全 文 ：ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.23No.52007May
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0引言
鹿茸是与人参齐名的传统中药材，在我国已应用
了两千多年，可谓家喻户晓。但鹿茸还能作为一种难
得的生物医学模型这一点，却鲜为人知。鹿茸角作为
鹿科动物特有的标志，也是绝大多数鹿科动物的雄性
特征，鹿茸角每年再生和脱落一次。鹿茸角是唯一的
基金项目:项目来源“国家自然科学基金两个基地项目”（30510403163）；“国家自然科学基金项目”（30571340）
第一作者简介:冯海华，女，1970-，山东省临朐人，讲师，在读博士，硕士，主要从事兽医药理学方面的研究。通信地址：130062吉林省长春市西安大路5333
号吉林大学畜牧兽医学院，Tel：0431-87986162，E-mail：fhh70@163.com。
通讯作者:邓旭明，男，1964-，教授，博士，主要从事兽医药理学方面的研究。通信地址：130062吉林省长春市西安大路5333号吉林大学畜牧兽医学院，
Tel：0431-87986162，E-mail：xumingdeng@yahoo.com。
收稿日期:2006-08-16，修回日期：2006-08-30。
鹿茸角软骨细胞体外培养方法的建立
及生长特性分析
冯海华,赵丽红,岳占碰,宋 宇,李乾学,范君文,邓旭明
（吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062）
摘 要:【研究目的】建立梅花鹿鹿茸软骨细胞体外分离培养和扩增方法,观察鹿茸软骨细胞在体外培
养的生物学特性,为鹿茸再生机理的研究奠定基础;【方法】体外分离培养鹿茸软骨细胞,采用组织
学、MTT比色法、免疫组化等多种手段动态检测细胞生长增殖情况;【结果】核心部分,约 150字鹿茸
软骨细胞贴壁生长,原代细胞比传代生长速度快,原代及传代 4代内的鹿茸软骨细胞均有活跃的增
殖能力,软骨细胞呈三角形,多边形等多种形态,I型胶原免疫组化,甲苯胺蓝染色为阳性;【结论】体
外分离培养鹿茸软骨细胞具有较强的增殖能力,传代培养 4代内细胞生长旺盛并维持其生物学特
性,可满足后续实验研究要求。
关键词:软骨细胞;细胞培养;鹿茸
中图分类号:Q78,S852.65 文献标识码:A
GrowthandBiologicalCharacterofChondrocytesfromDeerAntlerinVitro
FengHaihua,ZhaoLihong,YueZhanpeng,SongYu,LiQianxue,FanJunwen,DengXuming
（ColegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun130062）
Abstract:【Objective】Toestablishtheinvitrocultureandexpensemethodsofsikadeerantlerchondro-
cytesfortheinvestigationofantlerregenerationstudyandanalyzethebiologicalcharacterofcultured
antlerchondrocytes.【Method】Bythetechniquesofcelcultureinvitro,thecultureinvitrooftheantler
chondrocyteswereperformed.Thecelsgrowthwascheckedupbyapplyingthewaysofhistology,MTT
assayandimmunohistochemistry.【Results】Theantlerchondrocytesgrowthrapidlyinplasticcelcultural
boardandchondrocyteslpopulationdemonstratesextensiveproliferationandretainsthecapacityfromo-
riginalpassagetopassage4.Theoriginalcelsgrowthwasfasterthanthepassage.Theantlerchondrocytes
weretriangle,polygonandothershape.Immunochemistryresultsshowedthattheculturedcelswereposi-
tiveforcolagenIand.dDyeingoftoluidinebluewaspositivet.【Conclusion】Theresultsshowedthatthe
chondrocytesofisolatedantlerpresentedproliferousabilityinculturebyourmethod.Chondrocytescanbe
culturedandextensivelyproliferateandretainbiologicalfeatureforatleastfor4passages.Themethodsof
antlerchondrocytesculturecanbeusedfortherelatedcontinuedresearch.
Keywords:Chondrocyte,CelCulture,Antler
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一种能够每年完全再生的哺乳动物器官，因此为我们
提供了探索自然界是如何解决了哺乳动物器官再生
的机会[1,2]；鹿茸是哺乳动物生长速度最快的组织，在
快速生长期其速度每天可达20mm以上！令人吃惊的
是，在这样快速情况下形成的鹿茸组织竟是井然有
序，没有任何出现癌变的迹象[3]。软骨是鹿茸中的主
要组织，而对鹿茸软骨细胞的分离培养及生物学特性
研究尚未见报道，本实验研究了鹿茸软骨细胞的体外
分离、培养及部分生物学特性，为鹿茸生长规律及其
调控的研究奠定了基础。
1材料与方法
1.1试验材料
实验于 2005年 4月—2006年 6月在吉林大学
畜牧兽医学院基础兽医研究室完成。4岁龄健康梅花
鹿由农科院左家特产研究所提供。
1.2试剂
IMDM(GIBCO)；透明质酸酶，胰蛋白酶，胶原酶
Ⅱ(Sigma)；胎牛血清(四季青)；台盼兰，甲苯胺蓝
（Sigma）；噻唑蓝（MTT）（华美生物）；二甲基亚砜
（DMSO），左旋咪唑（Sigma）；兔抗人 I型胶原
（colagenI，colI）多克隆抗体，兔 IgG（北京中杉）；
生物素化羊抗兔 IgG，AP-链霉卵白素，ABC显色试
剂盒（武汉博士德）。
1.3鹿茸软骨细胞分离
在鹿茸生长的中期锯取其鹿茸（图1A）。迅速带
入细胞培养室的准备室消毒，并用手术刀切取 5cm
长的鹿茸尖部。将切下的鹿茸尖部组织带入细胞培养
室，用手术刀从中央部纵向切开以暴露茸尖内部组
织。立即依据Li等[4]的取材方法，在解剖显微镜下定
位和切取鹿茸的软骨组织（突起部的下侧，图1B）。取
下软骨，移入小瓶中，用d-Hanks液洗三次，将软骨尽
可能剪碎，依次用0.1%透明质酸酶，0.25%胰蛋白酶，
0.1%的I型胶原酶消化，100μm滤网过滤，D-Hanks
液洗三次，收集细胞，计数，台盼兰染色检测活力。
A
B
图1A.所用梅花鹿的取材部位 B.鹿茸取材部位纵切图
1.4鹿茸软骨细胞的培养,冻存和复苏
收集到的软骨细胞，用含10%血清的IMDM培
养液稀释成5×105/mL密度，接种于细胞培养瓶，于
37℃、5%CO2培养箱中培养，每天倒置显微镜下观察
细胞生长情况，每隔两天换液一次。待细胞长满单层
后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA分散细胞，用IMDM培
养液调整密度为 5×105/mL接种于培养瓶及有盖玻
片的6孔培养板中继续培养，倒置显微镜下观察细胞
生长情况，盖玻片中细胞长至80%融合时取出做HE
染色及后续的免疫细胞化学检测。
培养第二代的软骨细胞达融合后，用0.25%胰蛋
白酶 -EDTA消化、离心并收集细胞，加入 1mL冻存
液，采用分级冷冻方法，次日移入液氮中冻存。复苏
时，从液氮中取出冻存管，37℃水浴中速融，迅速移入
含有培养液的离心管中1000g/min离心 5min，弃上
清，重新加入新鲜培养液，吹打成均匀细胞悬液，计数
细胞，台盼兰检测活力，接种培养。
1.5鹿茸软骨细胞生长曲线分析
采用MTT比色法[5]作贴壁细胞增殖活性测定，2
代及 6代细胞接种入 96孔培养板中，细胞密度为
1×105/mL，同时设不含细胞的空白对照孔。每天随机
抽取 3个培养孔，加入 MTT，继续培养 4h，加入
DMSO，吹打至沉淀完全溶解后，用酶联免疫检测仪
测定波长570nm处的光吸收度（OD），比色时用空白
孔调零，计算平均值，以时间为横坐标，平均光吸收度
为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.6鹿茸软骨细胞鉴定
通过甲苯胺蓝染色和colI免疫细胞化学方法鉴
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定。
甲苯胺蓝染色[6]，取融合达 80%细胞，固定后加
入10g/L甲苯胺蓝染液，室温下染色4h，95%酒精洗
去多余的染液。
免疫细胞化学方法：培养细胞至有盖玻片的6孔
培养板，细胞生长到80%融合时，取出盖玻片，PBS冲
洗，室温自然风干，多聚甲醛室温固定30min，蒸馏水
洗；0.2%Triton穿孔 2h，PBS冲洗；3mM左旋咪唑去
除内源性的碱性磷酸酶，PBS冲洗；滴加10%正常山
羊血清，室温封闭30min，除去多余液体；滴加一抗工
作液兔抗人colI多克隆抗体，阴性对照用兔的IgG，
4℃过夜，PBS冲洗；滴加生物素化二抗羊抗兔IgG，
37℃30min，PBS冲洗；滴加AP-链霉卵白素，PBS冲
洗；用ABC试剂盒室温显色。
2结果
2.1培养鹿茸软骨细胞的形态学特征
分离及复苏的软骨细胞进行台盼兰染色以确定
细胞的活性，结果表明本试验中所用的细胞活性都在
90%以上。随培养时间的延长，悬浮细胞逐渐破碎，随
换液次数增多而被清除。
原代鹿茸软骨细胞在刚接种的悬液中细胞呈圆
形，接种8～10h，细胞开始贴壁生长，大多数仍呈圆
形，部分细胞有伪足伸展，24h后观察有大量贴壁细
胞，第3d出现有散在克隆生长，细胞呈多边形。第4、
5d时呈克隆式增殖，第5d时细胞数量增加了约 10
倍，原代培养6d左右可达到90%细胞融合，第7d基
本铺满单层，细胞界面不清，细胞呈三角形、多边形等
多种形态，常伴有凸起。
传代细胞与原代相比生长较慢，传代后，20h才
发现有贴壁细胞，一般于接种后5、6d进入对数增殖
期，到8d可达到90%融合，此时鹿茸软骨细胞生长逐
渐缓慢。贴壁细胞形态基本与原代相似，HE染色如图
2所示。
2.2鹿茸软骨细胞生长曲线分析结果
培养早期的细胞增殖速度较快，从第5代起细胞
增殖速度减慢。比较第2代和第6代的鹿茸软骨细胞
的生长曲线（图3），发现前者的增殖速度快。
2.3鹿茸软骨细胞鉴定结果
甲苯胺蓝染色染色可见蓝染（图4A）。
对培养鹿茸软骨细胞进行了colI免疫细胞化学





















     
 






 
图2传代细胞爬片的HE染色 细胞贴壁增殖,呈
三角形、多边形等多种形态(×400) 图3不同代数鹿茸软骨细胞生长曲线比较
图4鹿茸软骨细胞鉴定结果 A.甲苯胺蓝染色(×250倍);B.免疫细胞化学阳性结果(×250倍);
C.免疫细胞化学阴性对照(×250倍)
CA B
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分析，原代、1代、2代、3代、4代细胞colI染色均呈
阳性反应，阴性对照无颜色反应（图 4B，4C），在第 4
代出现阴性细胞，以后各代阳性细胞逐渐减少。
3讨论
鹿茸药用价值最高的部分是在软骨，软骨组织是
由软骨细胞和致密的细胞间基质组成，软骨细胞是软
骨组织的主要细胞成份，在软骨的生长及功能代谢中
起着重要作用。在体外分离培养过程中，为使软骨细
胞能够从细胞间基质中游离出来，可以用酶消化法去
除基质才能获得游离的细胞。本实验采用透明质酸
酶，胰蛋白酶，I型胶原酶依次消化，裂解硫酸软骨
素、胶原蛋白等细胞间基质，使软骨组织松软。这种方
法可获得数量多、活力强的细胞，可以满足相关实验
研究需要。
软骨细胞的生物学特征包括形态学特征和分泌
特征[7]。本研究鹿茸软骨细胞形态学特征：光镜下单
层培养的细胞呈三角形或多边形等，原代和传代的细
胞生长速度不同，形成单层的时间也不同。蛋白多糖
及胶原是软骨细胞特征性的分泌基质，为其分泌特
征，它们是软骨细胞外基质的主要组成成份，在软骨
的抗压、抗变形等功能活动中有重要作用[8]。各个生
长时期的软骨细胞均可分泌I型胶原，为软骨细胞
特征性的表型，可用于鉴定[9,10]。另外，通过其分泌的
蛋白多糖基质的甲苯胺蓝染色结合Ⅱ型胶原的免疫
组化染色，再结合取材部位和培养观察可进一步确
定[10]。本实验甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原免疫组化
染色显示胞浆染成红色，提示分离的细胞为软骨细
胞。
软骨细胞可以同时表达I、I型胶原，I型胶原主
要分布在纤维层、增殖层和钙化软骨层，I型胶原主
要在软骨层分布[10]。本实验观察到鹿茸软骨细胞在传
代过程发生了I型胶原表达的更迭，可能是培养软
骨细胞处于不同分化阶段所至，所以当这些细胞所占
的比例发生改变时，引起了I型胶原总体表达上的
差异。本实验中第5代鹿茸软骨细胞表达I型胶原
开始减少，可能与该阶段一些软骨细胞发生去分化有
关。体外培养的鹿茸软骨细胞在细胞形态的变化、I
型胶原表达的更迭等方面与体内鹿茸软骨细胞向钙
化软骨层递进时的变化特征近似。分离的鹿茸软骨细
胞能够适应体外培养环境，可以进行体外扩增，传代
后的软骨细胞贴壁时间比原代稍长，增殖速度减慢，
但是在4代内细胞仍然生长旺盛，并且colI表达特
征维持不变。该方法的建立，为进一步研究鹿茸的再
生机制提供技术平台。
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（责任编辑：王芬露）
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