全 文 ：书第 42卷 第 9期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol．42 No．9
2014年 9月 JOUＲNAL OF NOＲTHEAST FOＲESTＲY UNIVEＲSITY Sep． 2014
第一作者简介:张梦莹，女，1990 年 7 月生，吉林农业大学食品
科学与工程学院，硕士研究生。
通信作者:沈明浩，吉林农业大学食品科学与工程学院，教授。
E－mail:shenmh2003@ aliyun．com。
收稿日期:2013年 12月 25日。
责任编辑:程 红。
梅花鹿茸可溶性蛋白提取工艺及免疫活性
张梦莹 赵玉娟 李倩竹 沈明浩
(吉林农业大学，长春，130118)
摘 要 以梅花鹿茸为原料，采用超声波辅助法提取可溶性蛋白。以鹿茸可溶性蛋白得率为评价指标，通过
单因素试验研究提取溶剂浓度、超声提取时间、超声提取功率和液料比对鹿茸可溶性蛋白得率的影响，在单因素试
验的基础上进行正交试验，优化提取工艺条件。结果表明:鹿茸可溶性蛋白的最优提取工艺条件为，以 pH= 10．00、
0．05 mol·L－1的碳酸盐缓冲溶液为提取溶剂，液料比 10 ∶ 1，超声提取功率 200 W，超声提取时间 20 min。在此条件
下，鹿茸可溶性蛋白得率为 36．849 mg·g－1。体内免疫活性试验表明，鹿茸蛋白提取物能够提高免疫功能低下小鼠
的单核巨噬细胞吞噬指数、血清溶菌酶质量浓度、血清及肝组织中酸性磷酸酶活力，具有良好的免疫活性。
关键词 鹿茸;可溶性蛋白;超声波提取;免疫活性
分类号 Ｒ285．5
Extraction and Immune Activity of Soluble Proteins from Velvet Antler of Cervus nippon Temminck /Zhang Mengy-
ing，Zhao Yujuan，Li Qianzhu，Shen Minghao(Jilin Agricultural University，Changchun 130118，P． Ｒ． China)/ / Journal
of Northeast Forestry University．－2014，42(9)．－158～160，163
We extracted the soluble proteins from velvet antler of Cervus nippon Temminck with ultrasonic waves，studied the
effect of concentration of extraction solvent，ultrasonic extraction time，ultrasonic extraction power and liquid-material ratio
on the velvet antler soluble proteins yield by the single factor experiment，and optimized extraction process conditions by
orthogonal experiment． The optimal extraction process conditions of soluble proteins from velvet antler were the extraction
solvent of 0．05 mol /L，pH of 10．00，carbonate buffer solution and the liquid-material radio of 10:1，the ultrasonic extrac-
tion power of 200 W，and the ultrasonic extraction time of 20 min． The yield of soluble proteins from velvet antler was 36．
849 mg /g． The results of animal experiment on immune activity showed that velvet antler proteins could increase the mono-
nuclear macrophage phagocytosis index，the concentration of serum lysozyme，the activity of acid phosphatase in serum and
liver tissue of immunosuppressive mice with better immune activity．
Keywords Velvet antler;Soluble proteins;Ultrasonic extraction;Immune activity
鹿茸为鹿科动物梅花鹿(Cervus nippon Tem-
minck)或马鹿(Cervus elaphus Temminck)的雄鹿未
骨化密生茸毛的幼角［1］。作为一种名贵中药材，鹿
茸已有 2000 多年入药历史［2］，具有保护心血管系
统、增强机体免疫力、抗氧化、强壮中枢神经系统、抗
肿瘤、改善高脂血症等多种作用功效。众多试验研究
表明，多肽、蛋白质是鹿茸中的主要有效成分，目前在
该成分的提取工艺研究方面，多以水［3］、乙醇［4］、醋酸
盐缓冲溶液［5］、磷酸盐缓冲溶液［6］和 Tris－HCl 缓冲
溶液［7］为提取溶剂，偏重酸性及中性环境;提取方式
虽已由常见的静置提取［4－5，7－8］、磁力搅拌提取［9－10］发
展到超声波辅助提取［11－13］、高压［12］及高压脉冲电场
提取［13］，但大多仍采用较为简单的静置和搅拌方式。
Haines［9］和 Coates 等［10］虽采用了碳酸盐缓冲溶液，
但未与超声波技术相结合;张大成［11］虽以碱性缓冲
溶液辅助超声波技术提取，但未探讨各因素的影响
显著性;且他们均未具体研究提取物的免疫活性。
故在此基础上，本研究先将碱性碳酸盐缓冲溶液与
超声波技术相结合提取冻干梅花鹿茸中可溶性蛋
白，寻找出较优提取工艺参数，再进一步研究该蛋白
提取物的非特异性免疫活性，为更加深入全面地开
发与利用鹿茸这一宝贵资源提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
新鲜梅花鹿鹿茸购于双阳区鹿乡镇双圣养殖
场，碳酸钠(AＲ) ，碳酸氢钠(AＲ) ，牛血清白蛋白组
份五(北京鼎国生物技术有限责任公司) ，磷酸
(AＲ) ，考马斯亮蓝 G－250(中国惠世生化试剂有限
公司) ，D25mm透析带(北京鼎国生物技术有限责任
公司) ，注射用环磷酰胺(通化茂祥制药有限公司) ，
印度墨水(上海 Kayon 生物科技有限公司) ，溶菌酶
(LZM)测试盒和酸性磷酸酶(ACP)测试盒(南京建
成生物工程研究所)。
1．2 仪器与设备
SP－722E型可见分光光度计(上海光谱仪器有
限公司) ;SHIMADZU AUY220 电子天平(岛津国际
贸易(上海)有限公司) ;大容量 Xiang Yi H－2050Ｒ
离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司) ;LGJ－12
DOI:10.13759/j.cnki.dlxb.20140721.007
冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司);KQ－
250B 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公
司) ;JY92－Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科
技股份有限公司) ;FW100高速万能粉碎机(天津市
泰斯特仪器有限公司) ;FDV 原泰奇气引式粉碎机
(佑奇有限公司) ;Delta 320酸度计(梅特勒－托利仪
器上海有限公司) ;WP－UPS－20 实验室专用超纯水
机(四川沃特尔水处理设备有限公司) ;WD－2102
型自动酶标仪(北京市六一仪器厂)。
1．3 研究方法
1．3．1 鹿茸粉的制备
将－80 ℃冻存鲜鹿茸于 4 ℃下解冻，锯成薄片，
切成小块，4 ℃预冷蒸馏水冲去血污后冷冻干燥，去
毛，粉碎，采用索式提取法［14］脱去冻干鹿茸粉中脂
肪，冷冻干燥，－80 ℃保存。
1．3．2 鹿茸可溶性蛋白的提取
称取 0．5 g 鹿茸粉，精确至 0．000 1 g，加入一定
体积的 4 ℃预冷浸提溶剂混合均匀，4 ℃条件下超
声波浸提一定时间，4 000 r·min－1、4 ℃离心 15 min，
取上清液，超纯水 4 ℃透析 48 h 后冷冻干燥，超纯
水定容至 50 mL，即为鹿茸蛋白提取液，4 ℃保存以
备蛋白质量分数测定。
1．3．3 鹿茸可溶性蛋白得率的测定
参考 Bradford 法［15］，分别移取 0．1 g·L－1标准
蛋白溶液 0、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0 mL，超纯水补足至
1．0 mL，加入 5．0 mL Bradford 工作液［16］，立即混匀，
静置 5 min，在 595 nm处测定吸光度(A)。以标准蛋
白质量为横坐标 X，吸光度(A)值为纵坐标(Y) ，绘
制标准曲线，得线性回归方程:Y =5．942 9 X+ 0．022 9，
Ｒ2 = 0．994 8。准确移取 0．2 mL鹿茸蛋白提取液，超
纯水补足至 1．0 mL，按照上述操作测定 595 nm处的
吸光度值，根据线性回归方程计算鹿茸可溶性蛋白
得率，公式如下:M = (x×V0)/(m×V)。式中:M 为
鹿茸可溶性蛋白得率;x 为由线性回归方程所求鹿
茸蛋白提取液中蛋白质量;V0 为吸光度测定时取用
鹿茸蛋白提取液体积;m为鹿茸粉质量;V为鹿茸蛋
白提取液总体积。
1．3．4 鹿茸可溶性蛋白提取单因素及正交试验设计
提取时间的选择:固定超声温度为 4 ℃，提取溶
剂为 0．05 mol·L－1、pH = 10．0 的碳酸盐缓冲溶液，
液料比为 20 ∶ 1，超声功率为 250 W，考察超声提取
时间为 5、10、15、20、25、30 min 时鹿茸可溶性蛋白
得率的变化。
提取功率的选择:固定超声温度为 4 ℃，提取溶
剂为 0．05 mol·L－1、pH = 10．00 的碳酸盐缓冲溶液，
液料比为 20 ∶ 1，超声时间为 5 min，考察超声功率
为 100、150、200、250、300 W时鹿茸可溶性蛋白得率
的变化。
液料比的选择:固定超声温度为 4 ℃，提取溶剂
为 0．05 mol·L－1、pH = 10．00 碳酸盐缓冲溶液，超声
功率为 250 W，超声时间为 5 min，考察液料比为 5 ∶ 1、
10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、25 ∶ 1 时鹿茸可溶性蛋白得率
的变化。
提取溶剂浓度的选择:固定超声温度为 4 ℃，提
取溶剂为 pH = 10．00 碳酸盐缓冲溶液，液料比为
20 ∶ 1，超声功率为 250 W，超声时间为 5 min，考察
缓冲溶液浓度为 0．01、0．02、0．05、0．10、0．20 mol·
L－1时鹿茸可溶性蛋白得率的变化。
以鹿茸可溶性蛋白得率为评价指标，在单因素
试验基础上进行 L9(3
4)正交试验(表 1) ，每个试验
处理重复 3次，优化鹿茸可溶性蛋白提取工艺条件。
表 1 梅花鹿茸可溶性蛋白提取工艺的正交试验因素与水平
水平
因 素
A提取溶剂浓
度 /mol·L－1
B超声提取
时间 /min
C超声提取
功率 /W
D液
料比
1 0．02 15 150 5 ∶ 1
2 0．05 20 200 10 ∶ 1
3 0．10 25 250 15 ∶ 1
1．3．5 鹿茸蛋白提取物的免疫活性试验
选取健康昆明小鼠 40只，每组 8只，雌雄各半，
随机分为鹿茸蛋白提取物低剂量组(低剂量组)、鹿
茸蛋白提取物中剂量组(中剂量组)、鹿茸蛋白提取
物高剂量组(高剂量组)、模型对照组和空白对照
组。将鹿茸以 1．3．4 中所得最优工艺连续提取 3 次
后的提取液冻干，制得鹿茸蛋白提取物，溶于生理盐
水，分别以 200、400、800 mg·kg－1剂量对低、中、高
剂量组小鼠进行灌胃;模型对照组和空白对照组则
给予 10 mL·kg－1生理盐水;每天 1次，连续 7 d。灌
胃第 2天和第 3 天时以 100 mg·kg－1的剂量对除空
白对照组之外的各组小鼠腹腔注射环磷酰胺水溶
液，致小鼠免疫功能低下。第 8 天摘眼球取血
后，3 500 r·min－1离心 10 min，取血清，颈椎脱臼法处
死后取肝脏、脾脏。参照汪艳群［17］的方法进行碳廓
清试验，测定单核巨噬细胞吞噬指数;按照测试盒说
明书操作，测定血清溶菌酶含量、血清酸性磷酸酶和
肝组织酸性磷酸酶活力。采用 IBM SPSS 20．0统计软
件对数据进行统计分析，结果用平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2．1 单因素试验
提取时间的选择:超声提取时间为 5、10、15、
951第 9期 张梦莹等:梅花鹿茸可溶性蛋白提取工艺及免疫活性
20、25、30 min 时，鹿茸可溶性蛋白得率分别为
29．891、30．451、31．051、31．672、31．471、31．227 mg·
g－1。可见，在 5～20 min内，随着超声提取时间的延
长，鹿茸可溶性蛋白得率逐渐增加，继续延长提取时
间，蛋白得率开始缓慢下降。这是因为在定量溶剂
中，超声破碎过程中蛋白的溶出［18］需要一定时间，
当蛋白溶出趋于稳定后，即使再超声处理其质量
分数也不再增加，相反由于长时间的超声波剪切
作用可能导致部分蛋白变性，溶解性变差［19］因而
得率下降。
提取功率的选择:超声提取功率分别为 100、
150、200、250、300 W 时，鹿茸可溶性蛋白得率分别
为 34．282、36．505、36．786、35．271、34．984 mg·g－1。
可知，鹿茸可溶性蛋白得率随着超声功率的增大而
增加，当超声功率增大至 200 W 时蛋白得率达到最
高，继续增大超声功率，蛋白得率反而呈现下降趋
势。这可能是因为一开始超声功率较小，逐渐增大
超声功率会增强对物料的破碎程度，使蛋白更容易
溶出，但当超声功率增大到一定程度时，过大的破碎
力度使已经浸出的部分蛋白结构破坏以至变
性［18，20］，从而导致蛋白得率下降。
液料比的选择:液料比分别为5 ∶ 1、10 ∶ 1、
15 ∶ 1、20 ∶ 1、25 ∶ 1 时，鹿茸可溶性蛋白得率分别
为 22．398、33．640、33．276、34．603、35．649 mg·g－1。
可见，鹿茸可溶性蛋白得率随溶剂用量增加而显著
升高，液料比达到 10 ∶ 1 后蛋白得率趋于平稳。因
为溶剂用量较少时，整个溶液体系的浓度较高，黏度
较大［20］，对蛋白的传质过程起到一定阻碍作用;适
当增加溶剂用量后，减小了溶液的浓度和黏度，有利
于蛋白的溶出;继续加大液料比，蛋白得率增加趋于
平缓，说明此时蛋白溶出趋于稳定，在溶剂中的扩散
达到平衡状态。
提取溶剂浓度的选择:提取溶剂浓度分别为
0．01、0．02、0．05、0．10、0．20 mol·L－1时，鹿茸可溶性
蛋白得率分别为 21．006、22． 500、23． 807、23．548、
24．151 mg·g－1。可知，鹿茸可溶性蛋白得率随着提
取溶剂浓度的增大呈逐渐增加趋势，当提取溶剂浓
度为 0．05 mol·L－1时达到一个峰值，继续提高浓度，
蛋白得率逐渐趋于平稳。大部分蛋白质均溶于水、
稀盐、稀碱或稀酸溶液中，缓冲溶液对蛋白质稳定性
好、溶度大，是提取蛋白质的常用溶剂。不同浓度的
缓冲溶液离子强度不同，对蛋白质的溶解和吸附能
力不同。
2．2 正交试验
按照正交试验设计进行试验，不同组合条件下
鹿茸可溶性蛋白得率依次为 33．609、35．169、34．142、
35．918、35．441、36．807、35．450、34．587、34．226 mg·
g－1。由表 2和表 3可知，各因素对鹿茸可溶性蛋白
得率的影响主次顺序依次为 A、D、C、B，其中 A和 D
影响极显著，C和 B 影响不显著。根据试验结果得
到超声法提取鹿茸可溶性蛋白的最优水平组合为
A2B2C2D2。由于这一水平组合未在正交试验设计
中，故对其进行 3次平行验证试验，所得鹿茸可溶性
蛋白得率为 36．849 mg·g－1，高于正交试验中第 6号
处理的结果，故最终确定提取溶剂浓度 0．05 mol·
L－1，液料比 10 ∶ 1，超声提取功率 200 W，超声提取
时间 20 min为最优工艺条件。
表 2 梅花鹿茸可溶性蛋白提取工艺正交试验的直观
分析结果 mg·g－1
指标
A提取溶
剂浓度
B超声提
取时间
C超声提
取功率
D液
料比
K1 102．920 104．978 105．003 103．276
K2 108．166 105．198 105．314 107．427
K3 104．264 105．175 105．033 104．647
Ｒ 5．246 0．220 0．311 4．151
表 3 梅花鹿茸可溶性蛋白提取工艺正交试验方差分析结果
变异来源 偏差平方和 自由度 均方差 F值 显著性
A 14．851 2 7．425 769．411 极显著
B 0．029 2 0．015 1．159
C 0．059 2 0．029 3．052
D 8．945 2 4．472 463．425 极显著
误差 0．174 18 0．010
2．3 鹿茸蛋白提取物的免疫活性
由表 4可知，与模型对照组比较，鹿茸蛋白提取
物中、高剂量组的单核巨噬细胞吞噬指数显著增加，
低剂量组虽也增加但差异不显著;各剂量组均高于
空白对照组，但差异不显著。各剂量组的血清溶菌
酶质量浓度均高于模型对照组和空白对照组，除低
剂量组与空白对照组差异不显著外，其余均有显著
差异。各剂量组的血清酸性磷酸酶和肝组织酸性磷
酸酶活力均显著高于模型对照组和空白对照组。据
此可知，鹿茸蛋白提取物能够增强小鼠巨噬细胞活
性，对其非特异性免疫功能具有积极调节作用，表现
出良好的免疫活性。
表 4 鹿茸蛋白提取物对小鼠非特异性免疫功能的影响
组 别
单核巨噬细
胞吞噬指数
血清溶菌酶质量
浓度 /mg·L－1
血清酸性磷酸酶
活力 /U·L－1
肝组织酸性磷酸
酶活力 /U·g－1
空白对照组 3．97±1．13 5．11±0．18 52．53±1．31 1．14±0．13
模型对照组 2．92±0．47 4．08±0．22 49．30±1．87 1．04±0．06
低剂量组 4．05±1．22 (5．15±0．11)b (84．55±12．52)ab (1．35±0．05)ab
中剂量组 (4．64±0．41)b (7．95±0．35)ab (82．85±4．31)ab (1．32±0．09)ab
高剂量组 (4．90±0．37)b (9．93±0．11)ab (113．65±17．61)ab (1．25±0．13)ab
注:a表示与空白对照组相比，P＜0．05;b 表示与模型对照组相
比，P＜0．05。 (下转 163页)
061 东 北 林 业 大 学 学 报 第 42卷
45 ℃温水浸种处理效果较好，所以将余下的Ⅰ级和
Ⅱ级种子分别用 45 ℃温水浸种 3 d 后，发芽率分别
为 15%、18%，然后放入人工气候箱进行培养、催芽，
最后进行圃地播种育苗试验。
经过 40 d的调查和统计，取得了 45 ℃温水浸
种快速催芽方法对场圃发芽率的影响数据(表 4)。
表 4 45 ℃温水浸种对种子出苗率及生物量的影响
种子大小 快速催芽方法
场圃发芽率 /%
15 d 20 d 25 d 30 d 35 d 40 d
平均苗高 / cm 平均地径 /mm
Ⅰ级 45 ℃温水浸种 18．87 21．13 24．52 45．28 63．39 79．25 16．46±3．35 3．16±0．82
Ⅱ级 45 ℃温水浸种 20．75 24．89 33．20 52．28 69．71 87．97 14．38±2．78 2．83±0．64
注:表中平均苗高、地径数据为平均值±标准差。
4 结束语
不同种子快速催芽方法对文冠果种子的发芽率
有显著影响，其中以 45 ℃温水浸种快速催芽方法效
果最好，而用浓硫酸和变温进行处理方法次之。本
试验后，对部分种子采用 45 ℃温水浸种 7 d，然后再
放入人工气候箱(25±2)℃培养，发现浸种 7 d 再培
养的种子比浸种 3 d 的种子发芽快，第 3 天开始就
有种子发芽，而且发芽整齐。浸种时间长，发芽快的
原因可能是由于文冠果种子的种皮较厚，长时间浸
泡，可以让种子充分吸水，软化种皮，打破休眠等。
所以如果播种时间允许的话，可以适当延长浸种时
间，但在浸种过程中，要及时换水。
参 考 文 献
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(2) :51－54．

(上接 160页)
3 结论
采用超声波辅助法提取梅花鹿茸可溶性蛋白，
以鹿茸可溶性蛋白得率为评价指标，通过单因素和
正交试验结果得知，提取溶剂 pH = 10．00 的碳酸盐
缓冲溶液浓度和液料比对鹿茸可溶性蛋白的提取影
响极显著，超声提取功率和超声提取时间影响不显
著。在 pH= 10．00 的碳酸盐缓冲溶液浓度为 0．05
mol·L－1，液料比 10 ∶ 1，超声提取功率 200 W，超声
提取时间 20 min的条件下，鹿茸可溶性蛋白得率最
高，为 36．849 mg·g－1。通过免疫活性试验发现，鹿
茸蛋白提取物能够提高免疫功能低下小鼠的单核巨
噬细胞吞噬指数、血清溶菌酶质量浓度、血清及肝组
织中酸性磷酸酶活力，积极调节小鼠非特异性免疫
功能，具有良好的免疫活性。
参 考 文 献
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