , 当火焰子生物
碱浓度为 1.25 mg·m L-1时 , 抑制率达最大 , 为 29.27%, 导致酶活力下降一半所需的抑制剂浓度(IC50)为 0.93 mg ·
mL-1 , 其抑制作用为可逆性非竞争性抑制。
关键词:火焰子;生物碱;酪氨酸酶;抑制
中图分类号:Q 946.88　　　　　文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2011)01-0050-03
　　火焰子 ,又名金牛七 、千锤打 、羊角七 、蔓乌药(陕
西)、草乌(宁夏 、青海),为毛茛科松潘乌头(Aconi tum
sungpanense hand .-maz z .)的块根。分布于陕西 、甘
肃 、四川 、宁夏 、青海等地 。其性温 ,味辛 、苦 ,有大毒。
具有祛风止痛 、散瘀消肿之功效。民间常用于治疗跌
打损伤 、风湿 、类风湿性关节炎等引起的疼痛 。
酪氨酸酶广泛存在于动植物及人体中 ,是生物体
合成黑色素的关键酶[ 1] 。具有单酚酶活性 ,可以将酪
氨酸羟化形成 L-多巴(L-Dopa),也具有二酚酶活力 ,
将 L-多巴氧化成多巴醌 ,进而生成一系列色素物质。
酪氨酸酶的活性与人体皮肤黑色素生成 、果蔬的褐变
等密切相关 ,酪氨酸酶的异常表达可引起各种各样的
皮肤病 、黑色素瘤 、神经退行性病变等 。因此 ,合适的
酪氨酸酶抑制剂对防治以上疾病的发生及果蔬保鲜具
有重要的意义。作者就火焰子生物碱对酪氨酸酶的影
响进行了探讨 ,以期为火焰子的进一步开发利用提供
实验依据 。
1　实验
1.1　材料 、试剂与仪器
火焰子 ,产自秦岭太白山区 ,经陕西中医学院胡本
祥教授鉴定。马铃薯 ,市售。
左旋多巴(L-Dopa)片 ,产品批号:080402 ,上海福
达制药有限公司 。所用试剂均为分析纯 ,实验用水为
双蒸水。
UV-2550型紫外可见分光光度计 , 日本岛津公
司;800B型电动离心机 ,上海安亭科学仪器有限公司;
BS-244-SS 型电子天平 ,赛多利斯科学仪器(北京)有
限公司;DK-98-1型电热恒温水浴锅 ,天津市泰斯特仪
器有限公司;R-1002 型旋转蒸发仪 ,郑州长城科工贸
股份有限公司。
1.2　方法
1.2.1　火焰子生物碱的制备[ 2 , 3]
取火焰子粉末 200 g ,用碱化甲醇(无水甲醇经氢
氧化钠碱化至 pH 值 10)2000 mL 浸泡 24 h ,加热回
流 4 h ,用 0.4 mol ·L-1盐酸稀释至 pH 值为 2 ,过滤
弃去沉渣 ,酸性溶液用等体积的石油醚洗涤 3次 ,酸液
加碱液碱化至 pH 值为 10 ,弃去沉淀 ,溶液用等体积
的氯仿萃取 6次 ,氯仿液再用水洗涤 2次 ,蒸干溶剂即
得火焰子生物碱 。
1.2.2　酪氨酸酶液的制备[ 4 , 5]
将洗净的土豆预冷 ,去皮 ,切碎 。在预冷的研钵中
放入 10 g 马铃薯 ,加入预冷的 7.5 mL pH 值 7.2的
磷酸缓冲溶液 ,研磨至匀浆。用两层纱布滤出提取液 ,
立即于3000 r ·min-1离心 5 min 。取上清液用 pH 值
7.2的磷酸缓冲溶液定容至 100 mL ,即得酪氨酸酶
液。2 h 内用完。
1.2.3　火焰子生物碱对酪氨酸酶活性影响的测定[ 6 , 7]
在酪氨酸酶反应生成黑色素的过程中 ,酪氨酸酶
的催化作用主要发生在酪氨酸转化为多巴以及多巴转
王晓梅等:火焰子生物碱对酪氨酸酶的抑制作用/ 2011 年第 1 期 　51　
化为多巴醌这两个反应中。多巴醌是有色物质 ,可以
用分光光度计(475 nm)测定 。准确吸取火焰子生物
碱溶液 、pH 值 6.8 的磷酸缓冲溶液和 0.010 mol ·
L-1 L-Dopa溶液 ,在 10 mL 比色管中充分混合 ,于室
温下静置 10 min后 ,加入酪氨酸酶液混匀 ,迅速转移
到比色皿中 ,以 pH 值 6.8的磷酸缓冲溶液为参比 ,在
475 nm处测吸光度 ,每 30 s测一次 ,共测 20 min。反
应液组成见表 1。
表 1 反应液的组成/mL
Tab.1 Composition of reaction solution/mL
反应液组成 体系编号
A B C D
火焰子生物碱溶液 0 0 1 1
pH 值 6.8的磷酸缓冲溶液 4 5 3 4
0.010 mol· L -1 L-DOPA 溶液 1 1 1 1
酪氨酸酶液 1 0 1 0
总体积 6 6 6 6
酪氨酸酶活性的抑制率按下式计算:
抑制率=(ODA -ODB)-(ODC -ODD)
ODA -ODB ×100%
式中:ODA 为有酪氨酸酶但无火焰子生物碱反应
体系的吸光度;ODB 为既无酪氨酸酶也无火焰子生物
碱反应体系的吸光度;ODC 为同时有酪氨酸酶和火焰
子生物碱反应体系的吸光度;OD D 为有火焰子生物碱
但无酪氨酸酶反应体系的吸光度。
通过测定酶催化反应体系的 OD 475随时间变化的
增长直线 ,由直线斜率计算出酶活力。分析不同浓度
火焰子生物碱对酶活性的影响 。
酶活力单位(U)定义为每分钟催化 1 μmol底物
转变成产物所需的酶量。
1.2.4　火焰子生物碱对酪氨酸酶作用机理的判定[ 6 , 7]
采用 1.2.3的方法 ,所加试剂顺序和总体积不变 ,
测定在含有不同浓度火焰子生物碱的体系中 , 酶量
(0.5 mL 、1.0 mL 、1.5 mL 、2.0 mL 、2.5 mL)与酶促
反应速率间的关系 ,以相对酶活力对酶量作图 ,判断火
焰子生物碱对酪氨酸酶的作用机理 。
固定酶浓度 ,改变底物(L-Dopa)浓度(0.005 mo l
·L-1 ,0.010 mol· L-1 , 0.015 mo l· L-1 , 0.020 mo l
·L-1 , 0.025 mo l· L-1),测定不同浓度火焰子生物
碱对酶促反应速率的影响 ,由 Linew eaver-Burk 双倒
数法作图 ,判断其抑制类型。
2　结果与讨论
2.1　火焰子生物碱对酪氨酸酶活力的影响(图1 、图 2)
由图 1可知 ,火焰子生物碱对酪氨酸酶有抑制作
用 ,随浓度的增大 ,抑制率增大;当火焰子生物碱浓度
为 1.25 mg ·mL-1时 ,抑制率达最大 ,为 29.27%。由
图 2可知 ,酪氨酸酶相对酶活力随着生物碱浓度的增
大而下降 ,当火焰子生物碱浓度为 0.25 mg ·mL-1
时 ,相对酶活力为 81%;当火焰子生物碱浓度为 1.25
mg ·mL-1时 ,相对酶活力为 39%;导致酶活力下降一
半所需的抑制剂浓度(IC50)为 0.93 mg ·mL-1 。
2.2　火焰子生物碱对酪氨酸酶抑制作用机理(图 3)
图 3　火焰子生物碱对酪氨酸酶抑制机理的判定
Fig.3　Inhibition mechanism of alkaloids in ASH on tyrosinase
由图 3可知 ,以相对酶活力对酶量作图得到一组
通过原点的直线 ,随着火焰子生物碱浓度的增大 ,直线
斜率降低 ,表明火焰子生物碱对酪氨酸酶的抑制作用
属于可逆性抑制 ,即火焰子生物碱是通过抑制酶活力
而引起催化效率的降低 ,而不是通过减少有效酶量导
致酶活力下降。
　王晓梅等:火焰子生物碱对酪氨酸酶的抑制作用/2011 年第 1 期52　
2.3　火焰子生物碱对酪氨酸酶的抑制类型(图 4)
图 4　火焰子生物碱对酪氨酸酶的抑制类型
Fig.4　Type of inhibition of alkaloids in ASH on tyrosinase
由图 4可知 ,火焰子生物碱作为酪氨酸酶的抑制
剂 ,酶促反应的最大反应速度 Vmax随抑制剂浓度的增
大而降低 ,各浓度火焰子生物碱的直线在横轴上的截
距均与无抑制剂时相同 ,即抑制剂不改变酶促反应的
表观 K m 值 ,其抑制类型为非竞争性。即火焰子生物
碱与酪氨酸酶活性中心以外的必需基团结合 ,不影响
酶与 L-多巴的结合 ,酶和 L-多巴的结合也不影响酶与
火焰子生物碱的结合 ,但酶-L-多巴-火焰子生物碱
复合物不能进一步释放出产物 ,从而抑制了多巴向多
巴醌及向黑色素的转化。
2.4　讨论
黑色素的合成与酪氨酸酶密切相关 。体内酪氨酸
在酪氨酸酶催化下生成 3 , 4-二羟基丙苯氨酸即 L-多
巴 , L-多巴进一步氧化生成多巴醌 ,多巴醌经多聚化反
应与氧化反应生成多巴色素 ,多巴色素再进一步转化 ,
最后形成黑色素 ,酪氨酸酶活性的异常直接影响体内
黑色素的生成。火焰子含有多种生物碱 ,其中以二萜
类生物碱为主[ 8] ,生物碱大多具有明显的生物活性 ,其
药理作用最突出的有抗肿瘤作用 、止痛作用 、肌肉松弛
作用以及抗菌 、抗疟作用等 。本实验从酶学角度探讨
了火焰子生物碱的活性 ,发现其对酪氨酸酶活性具有
抑制作用 ,且抑制作用与生物碱浓度有相关关系 ,导致
酶活力下降一半所需的抑制剂浓度(IC50)为 0.93 mg
·mL-1 。其抑制作用为非竞争性的可逆性抑制。本
实验结果为火焰子应用范围的扩大及进一步的开发提
供了一定的依据 。
3　结论
以磷酸缓冲溶液为反应体系 ,以左旋多巴为底物 ,
采用分光光度法研究火焰子生物碱对马铃薯酪氨酸酶
活性的影响。结果表明 ,火焰子生物碱对马铃薯酪氨
酸酶有抑制作用 ,抑制作用随着浓度的增大而增强 ,当
火焰子生物碱浓度为 1.25 mg ·mL-1时 ,抑制率达最
大 ,为 29.27%,导致酶活力下降一半所需的抑制剂浓
度(IC50)为 0.93 mg ·mL-1 ,其抑制作用为可逆性非
竞争性抑制。
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Inhibition of Alkaloids in Aconitum Sungpanense Hand .-mazz .
on Tyrosinase Activity
WANG Xiao-mei ,ZHAO Li-fang , LUO Xiao-lin
(Shanxi Prov ince Key Laboratory of Phy tochemistry , Department of Chem istry and Chemical
Engineering , Baoj i Universi ty o f Arts and Sciences , Baoj i 721013 , China)
Abstract:With pho sphate buffer as react ion sy stem and L-dopa as subst rate , inhibition on ty rosinase activ-
i ty of alkaloids in Aconi tum sungpanense hand .-mazz .(alkaloids in ASH)was studied by spect rophotometry.
The results show ed that alkaloids in ASH could inhibit ty ro sinase act ivity , and inhibit ion effect increased w i th
concentration o f alkaloids in ASH.When the alkaloids concentration w as 1.25 mg ·mL-1 , the inhibition rate
reached 29.27%, IC50 was 0.93 mg ·mL-1 .The inhibi tion w as reversible and non-competi tive.
Keywords:Aconi tum sung panense hand.-mazz ;alkaloids;tyro sinase;inhibi tion