全 文 ：[中药指纹图谱 ]
乌骨藤药材 HPLC指纹图谱研究
赵陆华 1, 2 , 　相秉仁 1, 2＊ , 　陆红柳 1, 2
(1.药物质量安全与预警教育部重点实验室 ,江苏 南京 210009;2.中国药科大学分析测试中心 ,江苏 南京
210009)
收稿日期:2007-09-18
基金项目:江苏省自然科学基金资助项目(No.BK2005100)。
作者简介:赵陆华(1950-),女 ,副研究员 ,研究方向:中药分析 ,电话:025-83271185, E-mail:zhaoluhua@hotmail.com。
＊通讯作者:相秉仁 ,教授 ,博士生导师 ,电话:025-83271180。
关键词:乌骨藤药材;指纹图谱;HPLC-UV;绿原酸;咖啡酸
摘要:目的:建立乌骨藤药材指纹图谱的 HPLC色谱分析条件 ,确定出两种已知成分 , 为乌骨藤药材内在质量评价积累数
据。方法:采用 HPLC-UV法分析乌骨藤药材的指纹图谱。色谱柱:AlltimaC18;流动相:乙腈-0.1%冰醋酸溶液梯度洗
脱;分析时间:55 min;检测波长:328nm;柱温:30 ℃;流速:1.0 mL/min。结果:共标示出 15个共有峰 , 包括绿原酸 、咖啡
酸和它们部分衍生物 。结论:方法准确可靠 , 可以用于乌骨藤的真伪品的鉴别 , 采用 HPLC指纹图谱技术能有效控制乌
骨藤药材的质量。
中图分类号:R284.1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2008)08-1093-03
HPLCfingerprintanalysisofMarsdeniatenacissima
ZHAOLu-hua1, 2 , 　XIANGBing-ren1, 2＊ , 　LUHong-liu1, 2
(1.KeyLaboratoryofDrugQuality, ControlandPharmacovigilance, MinistryofEducation, Nanjing210009 , China;2.CentreforInstrumentalAnalysis,
ChinaPharmaceuticalUniversity, Nanjing210009 , China)
KEYWORDS:Marsdeniatenacissima;fingerprint;HPLC-UV;chlorogenicacid;cafeicacid
ABSTRACT:AIM:ToestablishthemethodoffingerprintanalysisofMarsdeniatenacissimabyHPLC-UV.
METHODS:AnalysiswasperformedonanAltechC18(4.6 mm×250mm, 5 μm)columnwiththeacetonitrile-
0.1% aceticacidgradient.Fingerprintwasfinishedin55 min.Theflowratewas1.0 mL/min.Themonitoring
wavelengthwasat328 nm.Thecolumntemperaturewas30 ℃.RESULTS:15 peakswereseparatedonHPLC
fingerprintinMarsdeniatenacisimaanalyzedforchlorogenicacid, cafeicacidandpartofderivatives.CONCLU-
SION:Themethodisreliable, accurateandcanbeusedasaqualitycontrolmethodforMarsdeniatenacisima.
　　乌骨藤为萝摩科植物通光散 Marsdeniatenocissima
(Roxb)WightetArn的根 、茎或叶 , 又名为奶浆藤 、通光散 、
大苦藤 、龙爪菜等 ,主要产于云南 、贵州等地。乌骨藤是中药
中常见的药材之一 , 具有清热解毒 、止咳平喘 、利湿通乳 、抗
癌的功效 [ 1] 。近年来 , 乌骨藤及其制剂消癌平注射剂和片剂
广泛用于治疗肺癌 、食道癌 、胃癌 、直肠癌等恶性肿瘤 [ 2, 3] 。
也有专利报道乌骨藤制剂具有抗癌作用 [ 4, 5] 。乌骨藤的主
要化学成分包括酚酸类 、甾体皂苷类 、多糖类 、生物碱类
等 [ 6] 。目前 , 虽有报道乌骨藤药材及制剂测定绿原酸的含量
来控制质量 [ 7 , 8] , 也有报道乌骨藤注射剂指纹图谱的研
究 [ 9] , 但是因产地 、药材部位 、真伪等因素影响 ,尚无较完善
的乌骨藤药材质量评价依据 , 所以本试验进一步采用高效液
相色谱法研究道地产地乌骨藤药材的指纹图谱 ,并通过对照
品比对鉴定出两种主要指标性成分。方法操作简单 , 重现性
好 ,可以作为乌骨藤药材质量控制的有效检测手段。
1　仪器与试药
岛津 LC-10ADVP高效液相色谱仪 , 岛津 SPD-10AVP
检测器 ,浙大 N2000型色谱工作站。乙腈(TEDIA)为 HPLC
级 ,水为乐百氏纯净水。
乌骨藤药材分别收集于云南 、贵州 , 共 10批 , 经中国药
科大学宋学华教授鉴定为正品。
绿原酸 ,咖啡酸对照品由中国药品生物制品检定所提
供。
2　方法与结果
2.1　色谱条件
色谱柱:AlltimaC18(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动相:
1093
2008年 8月
第 30卷　第 8期
中 成 药
ChineseTraditionalPatentMedicine
August2008
Vol.30　No.8
A:乙腈 , B:0.1%冰醋酸溶液 , 梯度洗脱:0 ～ 30 min, B(90%
～ 78%);30 ～ 45 min, B(78% ～ 74%);45 ～ 55 min, B(74%
～ 67%), 分析时间为 55 min。检测波长:328 nm。流速:1.0
mL/min;柱温:30 ℃;进样量 20 μL。
2.2　供试品和对照品溶液的配制
2.2.1　对照品溶液的制备
分别取绿原酸 , 咖啡酸对照品适量 ,加甲醇配成 10 μg/
mL的溶液 ,即得。
2.2.2　供试品溶液的制备
取云南 、贵州 10批乌骨藤药材 ,每批 50 g(其中皮约占
8%,其余为木质部), 粉碎 , 混合均匀 , 取粉末 10 g, 精密称
定 , 加水 200 mL,煎煮 1 h, 滤过 ,药渣再加水 200 mL, 煎煮 1
h,滤过 , 合并两次滤液 , 浓缩 , 加乙醇至 80%, 静置过夜 , 滤
过 , 浓缩 ,转移至 20mL量瓶中 , 甲醇定容 , 0.45 μm微孔滤
膜滤过 , 即得。
2.3　方法学考察
2.3.1　精密度试验
取乌骨藤药材(20050910), 按 2.2.2项下制备供试品溶
液 , 连续进样 6次 , 结果 15个色谱峰相对保留时间的 RSD小
于 0.6%,测得各共有峰相对保留时间 , 相对峰面积的 RSD
小于 1.2%,表明精密度良好。
2.3.2　稳定性试验
取乌骨藤药材(20050910)供试品溶液 , 分别在 0、 2、4、
8、12、24 h时进样 , 结果各共有峰的相对保留时间的 RSD小
于 1.2%, 相对峰面积的 RSD小于 2.3%, 表明样品在 24 h
内稳定。
2.3.3　重复性试验
取乌骨藤药材(20050910)6份 ,精密称定 , 按 2.2.2项
下方法制备供试品溶液分别进样 , 精密称定。结果各共有峰
的相对保留时间 RSD小于 1.3%, 相对峰面积的 RSD小于
2.4%, 显示重复性良好。
2.4　药材标准指纹图谱的建立
取 10批供试品溶液 , 按 “ 2.1”项下进样分析 ,结果 10批
样品共标出 15个共有峰 , 标准指纹图谱见图 1。各共有峰
相对保留时间(以 2号峰为参照峰)见表 1, 共有峰相对峰面
积见表 2。
2.5　相似度计算 [ 10 , 11]
相似度(Similarity)是评价中药指纹图谱的一个重要参
数 ,本试验主要采用药典委员会推荐试用的相关系数和向量
夹角余弦分别计算了 10批乌骨藤道地药材的相似度 , 结果
见表 3。
表 1　 10批乌骨藤药材相对保留时间
Tab.1　 RelativeretentiontimesofcommonpeaksfortenbatchesofM.tenacissima
峰号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 0.607 1.000 1.399 1.343 1.673 1.963 2.088 2.181 2.331 2.544 2.702 2.906 3.187 3.552 3.582
2 0.600 1.000 1.403 1.463 1.684 1.991 2.119 2.206 2.313 2.537 2.726 2.925 3.213 3.557 3.601
3 0.595 1.000 1.408 1.468 1.693 2.003 2.133 2.221 2.329 2.556 2.748 2.949 3.240 3.588 3.634
4 0.600 1.000 1.403 1.463 1.684 1.991 2.119 2.206 2.313 2.537 2.726 2.925 3.213 3.557 3.601
5 0.603 1.000 1.414 1.456 1.663 1.940 2.080 2.162 2.285 2.487 2.682 2.884 3.176 3.534 3.579
6 0.604 1.000 1.412 1.455 1.661 1.937 2.076 2.158 2.280 2.481 2.676 2.877 3.168 3.525 3.570
7 0.604 1.000 1.412 1.455 1.661 1.937 2.076 2.158 2.280 2.481 2.676 2.877 3.168 3.525 3.570
8 0.635 1.000 1.497 1.353 1.693 2.077 2.241 2.240 2.270 2.643 2.830 3.038 3.325 3.767 3.751
9 0.615 1.000 1.437 1.484 1.700 2.027 2.122 2.214 2.318 2.547 2.721 2.911 3.265 3.691 3.638
10 0.596 1.000 1.431 1.457 1.672 1.980 2.129 2.225 2.276 2.508 2.657 2.966 3.267 3.545 3.598
average 0.606 1.000 1.422 1.440 1.678 1.984 2.118 2.197 2.299 2.532 2.714 2.926 3.222 3.584 3.612
RSD/% 1.9 0.0 2.0 3.4 0.9 2.2 2.3 1.4 1.0 1.9 1.8 1.7 1.6 2.2 1.5
表 2　 10批乌骨藤药材相对峰面积
Tab.2　 RelativeareasofcommonpeaksfortenbatchesofM.tenacissima
峰号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
相对保留时间 0.606 1.000 1.422 1.440 1.678 1.984 2.118 2.197 2.299 2.532 2.714 2.926 3.222 3.584 3.612
1 0.124 1.000 0.012 0.028 0.071 0.012 0.012 0.009 0.010 0.094 0.092 0.122 0.012 0.050 0.065
2 0.119 1.000 0.011 0.028 0.068 0.012 0.011 0.009 0.010 0.091 0.093 0.119 0.011 0.049 0.065
3 0.120 1.000 0.011 0.028 0.070 0.013 0.011 0.009 0.010 0.089 0.093 0.121 0.012 0.050 0.067
4 0.114 1.000 0.010 0.027 0.065 0.012 0.012 0.009 0.010 0.089 0.090 0.110 0.011 0.052 0.069
5 0.122 1.000 0.011 0.030 0.071 0.012 0.012 0.009 0.010 0.096 0.091 0.119 0.012 0.051 0.065
6 0.123 1.000 0.011 0.028 0.072 0.012 0.012 0.009 0.010 0.097 0.093 0.120 0.013 0.049 0.064
7 0.126 1.000 0.011 0.028 0.071 0.012 0.012 0.009 0.011 0.097 0.091 0.119 0.012 0.050 0.063
8 0.118 1.000 0.012 0.028 0.068 0.013 0.011 0.009 0.010 0.093 0.092 0.118 0.012 0.054 0.067
9 0.118 1.000 0.011 0.027 0.068 0.012 0.011 0.009 0.010 0.094 0.092 0.116 0.012 0.052 0.066
10 0.118 1.000 0.011 0.028 0.068 0.012 0.012 0.009 0.010 0.093 0.094 0.118 0.012 0.051 0.069
average 0.120 1.00 0.011 0.028 0.069 0.012 0.012 0.009 0.010 0.093 0.092 0.118 0.012 0.051 0.066
RSD/% 2.8 0.0 3.0 2.8 3.0 2.5 2.8 2.5 2.4 3.0 1.3 2.8 3.0 2.9 3.0
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中 成 药
ChineseTraditionalPatentMedicine
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表 3　 不同产地药材指纹图谱的相似度数据
Tab.3　 DegreeofsimilarityofcommonpeaksforM.tenacissimaofdifferenthabitat
相关系数 0.999 5 0.999 6 0.999 5 0.999 4 0.995 9 0.996 0 0.999 2 0.999 3 0.999 2 0.999 0
夹角余弦 0.999 6 0.999 7 0.999 6 0.999 7 0.996 7 0.997 4 0.999 4 0.999 5 0.999 5 0.999 3
图 1　乌骨藤道地药材标准 HPLC指纹图谱
Fig.1　TheHPLCfingerprintofM.tenacissima.
　　结果表明 , 10批乌骨藤道地药材的相似度良好。
2.6　皮与木质部指纹图谱
取乌骨藤药材的皮和木质部 , 分别制成供试品溶液 , 精
密吸取 20μL, 按 “ 2.1”项下进样分析。结果见图 2。
图 2　乌骨藤药材皮和木质部的 HPLC
指纹图谱(a.木质部　b.皮)
Fig.2　TheHPLCfingerprintofM.tenacissima.ofdiffer-
entparts(a.xylem, b.bark)
　　图中 a与 b比较 ,可以看出皮比木质部指纹图谱中的共
有峰高很多 , 说明皮中各个共有峰的化学成分含量比木质部
高 , 所以在标准指纹图谱的建立过程中要求取样均匀 , 如果
取样不均匀将影响指纹图谱的相似度评价 , 也会影响对药材
质量的评价。因此在制备上述标准指纹图谱的取样中 , 控制
皮与木质部的重量比 ,皮的含量控制在 8%左右。
2.7　代用品指纹图谱
取乌骨藤代用药材的供试品溶液 , 按 “ 2.1”项下进样分
析 , 结果见图 3。
图 3　乌骨藤一种伪品的指纹图谱
Fig.3　TheHPLCfingerprintoffakesample
ofM.tenacissima.
　　由图中可以看出 ,该药材的指纹图谱与标准指纹图谱有
显著的不同。
2.8　LC/MS初步归属定性分析
通过 LC/MS3-Trap(-)对指纹图谱中各共有峰分析 ,并
通过与对照品质谱信息比对 ,判断出 2号峰为绿原酸 、3号峰
为咖啡酸;推断 1、6、 7号峰为绿原酸的异构体和类似物 , 但
是还需要采用对照品比对质谱信息来确证。由于绿原酸和
咖啡酸为酚酸类化合物 , 而且分子量不大 , 在负离子模式下
有明显的 [ M-H] -,裂解碎片也比较简单 ,所以在此不作详细
的解析。
3　讨论
3.1　测定波长的选择
在流动相条件下 , 采用二极管阵列检测器(DAD)进行了
200 ～ 400 nm的紫外扫描 , 结果表明 328 nm处峰数较多 、峰
形好 , 低波长处也有较多峰 , 但是低波长处 , 分离欠佳 , 且有
时基线不稳。故考虑在 328 nm处检测 , 得到的指纹图谱重
现性良好。
3.2　流动相及洗脱方式的考察优化
分别考察了甲醇-水 、乙腈-水体系 , 结果发现峰形较差 ,
故考虑在水相中加入适量的甲酸或冰醋酸。 分别考察了
0.1%、0.05%冰醋酸 ,结果表明水相中加入 0.1%的冰醋酸 ,
峰形比较对称 , 且分离良好。分析原因可能为乌骨藤药材中
绿原酸 、咖啡酸等酚酸类成分须在含酸的流动相中才能有良
好的峰形与分离。采用等度洗脱分析时间长且分离效果不
佳 , 无法使共有峰分离良好 , 采用梯度洗脱后 3与 4号峰 、14
与 15号峰基本分开。
3.3　提取条件的考察
由于乌骨藤质地坚硬 ,在提取过程中分别考察了不同浓
度(50%, 80%, 100%)的甲醇 、乙醇超声提取 ,结果所得的谱
图中峰数较少。而选用与制剂工艺一致的水提醇沉方法得
到的谱图峰数较多 ,能够体现较多的成分。
3.4　质谱解析结果讨论
天然存在的绿原酸的异构体较多 , 如绿原酸的同分异构
体隐绿原酸或新绿原酸 , 绿原酸的类似物异绿原酸 A(4, 5-
二咖啡酰奎尼酸)、异绿原酸 B(3, 4-二咖啡酰奎尼酸)、异绿
原酸 C(3, 5-二咖啡酰奎尼酸)。由于质谱在鉴别异构体方
面的缺欠 , 所以在没有对照品对比的情况下 , 1、6、7号峰只能
初步推测为绿原酸的同分异构体或类似物。
3.5　指纹图谱的建立
乌骨藤的道地产地主要为云南 、贵州两省 , 而且在这两
省中产乌骨藤的地级市也较多 ,经实验各地市级产地药材的
指纹图谱差异不明显。 皮与木质部间指纹图谱差异主要因
成分含量所致 ,经与指纹图谱相比 , 皮的部位基本上体现出
共有峰特征 , 而木质部差异较大。由于不同部位的取样差异
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会造成共有峰峰面积大小的变化 , 进而造成真伪的误判 , 所
以本文在制定标准指纹图谱时 ,规定了取样时各部位的重量
百分比。
试验按照标准指纹图谱建立的方法对一个代用品建立
了指纹图谱 , 结果与标准指纹图谱比对 , 能够与道地药材显
著区分出来。乌骨藤的别名较多 , 代用品混乱 ,所以本方法
可以用于乌骨藤药材的真伪鉴别。综上所述 , 本试验建立了
乌骨藤药材的指纹图谱 ,并鉴定出两种主要指标性成分绿原
酸 、咖啡酸 , 方法操作简单 , 重现性好 , 可用于乌骨藤药材的
质量控制 , 并可以区别于其他的代用品和伪品。
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广藿香不同部位 HPLC指纹图谱的比较研究
黄月纯 1 , 　魏　刚 1 , 　尹　雪2
(1.广州中医药大学第一附属医院 ,广东 广州 510405;2.广州中医药大学 ,广东 广州 510405)
收稿日期:2007-09-10
基金项目:广东省科技计划项目(2005B33001038)。
作者简介:黄月纯(1968-),女 ,副主任中药师 ,硕士生导师 ,主要从事中药质量分析研究 ,电话:020-36591724, E-mail:huangyuechun@163.
com。
关键词:广藿香;不同部位;指纹图谱;HPLC
摘要:目的:建立广藿香 HPLC指纹图谱的分析方法 ,对广藿香及其茎 、叶不同部位的指纹图谱进行比较 , 为广藿香药材
内在质量评价积累数据。方法:色谱柱:HypersilODS;流动相:乙腈-0.05%磷酸(梯度洗脱);检测波长:320 nm;柱温:30
℃;流速:1.0mL/min。结果:广藿香及其茎 、叶均具有 16个指纹特征峰 ,但茎 、叶指纹特征峰相对含量有显著差异 ,叶所
含特征峰组分含量高于茎。结论:方法准确可靠 , 重复性好 ,为广藿香药材质量控制提供了参考。
中图分类号:R284.1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2008)08-1096-03
HPLCfingerprintanalysisofthedifferentpartsofHerbapogostemonis
HUANGYue-chun1 , 　WEIGang1 , 　YINXue2
(1.TheFristHospitalAfiliatedtoGuangzhouUniversityofTCM, Guangzhou510405, China;2.GuangzhouUniversityofTCM, Guangzhou510405,
China)
KEYWORDS:Herbapogostemonis;diferentparts;fingerprint;HPLC
ABSTRACT:AIM:Toestablishthemethodoffingerprint-analyzingHerbapogostemonisbyHPLC, andcompare
thevariabilityofthediferentparts, includingstemsandleaves, whichcouldbeusedforqualityevaluationofHerba
pogostemonis.METHODS:HPLCwithHypersilODScolumnwasused, theacetonitrile-0.05% phosphoricacid
(gradientelution)asamobilephaseanddetectionwavelengthwasat320nm, columntemperaturewasat30 ℃,
andflowratewas1.0 mL/min.RESULTS:16 commonpeakswereseparatedonHPLCfingerprintinthestems
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第 30卷　第 8期
中 成 药
ChineseTraditionalPatentMedicine
August2008
Vol.30　No.8