全 文 ：北方药学 2012年第 9卷第 4期
基于rbcL序列鉴别十大功劳叶及其伪品
谭丽盈 郑 婕（广州中医药大学第一附属医院 广州 510405）
摘要：目的：利用叶绿体基因 rbcL序列探讨十大功劳叶及其伪品枸骨叶的分子鉴定方法。方法：分别提取十大功劳叶的植物基
因组 DNA，经 PCR扩增后测序，利用相关软件对序列进行分析。结果：所得各样品的 rbcL序列长度为 655bp，共存在碱基差异
49bp,从构建的系统分枝树可知，各物种可明显分开。结论：rbcL序列可用于鉴定十大功劳叶及其伪品。
关键词：十大功劳叶 伪品 rbcL序列 鉴定
中图分类号：R282.5 文献标识码：B 文章编号：1672-8351（2012）04-0001-02
Molecular identification of Folium Mahonia and its adulterants using rbcL sequence
Tan Liying Zheng Jie（No.1 Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou，China，510405）
Abstract：Objective:To perform the molecular identification for Folium Mahonia and its adulterants using rbcL gene sequences.
Methods: The DNA of Folium Mahonia was extracted and gene sequence was amplified by PCR.PCR product was directly sequenced
after purification.Sequences were analyzed with related software.Results:The rbcL gene length of the proceeds of each sample was
655bp.The number od variation sites is 49bp.In the cluster dendrogram，all species distinguished from each other.Conclusion :The
rbcL gene could be used to identificate Folium Mahonia and its adulterants.
Key word：Folium Mahonia Adulterants RbcL gene Identification
十大功劳叶又名功劳叶，为小檗科十大功劳属植物阔叶
十大功劳 Mahonia bealei（Fort.）Carr.及狭叶十大功劳 Mahoni－
a fortunei （Lindl.）Fedde、华南十大功劳 Mahonia japonica
（Thunb.）DC的干燥叶[1]，主产于广西、四川、湖南等地，具有清
虚热、燥湿、解毒的功效，主治肺痨咳血，骨蒸潮热，腰膝酸痛，
湿热黄疸，带下，痢疾，风热感冒，目赤肿痛等症[1，2]。现代药理
研究表明，十大功劳叶具有抗病毒、降血压、降血糖、抗血小板
凝集和抗氧化等作用[3]，日益受到众多专家学者的关注。
十大功劳叶为我国南方地区传统的清热解毒要药，历代
本草对其名称记载各异[4]，多次将十大功劳叶记载为枸骨叶，
而现代所用枸骨叶实为冬青科植物枸骨 Ilex cornuta Lindl.ex
Paxt.的干燥叶，十大功劳叶为小檗科阔叶十大功劳、狭叶十大
功劳、华南十大功劳植物的干燥叶，故十大功劳叶的古今记载
不一致，再加上两者的性状较为相似，因而常引起十大功劳叶
与枸骨叶的使用混乱的现象。国内已有较多文献[5～8]从药材性状
的角度鉴别十大功劳叶及其伪品，本文尝试通过对比研究十大
功劳叶及其伪品叶绿体基因 rbcL序列的差异，从分子生物学
的角度为十大功劳叶及其伪品的鉴别提供新的参考依据。
1 材 料
1.1材料
材料来源详见表 1，包括实验样品及来自 Genbank上所下
载的序列。
表 1 实验样品情况
1.2试剂与仪器
植物基因组 DNA提取试剂盒（北京天根生物技术有限公
司）；Tris碱（上海爱紫特生物科技有限公司）；Taq DNA聚合
酶、10×PCR Buffer缓冲液、dNTP（TaKaRa宝生物工程（大连）
有限公司），PCR 扩增引物合成（广州赢森生物科技有限公
司）；D-37520型台式离心机（德国 Eppendorf公司），PTC-100
型 PCR仪（美国 M J Research公司），DDY-Ⅲ型电泳仪（北京
六一仪器厂），凝胶成像系统（BIO-RAD公司）。
2 方 法
2.1 DNA提取
材料均为叶片，硅胶干燥后，取样约 10mg，液氮研磨后，
用植物基因组 DNA提取试剂盒按说明书方法提取。
2.2 PCR扩增及测序
扩增引物及 PCR反应体系参考石林春[9]的报道，上游引物
为 5-ATGTCACCACAAACAGAAAC-3，下游引物为 5-TCG－
CATGTACCTGCAGTAGC-3，PCR反应体积为 25μl，PCR产物
送至广州赢森生物科技有限公司利用 ABI 3730XL测序仪进
行测序。
2.3数据处理
测序结果采用序列拼接软件 CodonCode Aligner V2.06
（CodonCode Co.，USA）校对拼接，去除低质量序列及引物区，
利用 MEGA 5.0软件计算其遗传距离，进行系统发育分析。空
位（Gap）被处理为缺失（M issing），以邻接法（Neighbor Joining，
NJ）构建系统分枝树，利用 bootstrap（1000次重复）检验各分支
置信度。
3 结 果
将去除低质量片段及引物片段的 rbcL序列上传至 Genbank
中，获得 Genbank登录号分别为 JQ670936、JQ670937，并从
Genbank上下载华南十大功劳及枸骨叶的 rbcL，进行综合分析。
3.1种间差异比较
实验所得的十大功劳叶及其伪品植物的 rbcL序列仅为植
物叶绿体基因 rbcL序列的一部分，实验所得的十大功劳及其伪
品的 rbcL序列长度为 655bp，共存在碱基差异 49bp，见图 1。从
遗传距离看，十大功劳及其伪品的种间平均距离为 0.039，十大
功劳属的阔叶十大功劳、狭叶十大功劳、华南十大功劳的遗传
距离较近，与冬青科的枸骨叶的遗传距离较远，见表 1。
图 1 十大功劳叶及其伪品的 rbc:L序列差异位点
表 1 十大功劳叶及其伪品的 rbc:L序列遗传距离
3.2系统分支树分析
编号 材料 采集地 标本号 Genbank号
1 阔叶十大功劳 广东华南药用植物种质资源库 JQE-001 JQ670936
2 狭叶十大功劳 广东华南药用植物种质资源库 JQE-002 JQ670937
3 华南十大功劳 —— —— EF173672
4 枸骨叶 —— —— GQ436364
1 2 3 4
1 —
2 0.003 —
3 0.000 0.003 —
4 0.076 0.076 0.076 —
·药品质量及检验·
1
北方药学 2012年第 9卷第 4期
以邻接法构建系统分枝树，由系统分支树可见阔叶十大
功劳先与华南十大功劳聚为一支，再与狭叶十大功劳聚为一
支，最后再与枸骨叶聚在一支。十大功劳属植物明显聚类在一
起，而枸骨叶则单独分离，这与传统分类学结果相一致，见图
2，并且其分支的支持率达到 70，结果可靠。
图 2 十大功劳叶及其伪品的 rbc:L序列系统分支树
4 讨 论
目前利用基因鉴别中药的方法很多，王艇等[10]曾利用 RAPD
技术鉴别小檗科的植物。虽然 RAPD技术快速简便，对 DNA
模版要求低，但是 RAPD技术实验结果的重复性易受多因素的
影响，作为物种鉴别的效果不佳。而 rbcL序列是编码核酮糖-
1，5-二磷酸羧化/加氧酶大亚基的叶绿体基因，具有通用性好、
易扩增、易于进行序列比对等优点[9]，可用于进行物种鉴别。
从十大功劳叶及其伪品的 rbcL序列的比对结果可知，十
大功劳属内物种之间的植物遗传距离较小，而与枸骨叶的遗
传距离较大。从系统树结果可知十大功劳叶聚为一支，枸骨叶
聚为一支，两者之间存在明显的遗传差异，提示 rbcL序列可用
于十大功劳叶及其伪品的鉴别。
参考文献
[1]南京中医药大学.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版
社，2006:13-14.
[2]国家中医药管理局《中华本草》编委会编.中华本草（第八卷）
[M].上海市：上海科学技术出版社，1999：1916-1919.
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大学学报，2009，33（3）：431-432.
[5]刘振启，刘杰 .枸骨叶与十大功劳叶的鉴别[J].首都医药，
2011，18（11）：48.
[6]穆桂荣，胡书云.谈十大功劳叶和枸骨叶的鉴别与使用[J].首
都医药，2008，15（12）：48.
[7]李宏建.十大功劳叶和枸骨叶的植物来源比较[J].海峡药学，
2007，19（10）：81-82.
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2007，25（1）：168-169.
[9]石林春.姜科药用植物 DNA条形码鉴定研究[D].西北农林科
技大学，2009.
[10]王艇，苏应娟，朱建明，等.部分小檗科植物的 RAPD分析
[J].植物研究，2001，21（3）：428-431.
HPLC法测定新红花-8味丸中羟基红花黄色素A的含量
白凤英（内蒙古兴安盟扎赉特旗蒙医院 兴安盟 137600）
摘要：目的：建立新红花-8味丸的含量测定方法。方法：样品用 25%甲醇溶液稀释，在 C18柱上以甲醇-乙腈-0.7%磷酸（26∶2∶72）
为流动相，在波长 403nm处检测羟基红花黄色素 A。结果：羟基红花黄色素 A在 0.126~1.686μg范围内呈良好的线性关系，r=
0.9999，平均回收率为 100.30%，RSD为 0.91%。结论：本法灵敏、准确、简易易行、重现性好。
关键词：红花 HPLC 羟基红花黄色素 A
中图分类号：R927.2 文献标识码：B 文章编号：1672-8351（2012）04-0002-02
本品为红花、紫檀香、木鳖子（制）、熊胆粉、地锦草、草果、
扁豆花、射干等八味药组成的复方制剂，红花为处方中主要药
味之一。参照《中国药典》[1]2005年版一部“红花”项下的含量测
定方法，以羟基红花黄色素 A作为指标成分，进行含量测定方
法研究，经分析方法验证，该方法重现性好，专属性强，方法中
其他成分对羟基红花黄色素 A的测定无干扰，故收入质量标
准中。
1 仪器与试剂试药
1.1仪器
岛津 LC-20 泵，CBM-20A 型控制器，SPD-M20A 型检测
器，LCsolution色谱工作站，Mettier AE-100电子分析天平，PL-
203梅特勒-托利多电子天平。
1.2试剂与试药
羟基红花黄色素 A 对照品（批号 111637-200502 供含
量测定用）中国药品生物制品检定所；新红花-8 味丸（批
号：20080328、20080715、20090311） 由内蒙古中蒙医院提
供；甲醇、乙腈为色谱纯，水为高纯水，其他试剂均为分析
纯。
2 色谱条件
岛津 C18色谱柱（250×4.6mm、5μm）。流动相：甲醇-乙
腈-0.7%磷酸（26 ∶2 ∶72），流速：1mL·min -1，测定波长：
403nm。柱温：30℃，羟基红花黄色素 A 理论板数不得低于
3000。
3 测定溶液制备
3.1提取效率的考察：以 25%甲醇作提取溶剂进行超声处理，
为了保证被测成分提取完全，实验中考察了 30、40、50、60
（min）等不同超声时间对提取效率的影响。结果见表 1。
表 1 提取效率的考察表
从表中数据可见，超声提取 40min羟基红花黄色素 A的
含量基本不再增加，故确定超声时间为 40min。
3.2供试品溶液的制备
取本品约 1g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入
25%甲醇 50mL，密塞，称定重量，超声处理（功率为 300W，频
率为 50kHz）40min，取出放冷，再称定重量，用 25%甲醇补足
减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.3对照品溶液的制备
精密称取羟基红花黄色素 A对照品适量，加 25%甲醇制
成每 1mL含 0.06mg的溶液，作为对照品溶液。
3.4阴性对照试验
按上述方法制备供试品溶液和对照品溶液。另取按处方
比例并以相同工艺制备的缺红花的阴性对照，按供试品溶液
制备法制得阴性对照溶液。在上述色谱条件下，分别精密吸取
对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各 10μL，分别注入液
相色谱仪，测得结果为：阴性对照色谱图中在与羟基红花黄色
素 A对照品以及供试品色谱相对应的保留时间处无色谱峰出
超声时间（min） 30 40 50 60
红花黄色素素 A（mg·g-1） 1.80 1.88 1.82 1.88
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