全 文 ： 张晓飞 等/用气相色谱-质谱联用比较牛耳草代谢物的提取方法
Chinese Journal of Biotechnology
http://journals.im.ac.cn/cjbcn February 25, 2014, 30(2): 294−304
DOI: 10.13345/j.cjb.130246 ©2014 Chin J Biotech, All rights reserved


Received: May 13, 2013; Accepted: May 27, 2013
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31270312), Scientific Research Key Project of Yibin University (No.
2013QD07).
Corresponding author: Yuehua Gong. Tel: +86-831-3545069; E-mail: gongyh01@163.com
Xin Deng. Tel/Fax: +86-10-62836261; E-mail: deng@ibcas.ac.cn
国家自然科学基金 (No. 31270312), 宜宾学院重点科研项目 (No. 2013QD07) 资助。
294 生 物 工 程 学 报

用气相色谱-质谱联用比较牛耳草代谢物的提取方法
张晓飞 1,3，段礼新 3，龚月桦 1,2，邓馨 3
1 西北农林科技大学生命科学学院，陕西 杨凌 712100
2 宜宾学院 生命科学与食品工程学院，四川 宜宾 644000
3 中国科学院植物研究所 资源植物研发重点实验室 植物分子生理学重点实验室，北京 100093
张晓飞, 段礼新, 龚月桦, 等. 用气相色谱-质谱联用比较牛耳草代谢物的提取方法 . 生物工程学报 , 2014, 30(2):
294−304.
Zhang XF, Duan LX, Gong YH, et al. Comparison of metabolite extraction from Boea hygrometrica by gas chromatography/
mass spectrometry. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 294−304.
摘 要 : 通过比较不同的提取方法对牛耳草新鲜和脱水叶片中代谢物的提取效率，旨在建立一种可以有效鉴
定并分析牛耳草脱水过程中关键小分子代谢物的种类和含量变化的方法，为研究植物耐脱水分子机制提供技术
方法。本研究以气相色谱-质谱联用 (GC-MS) 为分析方法，对复苏植物牛耳草代谢物提取方法进行比较。从
提取总色谱峰数目、提取效率、代谢物保留时间和提取效率稳定性等方面比较甲醇溶液 (A 法) 和甲醇-氯仿-
水溶液 (B 法) 两种提取方法的提取效果。对牛耳草新鲜样品提取结果表明，B 法提取的总色谱峰数目多于 A
法；对 9种共有代谢物的提取效率比较结果表明，B法的提取效率高于 A法；对 10种色谱峰的保留时间和提
取效率的方法学考察结果表明，两者保留时间 RSD (相对标准偏差) 值均小于 1%，A法提取效率的 RSD值≤10%
的比例为 50%，B法的为 100%。A法对干样的提取色谱峰数目远少于鲜样，而 B法对干样的提取色谱峰数目
和鲜样没有显著差异，保留时间 RSD值均小于 1%，提取效率的 RSD值与鲜样没有差异，稳定性良好。
关键词 : 代谢物，提取方法，气相色谱-质谱联用

生物技术与方法
张晓飞 等/用气相色谱-质谱联用比较牛耳草代谢物的提取方法
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Comparison of metabolite extraction from Boea
hygrometrica by gas chromatography/mass spectrometry
Xiaofei Zhang1,3, Lixin Duan3, Yuehua Gong1,2, and Xin Deng3
1 College of Life Science, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China
2 College of Life Sciences and Food Engineering, Yibin University, Yibin 644000, Sichuan, China
3 Key Laboratory of Plant Resource, Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences,
Beijing 100093, China
Abstract: This study is aiming to establish an efficient metabolite extraction method for exploration of molecular
mechanisms of desiccation tolerance of the resurrection plant Boea hygrometrica using a metabolomics approach. The
extracts of metabolite in B. hygrometrica using methanol solution (method A) and methanol-chloroform-water solution
(method B) were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The total numbers of chromatographic
peaks, extraction efficiency, retention time and the peak stability were compared. The results showed that for fresh
materials, the total chromatographic peak number of method B is more than that of method A; the extraction efficiency of
nine representative metabolites by method B is higher than that by method A; the comparison of 10 random
chromatographic peaks revealed that the relative standard deviation (RSD) values of the retention time are less than 1% for
both methods, whereas the RSD values of the extraction efficiency is different. The percentage of peaks that owned RSD
values of the extraction efficiency higher than 10% is 50% for method A and 100% for method B. In addition, method B
was also efficient for dry materials from B. hygrometrica. The number of chromatographic peaks, RSD value of retention
time and extraction efficiency of dry materials was similar to that of fresh materials using method B, but decreased sharply
using method A. Putting together, our study provided evidence that method B is an efficient extraction method for further
analysis of metabolites from this resurrection species.
Keywords: metabolite, extraction method, GC-MS
复苏植物是植物界一个特殊的类群，能够
忍受极度脱水，以类似休眠的方式度过干旱期，
在水分适宜时又迅速恢复生活状态，继续其生
活史，在这个过程中表现出形态结构上的可见
变化[1-4]。最早对复苏植物研究的文献记录可以
追溯到 1919 年，Dinter 研究发现密罗木科植物
密罗木 Myrothamnus flabellifolius 的失水叶片可
以在有水的情况下恢复正常的生理状态[5]。虽然
人们很早就注意到了复苏现象，但是对复苏植
物耐脱水机制的研究则是最近几十年才迅速展
开的。随着研究技术的进步和仪器的改进，对
复苏植物的研究已经从最初的对其生态适应的
解 释 [6-9] 到 对 其 生 理 生 化 特 别 是 抗 氧 化 酶 系
统[10-11]、光合[12-13]、呼吸等方面的研究及至到
现在运用分子生物学手段和方法从分子水平上
研究其耐脱水机制[14-16]。
牛耳草 Boea hygrometrica (Bunge) R. Br.是
苦苣苔科，旋蒴苣苔属的一种复苏植物，主要
分布在干旱频繁发生的石灰质岩石上，具有极
端耐旱的特性，可以在失去 90%–95%水分的“超
干状态”存活数年，是研究植物耐脱水机制的
良好材料[17-18]。目前，已有研究从细胞水平[19]、
蛋白水平[17]和基因水平[20-23]研究揭示了牛耳草
抗旱的一些分子机制，但是对其内源代谢物在
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抗旱中的变化和作用尚未有系统性的研究。由
于复苏植物次生代谢产物异常丰富，而传统的
提取方法只是针对某一类物质有较好的提取效
果[24-26]，无法全面反映所有代谢物的情况。为
了解决以上问题，文中采用代谢组学方法对牛
耳草的代谢物进行测定，系统地鉴定和分析小
分子代谢物的变化，为揭示牛耳草耐旱复苏机
制、筛选关键代谢物质提供重要信息。但目前
的代谢物提取方法往往是针对新鲜植物样品设
计，而对脱水材料、尤其是脱水达到 95%以上
的复苏植物叶片的提取效率未知。因此摸索一
种能够对牛耳草“干”、“鲜”两种状态植物都
有较高效率的提取技术是研究牛耳草脱水复苏
机制的代谢组学分析的前提。我们针对这个问
题，对牛耳草代谢物提取方法进行比较和优化，
为后续研究提供有效的技术和方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
仪 器 ： Agilent 6890 气 相 色 谱 仪 ( 美 国
Agilent 公司)，LECO Pegasus IV 气相-飞行时间
质谱联用仪 (美国 Leco 公司)，Sigma 3-18K 高
速冷冻离心机 (美国 Sigma 公司)，超低温冰箱，
TTL-DC 型多功能氮吹仪 (北京)，FD-1T 冷冻
干燥机 (北京)，MS-100 恒温混匀仪 (浙江)，
QL-901 旋 涡 混 合 器 ( 江 苏 ) ， 色 谱 注 射 器
(上海)。
试剂：甲醇 (色谱纯，美国 Fisher 公司)，
氯仿 (色谱纯，美国 Mreda 公司)，水 (色谱纯，
美国 Fisher 公司)，核糖醇 (美国 Sigma 公司)，
无水吡啶 (色谱纯，北京)，N-甲基-N-三甲基硅
烷基三氟乙酰胺 (MSTFA，美国 Sigma 公司)，
甲氧氨基盐酸盐 (美国 Sigma 公司)。
1.2 植物材料
牛耳草种子采自北京植物园樱桃沟，4 ℃春
化 2 d 后播种在培养盘中，于培养室中土培，温
度为 (25±2) ℃，光周期为 16 h/8 h (昼/夜)，正
常供水。选取 3–4 月龄的植株用于实验，即“鲜”
植物。将“鲜”植物置于相对湿度 30%–50%、
25 ℃条件下干旱 48 h 后达到脱水状态 (叶片相
对含水率<10%，用于实验，即“干”植物[17] (以
下未特别注明的提取对象均为鲜样)。
1.3 样品的采集和提取方法
样品采集：选取 4–6 棵生长状况良好的牛
耳草植株，将其叶片混合，置于研钵中，用液
氮充分研磨至粉末，之后置于冷冻干燥仪中冷
冻干燥 24 h。
样品提取方法：分为 A 法和 B 法。
A 法：提取过程参照 Lisec 等[27]和 Weckwerth
等[28]的方法，稍作改动。具体如下：称取干燥的
样品 20 mg，放入 2 mL 的离心管中，加入 1.5 mL
预冷 (−20 ℃) 的甲醇溶液，再加入 10 μL 浓度
为 5 mg/L 的核糖醇作为内标，涡旋混匀。37 ℃
振荡反应提取 2 h，之后放入冷冻离心机中，
12 000×g 离心 10 min。取上清 1 mL 转移至另
一个新的 2 mL 离心管中，加入 400 μL 氯仿、
400 μL 水，涡旋混匀，使极性相和非极性相充
分溶于水和氯仿中。12 000×g 离心 5min，取上
清 200 μL (极性相) 放入 1.5 mL 的尖底色谱进
样瓶中，低温氮气流吹干，加入 50 μL 浓度为
20 mg/mL 肟化试剂甲氧氨基盐酸盐，37 ℃、
200 r/min 振荡反应 2 h。之后加入 80 μL 硅烷化
试剂 MSTFA，37 ℃、200 r/min 振荡反应 0.5 h，
上样进行 GC-MS 分析。每个处理设 3 个重复。
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B 法：将 A 法中的甲醇溶液用甲醇-氯仿-
水溶液 (甲醇：氯仿：水体积比为 5  2  2) 替
换，其他操作同 A 法。每个处理设 6 个重复。
1.4 色谱质谱条件
VF-5MS 型色谱柱 (30 m×250 μm ×0.25 μm)；
进样口温度 280 ℃；分流比 4  1；进样量 1 μL；
载气：氦气；溶剂延迟 5 min；载气流速：1 mL/min，
色谱柱初始温度 80 ℃，保持 2 min，以 8 /min℃
升至 300 ℃，保持 13 min。传输线温度 280 ℃，
EI 离子源：温度，210 ℃，电子能量，70 eV；全
扫描模式，扫描范围 m/z: 70–650。
1.5 数据分析与统计检验
通过比较两种方法提取的总色谱峰数量、
信号强度、共有峰变量的提取效率及稳定性来
判断两种方法的优劣。数据预处理及解卷积用
美国 Leco 公司的 Chroma TOF V3.32 软件完
成，之后用 Pmass 软件[29]进行峰对齐，获得的
数 据 矩 阵 导 入 多 变 量 统 计 软 件 SIMCA-P
software 11.5 进 行 偏 最 小 二 乘 法 判 别 分 析
(PLS-DA)。相对含量采用峰面积归一法计算，
匹配度 (Match) 为样品质谱图与 NIST Mass
Spectral Database 05 标准图谱的正检索相似系
数 (0–1 000)，Match≥750 为适合匹配度。
2 结果与分析
2.1 两种提取方法的 PLS-DA 分析
将牛耳草代谢物 GC-MS 数据经过预处理后
导入 SIMCA-P 软件进行 PLS-DA 分析，得到两
种方法的 scatter plot 图 (图 1)。从图上可以看
出，同一方法的重复数据点都集中在一起，说
明在实验操作、仪器稳定性等方面都是可靠的，
数据的质量是良好的，可以用于后续分析。而
两种提取方法的数据点在空间上可以得到明


图 1 A 法 (▲1) 和 B (▲2) 法提取牛耳草代谢物的
PLS-DA 分析散点图
Fig. 1 Scatter plot of the method A (▲1) and method
B (▲2) by PLS-DA.

显区分，分布差异表明两种方法提取的代谢物
在种类、数量和浓度等方面均存在差异。
2.2 两种提取方法提取效果的比较
为 了 更 直 观 地 比 较 这 两 种 方 法 的 提 取 效
果，把两者的总离子色谱图叠加在一起进行分
析 (图 2)。由图可知，两种提取方法的提取效
果存在明显区别，就 B 法而言，其色谱峰的数
目明显多于 A 法，且色谱信号强度也优于 A 法。
对两种方法检测到的色谱峰数目进行数学统计
(图 3)，结果显示，两种方法提取的色谱峰的数
目差异显著 (P<0.05)。对干样的提取效果进行
分析， A 法提取的干样色谱峰总数只有 155 个，
明显低于鲜样 (数据未显示)，表明此方法不适
于干样样品提取。
2.3 两种提取方法提取效率的比较
由于代谢组学的检测对象主要是生物样品
中小分子量的代谢物，如氨基酸、糖类、有机
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图 2 两种方法的总离子色谱图
Fig. 2 Stack of total ion current chromatograms of the method A and B.



图 3 两种方法提取的色谱峰数目
Fig. 3 Total peak numbers of extract by method A and B.

酸和脂肪酸类[30]等，因此文中从所有代谢物中
选取了 9 种共有峰变量，包括 3 种有机酸、3 种
氨基酸及 3 种糖类，以代谢物和内标核糖醇的峰
面积比来表示代谢物的相对含量，以 B 法和 A
法相对含量的比值衡量两种提取方法的优劣。采
用 SPSS 17.0 统计软件进行 t 检验 (表 1)，结果
显示，多数代谢物的提取率 B 法均高于 A 法，
仅蜜二糖例外；且除苏氨酸外，其余 7 种代谢物
的提取效率 A 法和 B 法的差异程度均达到了显
著水平。
2.4 方法稳定性比较
植物代谢物的成分非常复杂，色谱峰数量众
多，如何对色谱峰进行鉴定就显得尤为重要。鉴
于色谱峰保留时间的稳定性对色谱峰的匹配很
重要，我们根据总检测时间的长度随机挑选了
10 个色谱峰，对两种方法中色谱峰保留时间的
稳定性进行了比较分析，同时对这 10 个色谱峰
的相对峰面积，即提取效率的稳定性也进行了考
察 (表 2)。结果显示，两种方法的 10 个色谱峰
保留时间的相对标准偏差 RSD 值均小于 1%，表
明两种方法提取的代谢物保留时间稳定性良好。
提取效率稳定性结果显示，A 法中，RSD≤5%
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的仅有 1 个，比例为 10%，5%＜RSD≤10%的 5
个，比例为 50%，RSD≥10%的 4 个，比例为 40%，
而 B 法中分别为 40%、60%和 0。由此可知，在
提取效率的稳定性方面，B 法远远优于 A 法。
通过以上各项指标的比较分析可知，B 方法
更适合于牛耳草叶片代谢物的提取分析。
表 1 两种提取方法的提取效率
Table 1 Extract efficiencies of method A and B
Relative peak area (%)
Retention time Endogenous metabolites Match
Method A Method B
Ratio of peak area
(B/A)
9.70 Butanedioic acid 902 7.19±0.56b 26.79±0.82a 3.73
10.32 (E)-2-butenedioic acid 905 1.37±0.35b 8.04±0.32a 5.85
10.83 L-threonine 886 6.27±1.01a 6.35±0.41a 1.01
12.49 Malic acid 904 34.75±6.94b 59.45±0.61a 1.71
13.06 L-Proline 934 5.33±0.81b 6.56±0.21a 1.23
17.94 D-Mannose 868 0.38±0.03b 8.09±0.08a 21.41
18.73 L-Tyrosine 808 0.69±0.14b 7.19±0.15a 10.50
27.19 Maltose 774 1.36±0.07b 2.09±0.04a 1.54
30.22 Melibiose 800 23.97±2.81a 0.33±0.04b 0.01
Relative peak area is the rate of metabolites actual area and ribitol actual area; ratio of peak area is the rate of two methods
relative peak area. Ratio of peak area >1 means that method B extract efficiency is higher than method A, while <1 means
that it is lower. In the same row, values with different small letter superscripts means significant difference (P<0.05), while
same letter superscripts means no significant difference (P>0.05).
表 2 色谱峰保留时间稳定性及提取效率稳定性考察
Table 2 Peak stability of retention time and extract efficiency
Retention time (min) Corrected peak area
Method A Method B Method A Method B Number
Mean RSD (%) Mean RSD (%) Mean RSD (%) Mean RSD (%)
Peak1 5.04 0.03 5.03 0.05 40 839.53 7.01 78 792.96 6.66
Peak2 8.43 0.02 8.43 0.03 6 584.97 2.94 6 599.31 9.77
Peak3 12.06 0.04 12.19 0.03 10 639.87 10.30 61 824.39 9.31
Peak4 15.21 0.02 15.21 0.03 13 377.23 5.14 17 306.03 3.64
Peak5 17.73 0.06 17.73 0.16 12 472.50 6.30 533 693.41 2.65
Peak6 19.07 0.07 19.07 0.01 11 693.63 10.73 11 445.07 3.92
Peak7 27.77 0.07 27.78 0.03 2 141.37 5.37 1 027.01 7.71
Peak8 32.39 0.02 32.34 0.01 13 954.07 10.94 87 364.24 5.53
Peak9 34.65 0.02 34.60 0.02 11 597.63 5.10 41 758.79 3.17
Peak10 41.32 0.01 41.31 0.03 123 733.53 16.03 245 292.62 7.91
Corrected peak area = metabolites actual area/ribitol actual area×106.


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2.5 干鲜植物样品提取效果的比较
前期结果显示，A 法提取的干样色谱峰总数
只有 155 个，明显低于鲜样，所以我们重点比较
了 B 法对“干”、“鲜”两种状态下的样品的提
取效果。将鲜样 (CK) 和干样 (D48 h) 的色谱
图叠加在一起分析 (图 4)，由图可知，除差异峰
以外 (两种状态的差异代谢物)，绝大部分色谱
峰在两种状态的样品中都可以检测得到，而且在
保留时间上基本吻合。这说明 B 方法同样也适
用于牛耳草干样代谢物的提取，不会造成大量代
谢物的“丢失”。对两种状态的样品提取的色谱
峰数目进行统计 (图 5)，两者均达到 300 个以上，
没有显著差异。对干样的色谱峰保留时间和提取
效率的稳定性进行分析 (表 3)，保留时间的 RSD
值均小于 1%，提取效率的 RSD 值在 5%左右，
稳定性良好 (10 个色谱峰与表 2 中的相对应)。
2.6 干鲜植物样品代谢物变化的比较
前期结果显示，鲜样中检测到 308.17 个峰，干
样中检测到 317 个峰，而把鲜样和干样总离子色谱
图叠加进行分析则共检测到 580 个峰。这说明两者
间特异的色谱峰数目众多，即存在数量众多的差异
物质。580 个色谱峰中，2 个处理都检测到的 265
个，Match≥750 的 99 个，其中有 15 个有机酸峰，
51 个糖类峰，13 个氨基酸峰，这 3 大类物质占了
所检测到的物质种类的绝大部分，与代谢组所能
检测到的物质对象是相吻合的。进一步分析，鲜
样中特有的代谢物质峰为 106 个，Match≥750 的
14 个，5 个有机酸峰，4 个糖类峰，1 个氨基酸峰。
干样中特有的代谢物质峰为 89 个，Match≥750
的 17 个，12 个糖类峰，1 个有机酸峰，2 个氨基
酸峰。干样中糖类物质不仅在种类上远大于鲜样，
而且总含量也较鲜样明显上升。牛耳草在脱水过
程中糖类物质明显增多，这可能与糖类作为渗透


图 4 B 法提取牛耳草鲜样 (CK) 和干样 (D48 h) 的总离子色谱图
Fig. 4 Stack of total ion current chromatograms of the extracts from fresh (CK) and dehydrated (D48 h) materials of B.
hygrometrica using method B.


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图 5 B 法提取牛耳草鲜样 (CK) 和干样 (D48 h) 的
色谱峰数目
Fig. 5 Total peak numbers of the extracts from fresh (CK)
and dehydrated (D48 h) materials of B. hygrometrica
using Method B.
调节物质来抵御干旱胁迫有关。而脱水过程中其
他物质的具体变化与脱水的关系及牛耳草作为复
苏植物特异的代谢物变化还有待进一步分析。
3 讨论
复苏植物在自然界广泛存在，其种类几乎覆
盖了所有的植物生命形式 (裸子植物除外)[4]。
以往的研究主要集中在分子水平上，本研究旨
在通过应用代谢组学方法测定牛耳草脱水前后
代谢物种类及含量的变化，对牛耳草的代谢物
进行比较全面的检测及研究，从中找出对牛耳
草耐脱水机制有重要影响的关键代谢物，为进
一步探明复苏植物的抗旱复苏机制提供理论依
据。在全球干旱缺水的背景下，能为寻找强效
抗旱基因资源和小分子抗旱调节剂以及作物抗
旱育种提供基础。
表 3 B 法提取牛耳草干样的色谱峰保留时间稳定性及提取效率稳定性
Table 3 Peak stability of retention time and extract efficiency of the extracts from dehydrated materials of
B. hygrometrica using Method B
Retention time (min) Corrected peak area
Number
Mean RSD (%) Mean RSD (%)
Peak 1 5.04 0.22 61 131.05 9.70
Peak 2 8.43 0.05 6 035.06 4.82
Peak 3 12.16 0.19 10 445.03 5.65
Peak 4 15.21 0.03 19 620.07 11.73
Peak 5 17.72 0.14 76 195.61 2.71
Peak 6 19.07 0.02 11 910.47 3.75
Peak 7 27.78 0.02 3 157.25 4.69
Peak 8 32.34 0.02 90 297.47 3.41
Peak 9 34.61 0.03 73 728.63 3.06
Peak 10 41.31 0.03 190 199.35 3.55
Corrected peak area = metabolites actual area/ribitol actual area×106.

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一种良好的代谢物提取方法是代谢组学研究
的基础，既要求能提出尽可能多的代谢物，还要
求检测方法的稳定性良好。本研究用两种方法对
牛耳草叶片代谢物进行提取，以 GC-MS 为代谢
物分析方法，对提取效果进行了比较，发现甲
醇-氯仿-水法提取物在色谱峰数目及信号强度
方面均优于甲醇法；在提取效率方面，为了尽
可能全面反映整体情况，选择了氨基酸、糖类
及小分子有机酸这 3 类可以代表代谢组学检测
对象的物质进行分析；在考察方法学稳定性方
面，则依据检测时间的总长度均匀随机进行选
择，因此能够更好地反映整体情况。结果显示，
甲醇-氯仿-水法在各方面都优于甲醇法，而且对
干样的提取效果也达到相似水平，表明该方法
适用于不同含水量的植物样品的代谢物提取及
后续分析。在此基础上，对牛耳草干鲜样品代
谢物的初步统计分析结果显示鲜样和干样的差
异色谱峰数目有 300 多个，说明牛耳草在脱水前
后体内生理生化活动发生了明显的改变，而这些
改变可能与牛耳草耐脱水机制有密切的关系。
以往对牛耳草小分子代谢物的研究仅鉴定
了少数物质，如蔡祥海等[24]用醋酸乙酯对牛耳
草进行提取，得到了 7 个甾体类和 1 个三萜类
化 合 物 ， 郑 晓 珂 等 [26] 利 用 Diaion HP-20 、
Sephadex LH-20、Toyopearl HW-40、硅胶柱等
柱色谱技术对牛耳草成分进行分离纯化，得到
了 5 种糖醇类物质，而本研究则检测到了 200
余种物质，远高于其他方法。而鲜样和干样中
代谢物的具体变化及这些变化与牛耳草脱水前
后生理生化活动变化及其耐脱水复苏机制的关
系还有待进一步研究。

致 谢：本研究得到中科院植物所分子生理重
点实验室漆晓泉研究员和薛震工程师的指导，
解丽霞和孟献斌等同学参与部分数据分析，在
此一并致谢！
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