全 文 ：Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2011 November，Vol．22 No．6
fit16 E:\输出 \排版 \中药新药 \2011年 \5期 刘晓星 new16\9-18\AS110800127
收稿日期：2011-08-31
作者简介：张华林，男，博士，工程师，中山大学/广东环球制药有限公司联合博士后，研究方向：中药新药开发。Email：zhanghualin303@163.
com。通讯作者：项辉，副教授，研究方向：神经药理学。
基金项目：广东省省部产学研结合项目（2008B090500028）。
·质量分析研究·
课题组之前从五加科植物三七 Panax notoginseng
（Burk.） F.H.Chen 的叶子中提取、精制得到三七叶提
取物 PnGL，通过三种动物抑郁模型进行抗抑郁活性
评价，发现 PnGL 100 mg / kg 具有显著的抗抑郁作
用；而进一步的药理实验发现其作用机制与目前常
用的化学治疗药物有很大的不同，即可能与五羟色
胺能系统、去甲肾上腺素能系统以及多巴胺能系统
等三种神经递质能系统密切相关，PnGL具有开发成
三七叶抗抑郁活性提取物 PnGL中皂苷类成分分析
张华林 1，2，郭 静 2，袁春平 2，项 辉 1，古练权 1（1. 中山大学，广州 510006；2. 广东环球制药有限公司，
广东 佛山 528305）
摘要：目的 建立三七叶抗抑郁活性提取物 PnGL中皂苷类成分含量测定的方法。方法 采用香荚醛-高氯酸
比色法，分别以人参二醇及人参皂苷 Rb3为对照品，测定总皂苷的含量。采用 HPLC法，Ultimate AQ-C18色谱
柱，甲醇-水（69 ∶ 31）为流动相，检测波长 203 nm，柱温为 25 ℃，同时测定 PnGL中主要成分人参皂苷 Rb1、
Rb2、Rc、Rb3的含量。结果 以人参二醇及人参皂苷 Rb3为对照品所测定的总皂苷含量，分别为 97.25 %、
95.76 %，差异不大。HPLC检测基线平稳，人参皂苷 Rb1、Rb2、Rc、Rb3分离良好，分离度 1.5以上，平均加
样回收率分别为 99.24 %（RSD=1.63 %）、96.41 %（RSD=1.21 %）、96.81 %（RSD=0.86 %）、100.16 %（RSD=1.84
%）。结论 含量测定方法准确、重复性好，可为 PnGL质量控制提供依据。
关键词：抑郁；三七叶皂苷；比色法；高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：1003-9783（2011）06-0652-04
Saponin Components Analysis of Antidepressant Extract PnGL from Leaves of Panax Notoginseng
ZHANG Hualin1，2， GUO Jing2， YUAN Chunping2， XIANG Hui1， GU Lianquan1 （1. Sun Yat -sen University，
Guangzhou 510006，China；2. Guangdong Medi-world Pharmacy Co. Ltd.，Foshan 528305 Guangdong，China）
Abstract：Objective To establish the determination method for saponin components of the antidepressant extract
PnGL from leaves of Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen. Methods The contents of total saponins were determined
by vanillin-perchloric acid colorimetric method with panaxadiol and ginsenoside Rb3 as standard substances. The con－
tents of total ginsenosides Rb1，Rb2，Rc，and Rb3 were determined simultaneously by high performance liquid chro－
matography. The chromatographic conditions were as follows： Ultimate AQ -C18 analytical column， a mixture of
methanol-water（69 ∶ 31）as the mobile phase，detection wavelength at 203 nm，and colunm temperature of 25 ℃.
Results When panaxadiol and ginsenoside Rb3 were as the standard substances， the content of total saponins was
97.25 % and 95.76 % respectively，showing little difference. Ginsenoside Rb1，Rb2，Rc，and Rb3 had been well
isolated by high performance liquid chromatography， and their resolutions were over 1.5 with the stable detection
baseline. The average recovery rate was 99.24 %（RSD =1.63 %），96.41 %（RSD=1.21 %），96.81 %（RSD=0.86 %）
and 100.16 %（RSD=1.84 %） for ginsenoside Rb1，Rb2，Rc and Rb3 respectively. Conclusion The method is reli－
able and reproducible，which provides a reference for the quality control of PnGL.
Keywords：Depression；Total saponins from leaves of Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen；Colorimetric Method；
HPLC
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中药新药与临床药理 2011年 11月第 22卷第 6期
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1. 人参皂苷 Rb1；2. 人参皂苷 Rc；3. 人参皂苷 Rb2；4. 人参皂苷 Rb3
图 1 混合对照品（a） 和 PnGL（b）的 HPLC色谱图
Figure 1 HPLC chromatograms of reference substances（a）and PnGL（b）
t /min t /min
b
3
4
1
2
a
1
3
2 4
多重起效的抗抑郁新型中药新药的潜力 [1-2]。本文采
用比色法以及高效液相色谱法对 PnGL中的皂苷类成
分进行分析，为该活性提取物建立质量标准提供依
据，为研发三七叶抗抑郁新药打下基础。
1 仪器与试药
SHIMADZU 高效液相色谱仪（日本 Shimadzu 公
司，Milli -Q plus system 超纯水仪（美国 Millipore，
Milford，MA），UV-2501PC紫外可见光分光光度计（日本
Shimadzu公司），AL204电子天平（瑞士 MettlerToledo
公司），SB 25-12 DTD超声波仪（宁波新芝生物科技
公司），DK-8B型电热恒温水槽（上海精宏实验设备
有限公司）。
PnGL由广东环球制药有限公司提供；对照品人
参皂苷 Rb1（批号：110704-200318）、人参皂苷 Rb2
（批号： 111715 -200802）、人参皂苷 Rb3（批号：
111686-200501）、人参二醇（批号：0701-9807）均购
自中国药品生物制品检定所；人参皂苷 Rc 对照品
（批号：11021-14-0-100507）购自南京泽朗医药有限
公司；色谱甲醇购自国药集团化学试剂有限公司；
香荚醛、冰醋酸、高氯酸等试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 总皂苷含量测定 参照文献[3]，采用香荚醛-高氯
酸比色法，分别以人参二醇及人参皂苷 Rb3为对照
品，测定 PnGL总皂苷含量。
2.1.1 标准曲线 分别精密称取适量人参二醇、人参
皂苷 Rb3对照品置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻
度，得对照品储备液。分别精密移取人参二醇、人
参皂苷 Rb3对照品储备液 0，30，40，50，60，70，
80 μL，置于磨口具塞试管中，60 ℃水浴挥干溶剂，
加入 0.2 mL 新鲜配制的 5 ％香荚醛-冰醋酸溶液及
0.8 mL高氯酸，摇匀，于 60 ℃恒温水浴 15 min，立
即置冰水浴内冷却，加入冰醋酸 5 mL，摇匀，得到
系列浓度的对照品溶液。以不加人参二醇、人参皂
苷 Rb3对照品的试液做空白对照，按紫外-可见分光
光度法在 560 nm波长处测定吸光度，以吸光度（Y）
对对照品溶液浓度（X）作回归计算，得到回归方程。
人参二醇对照品的线性方程为：Y＝ 4.2143X＋0.0056，
r＝0.9989，线性范围为 0.005～0.013 mg / mL；人参皂
苷 Rb3对照品的线性方程为：Y＝ 4.3744X－0.0116，r＝
0.9990，线性范围为 0.005～0.013 mg/mL。
2.1.2 样品测定 精密称取适量 PnGL（批号：100601）
置于 10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度。精密移取 40
μL置于磨口具塞试管中。按照“2.1.1标准曲线”项
下操作，在 560 nm波长处测定吸光度，计算总皂苷
含量，其中以人参二醇为对照品，其含量计算还要
乘以换算系数 2.0。结果以人参二醇计算，PnGL 总
皂苷的含量为 97.25 %；以人参皂苷 Rb3计算，PnGL
总皂苷的含量为 95.76 %。
2.2 人参皂苷 Rb1、Rb2、Rc、Rb3的含量测定
2.2.1 色谱条件 Ultimate AQ-C18色谱柱（250 mm×
4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇 ∶ 水= 69 ∶ 31，等度
洗脱，流速为 0.7 mL /min，柱温为 25 ℃，检测波长
为 203 nm，进样量为 10 μL。
2.2.2 系列浓度的对照品溶液制备 精密称取人参皂
苷 Rb1、Rc、Rb2、Rb3对照品适量，置于 10 mL容量
瓶中，加甲醇溶解并定容，得对照品储备液。将对
照品储备液逐步稀释，得到系列浓度的对照品溶液。
2.2.3 样品溶液制备 精密称取 PnGL适量，置于 10
mL 容量瓶中，加入适量甲醇，超声溶解，放置室
温，定容，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，弃初滤
液，取续滤液进样。
2.2.4 系统适应性试验 分别精密吸取“ 2.2.2”、
“2.2.3”项下溶液，按“2.2.1”项下条件测定，记录
色谱图，见图 1。由图 1可见，在该色谱条件下，基
线平稳，人参皂苷 Rb1、Rb2、Rc、Rb3可以达到良好
分离，分离度均大于 1.5。
653· ·
Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2011 November，Vol．22 No．6
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2.2.5 线性关系考察 取系列浓度对照品溶液，按照
“2.2.1”项下条件测定，记录各成分的峰面积。以峰
面积 A 和对照品浓度 C（mg/mL）作线性回归，得到
线性方程，结果见表 1。
表 1 人参皂苷 Rb1、Rc、Rb2、Rb3的线性方程
Table 1 Standard curve equations of ginsenoside Rb1，Rc，Rb2
and Rb3
2.2.6 精密度试验 取系列浓度对照品溶液中的任意
一份对照品溶液，连续进样 5 次，测定各成分的峰
面积，分别计算 RSD 值。结果人参皂苷 Rb1、Rc、
Rb2、Rb3的 RSD值分别为 0.75 %、1.24 %、1.54 %、
1.56 %，表明仪器的精密度良好。
2.2.7 稳定性试验 精密称取 PnGL（批号：100601），
按照“2.2.3”项下操作，制备样品溶液，分别在
0，4，8，12，24，36，48 h内进样，测定各成分的
峰面积，分别计算 RSD值。结果人参皂苷 Rb1、Rc、
Rb2、Rb3的 RSD值分别为 1.79 %、2.07 %、2.11 %、
1.36 %，表明样品溶液在 48 h内稳定性良好。
2.2.8 重现性试验 精密称取同一批次 PnGL（批号：
100601），按照“2.2.3”项下操作，平行制备 6份样
品溶液，分别进样，测定各成分的峰面积，分别计
算 RSD 值。结果人参皂苷 Rb1、Rc、Rb2、Rb3 的
RSD值分别为 1.48 %、1.26 %、1.69 %、1.42 %，表
明该含量测定方法重现性良好。
2.2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批
次 PnGL（批号：100601）适量，精密加入各对照品适
量，按照“2.2.3”项下操作，平行制备 6 份样品溶
液，分别进样，测定各成分的峰面积，计算加样回
收率及 RSD值，结果见表 2。
2.2.10 样品测定 按照“2.2.3”样品溶液制备项下
操作，制备样品溶液，测定十批次 PnGL主要成分人
参皂苷 Rb1、Rb2、Rc、Rb3的含量，结果见表 3。
3 讨论
三七茎叶中的皂苷类成分其苷元主要为人参二
醇型，以人参二醇为对照品计算总皂苷含量要乘以
换算系数 [3]。经过换算后，以人参二醇及人参皂苷
Rb3为对照品所计算的 PnGL总皂苷含量，结果分别
为 97.25 %、95.76 %，差异不大。
三七茎叶皂苷类成分的 HPLC-UV含量测定已经
有报道。朱洁 [4]等以乙腈-水为流动相测定了三七叶
总皂苷中人参皂苷 Rb1、Rc、Rb3的含量。崔韩明 [5]
等则测定了三七叶中人参皂苷 Rb1、Re、Rg1及三七
皂苷 R1的含量。由于人参皂苷 Rb1、Rc、Rb3等成分
性质较为接近，给色谱分离带来困难，故此，文献多
采用梯度洗脱的方法，结果产生了基线漂移的现象。
课题组以等度洗脱为基础，对不同流动相体系（乙腈 ∶
水，乙腈 ∶ 磷酸溶液，甲醇 ∶ 水，甲醇 ∶ 磷酸溶液，
乙腈 ∶ 甲醇 ∶ 水等）及不同色谱柱（Ultimate AQ-C18、
Inertsil ODS-3、Venusil XBP-C18、Eclipse XDB-C18-
USP L1、Diamonsil C18等）的分离效果进行筛选比较，
优化 HPLC 色谱分离条件，最后确定采用 Ultimate
AQ-C18色谱柱，甲醇-水（69 ∶ 31）等度洗脱，彻底解
决了基线漂移的问题，而且能够对三七叶皂苷中人
表 2 PnGL加样回收率试验结果
Table 2 Sample-added recovery test results of PnGL
成 分
人参皂苷 Rb1
人参皂苷 Rc
人参皂苷 Rb2
人参皂苷 Rb3
样品量/mg
0.73
0.75
0.72
0.73
0.75
0.72
1.89
1.95
1.86
1.90
1.94
1.88
0.87
0.90
0.86
0.88
0.90
0.87
4.57
4.72
4.50
4.60
4.70
4.54
加入量/mg
0.81
0.81
0.81
0.81
0.81
0.81
2.01
2.01
2.01
2.01
2.01
2.01
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
4.22
4.22
4.22
4.22
4.22
4.22
测得量/mg
1.53
1.56
1.51
1.52
1.57
1.54
3.87
3.89
3.78
3.83
3.89
3.79
1.6
1.63
1.58
1.61
1.61
1.59
8.92
8.87
8.64
8.85
8.96
8.76
回收率 /%
98.89
99.60
97.89
97.07
101.32
100.68
98.53
96.39
95.58
95.92
96.90
95.13
97.18
97.32
96.74
97.75
95.28
96.57
103.01
98.22
98.14
100.70
100.97
99.89
平均值 /%
99.24
96.41
96.81
100.16
RSD/%
1.63
1.21
0.86
1.84
成 分
人参皂苷 Rb1
人参皂苷 Rc
人参皂苷 Rb2
人参皂苷 Rb3
线性方程
Y=2606078X＋30473
Y=2857995X＋23850
Y=2706795X－21909
Y=2878722X＋16545
线性范围 /mg·mL-1
0.082~2.029
0.079~1.979
0. 044~1.107
0.085~2.116
r2
0.9997
0.9998
0.9998
0.9991
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中药新药与临床药理 2011年 11月第 22卷第 6期
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3 讨论
本实验通过建立厚朴SFE提取物和含药血清样品
的 UPLC/Q-TOF-MS分析方法，使各组分得以分离，
高分辨质谱结果、对照品信息和相关文献研究表明
厚朴 SFE提取物的主要成分为木脂素类，其中和厚
朴酚、厚朴酚相对含量最高；而比较了 SD大鼠空白
血清，厚朴 SFE提取物及其含药血清的质谱数据发
现，厚朴 SFE提取物的主要吸收入血成分为厚朴酚，
其他主要化学成分并未检出，说明厚朴酚是在大鼠
体内的直接作用物质。因此进一步通过差谱比较，
结合代谢反应规律、元素组成分析和相关文献，找
到 3个厚朴酚可能的代谢物，分别是其羟基化、葡
糖醛酸化和硫酸化代谢产物，为阐明厚朴 SFE 提取
物的体内药效物质提供了实验依据。
参考文献：
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理学杂志，2000，16（6）：458.
（编辑：修春）
（上接第 651页）
批 号
100601
100701
100702
100703
100925
100926
110215
110216
110217
110218
人参皂苷 Rb1
2.82
3.73
3.84
3.58
3.66
3.29
3.51
3.85
3.74
3.69
人参皂苷 Rc
7.31
9.32
9.39
9.14
8.97
9.12
9.65
9.43
8.91
8.95
人参皂苷 Rb2
3.37
3.15
2.86
3.17
3.01
3.45
3.62
3.88
3.56
3.09
人参皂苷 Rb3
17.69
17.66
17.34
16.22
16.76
16.59
16.78
15.89
17.21
17.33
合 计
31.19
33.86
33.43
32.11
32.40
32.45
33.56
33.05
33.42
33.06
参皂苷 Rb1、Rb2、Rc、Rb3四种性质相似的成分同时
进行测定。
HPLC检测中发现柱温对皂苷成分的保留时间及
分离情况影响较大。分别设定柱温为 35，30，25，
20 ℃进行观察，结果随着柱温的升高，皂苷成分的
保留时间延长，分离度更大。以人参皂苷 Rb3为例，
不同的柱温所对应的保留时间分别为 69.436，
65.642， 57.880， 49.250 min，分离度分别为 4.5，
3.6，2.5，0.7。综合保留时间及分离情况的考虑，最
后确定最佳的柱温为 25 ℃。
本文以比色法测定总皂苷含量，以 HPLC法测定
主要皂苷成分的含量，方法准确可靠，可用于三七
叶抗抑郁活性提取物 PnGL的质量控制。
参考文献：
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（编辑：修春）
表 3 不同批次 PnGL 人参皂苷 Rb1、Rb2、Rc、Rb3的含量
测定结果（%）
Table 3 Content determination results of ginsenoside Rb1，Rb2，
Rc and Rb3 in different batches of PnGL（%）
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
655· ·