全 文 ：药学学报 A et aP h a r mo u e et i e as i ni e a8 8 1 9;2 3 ( 7 ) :5 1 1~ 导 15
大丁 草 中抗 菌 活 性 成分 的 研究 :
人肠道微生物对大丁贰及其类似物的代谢产物
谷黎红 李 铣 陈英杰 朱廷儒
一 丫 一 、 犷 - - - -一 -
( 沈阳药学院天然药物研究室 )
一 提要 本文论述了人肠道微生物对大丁草中三种香豆精贰类化合物的代谢产物研究 。 鉴 定 了
其中两个主要代谢物的结构和代谢物随时间变化的情况 。 发现了一种香豆精的新型代谢方式 。 从
而初步阐明这类化合物在体内发挥抑菌作用的原理 。 为今后更好地应用该植物及主要活性成分提供
了理论依据 。 、 丫
「 关键词 大丁草 ; 大丁戒 ; 代谢物 ;一 肠道微生物 `
一 扮寸 , 一份十一一一一份份
一 大丁草 ` 翻 be : 。 a 二。 二咖讯 ( L ) Shc 一 iB p是我国民间用作清热利湿 、 解毒消肿 、 止咳 、
止血的中草药 。 我们曾从中分离到十几种化合物 , 并发现其中的大丁贰元和大丁双香豆精为
主要抑菌活性成分 ( ’ , 2 , 。 大丁式在全草中含量较高 , 约为 1一 2% , 在体外抑菌实验无效 , 而
在动物体内可以产生抑菌作用 , 尤其对绿脓杆菌感染的动物 , 可以使50 % 以上的动物存活 ` “ , 。
为了搞清大丁草抗菌作用的机理 , 我们对大丁贰和人肠道微生物进行了代谢培养 。 从培养物
中分离到大丁试元 ( I劝 和大丁双香豆精 ( I ) , 从而证明体内抑菌作用是由于 I 和 H 的存在所
产生的 。 . 一 」 一 _
一 … 一 材 料 和瘾 - -材料 大丁草采 自沈阳北陵和东陵 、 一 - 一 J . -
一 人肠道微生物混合物由人的新鲜粪便获得 。 .
药品及试剂 化合物毛 1 , V , v I H和 I X 均为 自制 , 经光谱及 物理常数测定 , 证明纯度
大于 9 % 。 卜
粪便稀释液参照 M ist u o k a ` 4 ’ 方法 , 含有溶液 A : ( 0 . 78 % K Z H P O 4 ) 37 .5 m卜 溶 液 玖
( 0
.
4% K H
Z P O 4一 .1 18 % N a CI 一 1 . 2% (N H户2 5 0 4一 0 . 12 % C a C 12一0 . 25 % M gS O 4 · H ZO )
37
.
s m卜 .0 35 g L二半耽氨酸 J .0 5 乡卜抗坏血酸 , 加水稀释到 10 0 m l, 并用 8% N a Z C O 3
调 p H 值使在 7一 8的范围 。 一
厌氧培养液 `。 ’ K Z H p o 4 · 5 H Zo g一 7 9 ; K H: p o , 2 9 ; M g S 0 4 · 7 H 20 0 . 2 0 5 9 ; 拘 橡酸 钠
·
2 H ZO 0
.
5 3 2 6 9 ; 葡萄糖 · H ZO 2 . 2 g ; 硫酸按 1 9 加蒸馏水至 l o 0 O m l 。
焦性没食子酸和氢氧化钠均从市场购得 。 所用药品及试剂均为分析纯试剂 , 、
代谢物的层析 : 柱层析用硅胶为上海五四化工厂产品 。 粒度为 20 0~ 30 0 目 。 薄 层层析
用硅胶 H 系青岛海洋化工厂产品 , 用 .0 25 % 的叛 甲基纤维素 钠 作 粘 合 剂 。 ,展开 剂 系 统
A
.
C H CI ” B
.
C H C1
3一Et O A c ( :2 0 . 25 ) ; C . C H C1 3一M e O H ( :2 0 . 2 5) 。 显色剂 .1 碘 ;
2
. 喷洒 _ 50 %的 H声0 4 乙醇溶液后在紫外灯下观察荧光 。 一 -
仪器 熔点测定用毛细管法 , 温度计末校正 。 红外光谱用 eP r k in lE m er 5 9 B型红外分
本文于 19 8 7 年 7 月 1 1 日收到 O
DOI : 10. 16438 /j . 0513 -4870. 1988. 07. 006
药学学报 A e t a P h ar mae e u t i e a i Sn i e a 1 9 8 8; 2 3 ( 7 ) :51 1 ~5 1 6
光光度计 ( K Br 压片法 )测得 。 核磁共振用 FX 一 6 0Q 核磁共振光谱仪 ( TM S内标 ) 。 薄层扫描
用岛津 c s一 91 0双波长薄层扫描仪 。 高效液相色谱用旧立 6 35 高效掖相色谱仪 。
实 验 方 法
人肠道微生物混合物的制备 从健康人获得的新鲜粪便立即转移到塑 料袋 中 , 充 人氮
气后 , 用手机械柔压塑料袋 , 使内容物混合均匀 。 粪便用 2 5 倍体积的稀释液稀释 ,所获得的
粪便悬浮液供作以下实验用 。
大丁试 (V )与肠道微生物混合物的培养 把 v (9 6 6 m g )和含肠道微生物的稀释液 1 0 0 o m ;
加到三角烧并中 , 将其放人厌氧培养器 中 , 加人适量焦性没食子酸和 5%氢氧化钠 水溶液作
抗氧剂 。 然后反复用氮气置换厌氧培养器中的空气 。 将厌氧培养器放到 37 OC的孵育 箱 中 培
养 24 h , 其间如有必要 , 可重新充入氮气数次 。 培养液用正丁醇萃取三次 , 正丁醇液于 5 “ C
减压回收 , 得到残渣 3 9 。 将残渣用甲醇溶解加入 10 9硅胶拌样 , 然后加到含有 1 50 9硅胶的
柱上 , 以氯仿 、 氯仿一 甲醇不同比例洗脱 , 得到晶 I 约 10 m g , 晶 H 约 8 m g 。
大丁试元 ( 11 )与肠道微生物混合物的培养 将贰元 2 m g 加 到 含有 肠道微生物的培养液
2
.
s ml 中 , 混合物在厌氧条件下培养 s h , 然后用乙酸乙醋萃取三次` 乙酸乙醋 液 在真空下
浓缩至干 , 混合物用甲醇溶解后进行 T L C 层析 , 只检出 I 。
一大丁纤维二糖试 ( V l l )与肠道微生物混合物的培养 取 V H I 适量分 装于 2 支 刻度试管
中 , 以下操作同大丁贰元 。 T L C检查结果 , 在 Z h时 , 有大丁贰的生成 。 而在 s h只检查出 I
和 H 的生成 。
大丁龙胆二糖试 (I X )与肠道微生物混合物的培养 在 2 支刻度试管中分别加人 I X Zm g ,
以下操作同大丁贰元 。 T L C 检查结果 , 在 l h生成 V 与 H , 用溶剂系统 B 及 C ,显色剂用 2 。
在 s h生成 I , 用溶剂系统 A , 显色剂用 1。 `
大丁试代谢的时间过程 取 12 支刻度试管 , 每支中含有 v s m岛 分别加入新鲜粪便约
20 0 m g和厌氧培养液 5 m l , 3 7 O c 培养 , 不同时间取样后分别用正丁醇萃取三次 , 合 并正丁
醇液 用真空干燥器干燥 。 残渣用甲醇溶解至 2 m l 。 用薄层扫描观察 V 的含量变 化 。
代谢物 I 和 H 的时间过程 取 12 支刻度试管 , 每支中含有 V 5 m g , 操作同上 , 用乙酸
乙醋萃取 , H P L C 检查 H 和 I随时间变化情况二
防腐剂对 V 代谢 的影响 取 3 支试管 , 分另lJ加人邻苯二酚 10 m g ,焦性没食子酸 10 m g ,
没食子酸 甲酷 10 m g , 加人新鲜粪便后培养 4 h , 每管分别加入大丁贰 5 m g , 3 7 “ C 培养 s h ,
分别用乙酸乙醋 5 m l 萃取一次 , T L C 检查结 果 。
结 果 与 讨 论
一 代谢物的结构鉴定 、 一 - -
晶 1 m p 2 6 2~ 2 6 o4 c 。 J R , ’ H N M R 及 R f 值均与标准品一致 , 一 证明为大丁双香豆精 。
晶 1 m p 2 9~ 2 31 OC , I R , ’ H N M R 及 R f 值均与大丁试元相同 , 证明为大丁试元 。
二 . 可能的代谢途径 _ -
v
,
v n l 和 I X 均为香豆精葡萄糖式 , 其区别只是连接的糖数不同 , v 经人肠道微生物
培养后主要代谢物为大丁贰元和大丁双香豆精。 VI H 和 xI 经人肠道微生物培养后主要生 成
V
, I 和 H 。 以上化合物的结构如下所示 ;
药学学报 A e t aP h ar m e ae u t i e asi ni e a1 98 日 ;23 ( 7 ) :5 1 1~ 5 1 5
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据文献介绍 “` ’ , 在人和动物的肠道中有一些细菌 , 可以产生庄试键裂解酶 , 使贰类化合
物水解生成糖和贰元 。 V , V H I 和 I X 生成次级贰和贰元就属于这一类反应 。
由 n 的代谢培养生成 I 可以说明 I 是通过 H 的产生而进行的进一步代谢 。 虽然体 外 可
以用 H 与甲醛在中性条件下缩合产生 I , 体内 H 也有可能以这种方式与微量甲醛反应产生 l ,
但也不能排除体内酶参与该步反应 。 I 的生成显示一种新型的代谢途径 , 并提示含有 4 一位经
基香豆精类化合物有可能在肠道进行缩合 , 然后进入体内发挥作用 。 ! 们
虽然我们在对 v H I 和 I X 进行短时间培养时 , 发现 V 的生成 , 但仍不能完全肯定双糖贰
必须经过单糖试 , 继而代谢成贰元 。 其可能的代谢途径如下 :
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,
V l l l a n d I X
三 . 代谢反应的时间过程
图 1 显示了 v 被人肠道微生物代谢的时间过程 。 V 在 s h内几乎全部消失 , 说明 V 被很
快转变成 I和 H 。
图 2 显示了 H P L C 测定代谢产物 I 和 H 的含量随时间而变化的情况 。 H在 s h含量最高 。
I 在 3 6 h 含量最高 。 H 在开始产生时曲线很陡说明 v 很快 就 被水解产生 n 。 随着时间的延
长 , H 的含量开始逐渐下降 , 但到 48 h 又稍有回升 , 这可能是 由 于 H 与 I 之间的互相转变
药学学报 A e t a P h a r m。心 。 u t i e a S in i e a _1 9 8 8; 2 3 ( 7) : 5 1 1 、 5 2 5
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的缘故 。
1 经 s h 培养 , 全部转变成 I 。 但是 V 经 24 h 后 , 除检出 I 外仍能检出 1 。 这是 由于 V
转变成 1 需要一定的时间过程 , 生成的 1 又要经一定的时间才能转变 成 I 。 此 外 , 由 于 V
使用了不同批号的新鲜粪便 , 其中酶的活性及其它因素的影响 , 也可以造成 V 的代谢较 n 和
I X 慢 。
V n l 与 IX 经过 s h 培养后 , 除二者都检 出 I 以外 , V I H 中还检出了 H , 这说明尽管
二者均为双糖贰 , 但代谢速度不一致 , V H I 的代谢较 I X 的代谢要慢 。 化学上不同连接位置
的多糖水解实验证明 1 , 6 连接的糖较 1 , 4 连接的糖易水解 。 假设体内代谢中也存在这种水解
顺序的话 , I X 则较 V H I 易被水解 。
四 . 防腐剂对V 代谢的影响
使用 的防腐剂对 H 的产生均无影响 。 但焦性没食子酸与邻苯二酚阻碍了 I 的生成 。 其原
因可能是与 H 竞争 甲醛或抑制细菌产生相应酶 。
五 . 代谢物 I 和 n 的抑菌活性
大丁式在体外不具抑菌作用 。 大丁纤维二糖贰 V H I 和大丁龙胆二糖贰 I X 在体外对金黄
色葡萄球菌的最小抑菌浓度仅为 o . s m g /m l 。 而大丁双 香豆精 I 和大丁贰元 H 的 抑 菌浓度
分别为 0 . 12 5 和 o . 2 5 m g /二1。 说明 I 和 11为大丁草在体内发挥抑菌作用的主要活性成 分 。
尽管文献报道人类粪便中的细菌丛因人而易 , 并受多种因素影 响 , 如 性 别 、 年令 、 饮
食 、 环境 、 生活习惯和使用抗菌药物等 。 但对 V 的反复代谢实验研究显示在所使用的条件下
没有明显的变化 。 由三个不同性别的人所提供的粪便样品并未发现明显区别 。 这说明一些经
常存在于肠道的细菌丛参与了代谢过程 。 然而进一步研究用以证明个体之间以及每夭在肠道
微生物作用下发生代谢活性变化还是必要的 。
致谢 本校侧试中心 、 辽宁省理化测试中心协助测定各种光谱数据 。 中国科学院林业土壤研
究所杨志勇协助测定 H P L c 。
药学学报 A e ta P h a r m a e e u ti e a S in i e a 1 9 8 8 ;2 3( 7 ) : 5 1 1 ~ 51 5 5 15
参 考 文 献
1
.朱廷儒 , 等 . 大 1 一`草中一种新葡萄糖试的分离和鉴别 . 沈阳药学院学报 19 81 , (1 2) : 36 .
2
. 谷黎红 , 等 . 大丁草中抗菌活性成分的研究 . 药学学报 1 9 87 ; 2 2 : 2 7 2 .
3
. 冯玉书 、 施一鸣 . 大丁草及大丁式抗菌作用的实验研究 . 沈阳药学院学报 1 9 8 1 , ( 12 ) : 39 .
4
.
H a t t o r i M
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P h a r m B 叹 11
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Y o s h i o k a l
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a l s o s h o w e d a n t i b a e t e r i a l a e t i v i t i e s
.
T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e a n t i b a e t e r i a l a e t i v i t i e s
o f e o m P o u n d s V
,
V l l l a n d I X a r e e o n n e e t e d w i t h t h e P r o d u e t i o n o f e o m P o u n d s l
a n d 11
.
A n e w m e t a b o l i e P a t h w a y o f 4
一 h y d r o x y e o u m a r i n h a s b e e n f o u n d
.
K e y w o r d s G e 犷b e 犷a a , a ” d : 感a ( L ) S e h一 B I P . : G e r b e r i n s i d e : M e t a b o l i t e : I n t e s -
t i n a l b a e t e r i a