全 文 ：浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2015，27(9) :1593 － 1600 http:/ /www． zjnyxb． cn
王丁晶，马家海，杜晶，等． 礁膜 Monostroma nitidum 的形态学观察和分子鉴定［J］． 浙江农业学报，2015，27 (9) :
1593 － 1600．
DOI:10. 3969 / j． issn． 1004 － 1524. 2015. 09. 17
收稿日期:2015-01-29
基金项目:宁波市农村科技创新创业专项资金项目(201201C8000044)
作者简介:王丁晶(1990—) ，女，江苏盐城人，硕士研究生，研究方向为海洋植物苗种工程及其增养殖。E-mail:wdj0208@ 126． com
* 通讯作者，马家海，E-mail:jhma@ shou． edu． cn
礁膜 Monostroma nitidum的形态学观察和分子鉴定
王丁晶1，马家海1，* ，杜 晶1，谢恩义2，施建华3
(1上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306;2广东海洋大学 水产学院，广东 湛江 524025;3奉化益珍海藻科技有限公司，浙江 奉化
315500)
摘 要:采用形态学观察结合分子生物学的方法，对采自浙江和广东沿海的礁膜进行了初步的种类鉴定。形
态学观察结果表明，藻体柔软粘滑，为片状、膜质、单层细胞;ITS序列分析结果显示，浙江的 12 个样品和广东
的 7 个样品均聚于礁膜(Monostroma nitidum)分枝，将其确认为礁膜 Monostroma nitidum。礁膜有无性生殖和
有性生殖 2 种发育方式，是一种经济价值较高的海藻，具有较好的开发利用前景。
关键词:礁膜;形态学;ITS;分子鉴定
中图分类号:S 917. 3 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2015)09-1593-08
Morphological and molecular study of Monostroma nitidum
WANG Ding-jing1，MA Jia-hai1，* ，DU Jing1，XIE En-yi2，SHI Jian-hua3
(1 College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China;2 College of Fisheries，
Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China;3 Fenghua Yizhen Alage Technology Co． Ltd，Fenhua
315500，China)
Abstract:Monostroma collected from Zhejiang Province and Guangdong Province was studied in this paper． Identifi-
cation was conducted by combining morphological observation and molecular biological methods． At the morphological
level，the thallis were soft and slimy，their cross sections were flake，membranous and had monolayer cells． At the
molecular level，the result of ITS sequencing analysis showed that all collected samples belonged to the same phylo-
genetic group，and were identified as Monostroma nitidum． There were two growth ways in M． nitidum:one was asex-
ual reproduction，the other was sexual reproduction． M． nitidum was of great economic value，and it had good pros-
pects for the development and utilization．
Key words:Monostroma nitidum;morphology;ITS;molecular identification
礁膜隶属于绿藻门(Chorophyta)、石莼目
(Ulvales)、礁膜科 (Monostromaceae)、礁膜属
(Monostroma)［1］。据中国海藻志第四卷绿藻门
中记载，礁膜属有 5种，即长管礁膜(M． tubulosa)、
格式礁膜(M． grevillei)、袋礁膜(M． angicava)、北
极礁膜(M． arcticum)、礁膜(M． nitidum)［2］。礁膜
又称石菜、蛇被、大本青苔菜、由菜，多生在平静
内湾的中、高潮带岩石上或有少量泥沙覆盖的岩
礁上，广泛分布于我国大连、浙江、福建、台湾、广
东、广西、海南等沿海各省沿岸，生长期为 12 月
至翌年 5 月，盛期 3 ～ 4 月。礁膜是海藻中味道
最鲜美、口感最润滑的种类之一，可鲜食，也可晾
干贮存食用。礁膜的蛋白质、碳水化合物含量较
高，并含有多种维生素和人体必需的多种矿质元
素，有很好的食用价值［3 － 4］。此外，礁膜性味咸
寒，具有清热化痰、利水解毒、软坚散结的功效;
可用治疗喉炎、咳嗽痰结、水肿等［5］，还有降低胆
固醇的作用［6］，而且由于含有丰富的海藻多糖，使
其有较好的抗氧化性、抗凝血活性、抗病毒作用
等［7 － 17］，是一种开发潜力较大的海洋药物资源。
随着现代经济的发展，以及对绿藻营养价值
认知程度的加深，人们对绿色食品需求量逐步增
长，以浒苔、礁膜为代表的大型绿藻类产品的市
场得以不断扩大，国际上绿藻产品已广泛应用于
菜肴、食品、饲料、肥料和生化领域。目前，浙江
等海域已形成了一定规模的浒苔加工产业，产品
不仅可供内需，而且还远销国外，但产量往往供
不应求。日本高知大学名誉教授大野正夫［18］曾
多次应邀到浙江和福建进行考察，他认为浙江象
山港一带的绿藻非常繁茂、资源丰富，品质与日
本的基本接近，但产地局限在少数地区，且与以
前相比产量有所降低，因此将来在象山港绿藻是
必须进行栽培的。如今浒苔的发展已小有规模，
而国内针对礁膜的研究与开发利用才刚刚起
步［3］。日本、韩国等国家早在几十年前就开始了
礁膜的栽培［19］，喜田和四郎较早就完成了整个
宽礁膜的人工育苗［20］，礁膜的产业化已比较完
善，人工栽培技术处于领先水平。日本礁膜的产
量已超过 3 000 t(干品) ，但产量还远远不能满足
需求，需从中国进口。而我国只是在 2006 年研
究了北极礁膜的人工育苗［21］，后续产业并未得
到很好的发展。近年来，由于礁膜资源的衰退，
仅仅依靠自然海区的生长还远远不能满足人们
日益增长的需要，人工栽培刻不容缓。如今，我
国南方沿海有少量的野生礁膜资源，只要把海藻
栽培上的一些技术(如人工采苗，新的养殖技术，
采收加工机械化)用到礁膜上，相信将来在浙江
海区礁膜一定可以得到很好的开发，以满足国内
外市场。目前，浙江已成功进行了小规模的礁膜
产业化试栽，在野生礁膜产地进行网帘附苗，然
后移到池塘里栽培，但栽培种类等尚未进行过深
入的研究，为了能够使该生产项目得以顺利进
行，必须首先对礁膜的种类进行鉴定。
传统鉴定方法是利用形态学观察，但许多生
态因子均可影响藻体的生长，使其形态发生改
变［22］，且礁膜属藻类形态结构简单，分化程度
低，仅凭形态特征往往很难区分。因此，本研究
通过形态学观察，结合分子手段对 2 个海区的礁
膜样品进行研究和鉴定，旨在进一步完善礁膜属
藻类的基础研究，并为今后礁膜资源的开发和利
用提供科学依据。
1 材料与方法
1． 1 材料的采集和培养
样品于 2013 年 3 月至 2014 年 3 月分别采自
浙江奉化海区栽培网帘(图 1)及广东南澳岛等
野生产地。所有采集的藻样就地海水洗涤处理，
稍微去水后保温箱覆冰保存，并于 24 h内带回实
验室。挑选正常的藻体用毛笔洗刷表面，去除泥
沙和附着物后，置于圆底烧瓶中充气(气流不宜
过大)培养。培养的条件为海水盐度 26. 9，温度
15 ～ 20℃，光照强度为 8 000 lx，光周期为 12L∶
12D［23］，PES 培养液添加量为 2%(V /V)。选择
完整的藻体进行形态学观察。
PES培养液配方(1 L) :硝酸钠(NaNO3)3. 5
g，甘油磷酸二钠0. 5 g，三羧甲基氨基甲烷5 g，PⅡ
金属混合液 250 mL，Fe液 250 mL，H2O 500 mL。
PⅡ金属混合液配方(250 mL) :Na2EDTA
0. 25 g，H3BO3 0. 25 g，MnCl2·H2O 0. 035 g，FeCl3
·6H2O 0. 012 5 g，ZnCl2 0. 002 5 g，CoCl3·6H2O
0. 001g，H2O 250 mL。
Fe液配方(250 mL) :Fe(NH4)2(SO4)2·
6H2O 0. 175 5 g，Na2EDTA 0. 165 g，H2O 250 mL。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 形态学及发育方式观察
制作常规组织切片，光镜下观察礁膜的细胞
学特征。
发育方式观察:用 1 000 μL 移液器枪头在藻
体的顶端边缘进行打孔取样［24］，取下的小圆片置
于培养皿中，加入含有 PES 的灭菌海水，培养的
条件为海水盐度 26. 9，温度 20℃，光强为 8 000 lx，
·4951· 浙江农业学报 第 27 卷 第 9 期
A:浙江奉化海区栽培礁膜;B:广东南澳岛野生礁膜。
图 1 礁膜产地
Fig． 1 Producing area of M． nitidum
光周期为 12L∶ 12D，定期观察藻体小圆片的生长
情况。
1． 2． 2 基因组 DNA的提取
DNA制备方法主要参照 Doyle等［25］，并有所
改动。先对藻体进行挑选，经 30%双氧水和超纯
水清洗后，32℃烘干。液氮研磨取样约 20 mg，转
移至 1. 5 mL离心管中，再加入 750 μL 提取缓冲
液［3% CTAB，100 mmol·L －1 Tris-HCl(pH 8. 0) ，
20 mmol·L －1 EDTA(pH 8. 0) ，1. 4 mmol·L －1
NaCl，0. 2%(V /V)巯基乙醇］，于 65℃温浴 1 h
后，加入 1 /3 体积的 5 mmol·L －1 KAc，充分混匀，
然后加入等体积氯仿∶ 异戊醇(24 ∶ 1) ，轻缓摇匀
后，12 000 r·min －1离心 15 min。将上清液移至新
管，并加入 2 /3 体积异丙醇，轻缓混匀，于12 000
r·min －1离心 5 min，倒去异丙醇，70%乙醇洗涤
1 ～ 2 次，无菌真空抽干，最后洗脱定溶于 1 × TE
溶液，－ 20℃保存待用。
1． 2． 3 PCＲ扩增和测序
ITS扩增引物主要参考文献［26 － 27］，第一
对引物序列为 ITS1:5-GGAAGTCGTAACAAGG-
3;ITS2:5-TCCTCCTTATTGATATGC-3;第二对
引物序列为 ITS3:5-TCTTTGAAACCGTATCGTG-
A-3;ITS4 5-GCTTATTGATATGCTTAAGTTCAG-
CGGGT-3。
PCＲ反应体系 50 μL:DNA模板 5 μL，2 × Es
Taq MasterMix(康为世纪)25μL，引物各 2 μL，
ddH2O 16 μL。PCＲ 反应条件 1:93℃预变性 5
min;93℃变性 1 min，50℃退火 2 min，72℃延伸 2
min，35 个循环;72℃延伸 7 min，4℃保存。PCＲ
反应条件 2:94℃预变性 5 min;94℃变性 1 min;
48℃退火 2 min，72℃延伸 2 min，35 个循环;72℃
延伸 7 min，4℃保存。样品信息及使用的引物见
表 1。
PCＲ产物经 1%琼脂糖凝胶(GelＲed 染色)
电泳后，用紫外分析仪检测。引物合成、扩增产
物纯化及测序均委托上海迈普生物技术公司
完成。
1． 2． 4 序列分析
表 1 样品信息及使用的引物
Table 1 Sample informations and their primers
样品编号 采集时间 采集地点 引物
ZJ-1 2013-3-13 浙江奉化 ITS1，ITS2
ZJ-2 2013-3-13 浙江奉化 ITS1，ITS2
ZJ-3 2013-5-1 浙江奉化 ITS1，ITS2
ZJ-4 2013-5-1 浙江奉化 ITS1，ITS2
ZJ-5 2013-5-16 浙江奉化 ITS1，ITS2
ZJ-6 2013-5-16 浙江奉化 ITS1，ITS2
ZJ-7 2013-5-16 浙江奉化 ITS1，ITS2
ZJ-8 2013-12-20 浙江奉化 ITS1，ITS2
ZJ-9 2013-12-20 浙江奉化 ITS1，ITS2
ZJ-10 2014-1-27 浙江奉化 ITS1，ITS2
ZJ-11 2014-1-27 浙江奉化 ITS1，ITS2
ZJ-12 2014-1-27 浙江奉化 ITS1，ITS2
GD-1 2013-4-17 广东南澳岛 ITS3，ITS4
GD-2 2013-4-17 广东南澳岛 ITS3，ITS4
GD-3 2013-4-29 广东南澳岛 ITS3，ITS4
GD-4 2013-4-29 广东南澳岛 ITS3，ITS4
GD-5 2014-3-17 广东南澳岛 ITS3，ITS4
GD-6 2014-3-17 广东南澳岛 ITS3，ITS4
GD-7 2014-3-17 广东南澳岛 ITS3，ITS4
·5951·王丁晶，等． 礁膜 Monostroma nitidum的形态学观察和分子鉴定
在 NCBI 数据库中对获得的基因序列进行
BLAST检测，并从 GenBank 中获得所需的序列。
用 Bioedit 对 DNA 序列进行编辑和校正，用
MEGA4. 1 构建 Neighbor-joining(NJ)系统进化树
和 UPGMA 进化树，Bootstrap 重复 1 000 次。从
Genbank中下载以下序列作为对比:M． nitidum
(AB735323) ，M． grevillei (AF428050) ，M． arctic-
um (AF415171) ，M． angicava (AF415173) ，U．
prolifera (FJ026732) ，U． linza (EU888138)。
2 结果与分析
2． 1 形态学观察
试验藻体所有的典型特征如图 2 所示。藻
体膜状，柔软粘滑有光泽，颜色呈黄绿色或淡黄
绿色，叶片边缘为不规则状，且有许多褶皱，藻体
偏薄，易破碎，通常高 2 ～ 6 cm，有的可达 15 cm。
镜检结果显示，从藻体的表面观上看，细胞多为
多角形、椭圆形或亚长方形;藻体中部横切面细
胞为椭圆形，位于中央部位，与上下表面之间有
间隔。藻体外形和石莼属的种类十分相似，但后
者由 2 层细胞组成，且藻体较粗厚;本研究中藻
体为单层细胞。
2． 2 系统发育分析
通过试验获得 ITS 序列长度，一个是 630 bp
左右，另一个为 800 bp左右。PCＲ产物送上海迈
普生物公司进行纯化、测序。用这些序列构建 NJ
树和 UPGMA进化树，2 种构建方法获得的结果
相同，结果如图 3 所示。随即选取的 19 个样均
聚于同一分支———礁膜(Monostroma nitidum)分
支，2 种方法获得的 Bootstrap支持值均为 99。
2． 3 礁膜发育方式的观察
礁膜的生活史是大型膜状配子体和微小孢
子体的不等异形世代交替，试验观察发现，礁膜
有 2 种发育方式(图 4)。
无性生殖:单株藻体在培养过程中，释放双
鞭毛配子，雌雄配子经过一段运动时间后，未经
结合直接形成孢子囊附着发育。成熟孢子囊释
放游孢子，再发育成配子体。并不是所有的配子
都会从配子囊中释放出去，有些直接在配子囊中
萌发生长成新的藻体。
有性生殖:成熟的配子体可以释放大小不同
的雌雄配子，当配子释放出来后，配子囊壁立即
溶解消失，不留空壳。雌雄配子均有 2 根鞭毛和
1 个眼点，它们结合成 4 鞭毛的合子，合子附在基
质上变成圆形，并逐渐长大成为孢子囊。礁膜孢
子囊成熟后释放 4 鞭毛的游孢子，孢子附着后，
很快就裂为不规则的膜状，发育成幼小配子体，
有明显的异形世代交替现象。
3 结论与讨论
3． 1 礁膜的生物学研究
黄宗国［28］报道，我国礁膜属藻类有 6 种，礁
膜(M． nitidum Wittr．)、囊礁膜 (M． angicava
Kjellm)、宽礁膜(M． latissimum Wittr．)、厚礁膜
(M． crassifolia Tseng et C． F． Chang)、北极礁膜
(M． arcticum Wittr．)、皱原礁膜(M． undulatum Vi-
A:礁膜藻体;B:藻体表面观;C:藻体切面观。
图 2 藻体形态图
Fig． 2 Morphyology graphs of M． nitidum
·6951· 浙江农业学报 第 27 卷 第 9 期
图 3 基于 ITS序列构建的 NJ系统发育树(A)和 UPGMA系统发育树(B)
Fig． 3 NJ phylogenetic tree (A)and UPGMA phylogenetic tree (B)based on ITS sequence of Monostroma nitidum
·7951·王丁晶，等． 礁膜 Monostroma nitidum的形态学观察和分子鉴定
1:配子囊表面观;2，3:游动配子;4:合子;5:孢子囊;6:成熟孢子囊;7:四鞭毛游孢子;8，9:小苗。
图 4 礁膜的发育方式
Fig． 4 Growth way of Monostroma nitidum
nogradova) ，常见有 3 种，即礁膜、囊礁膜和宽礁
膜。而据中国海藻志记载，我国有 5 种礁膜，对
比两书，对礁膜(M． nitidum Wittr．)的形态描述没
有多大改变。礁膜属藻类形态结构简单，难以通
过肉眼观察来进行鉴定，因此礁膜属藻类的分类
鉴定比较困难;且有些藻体的形态特征极为相
似，礁膜藻体均有光泽，叶缘有壁褶，细胞表面观
两两成对明显，切面观圆形或长圆形，因此光靠
形态来鉴定礁膜，往往会出现一些纰漏。曾经有
部分学者对礁膜做过分子方面的相关研究，如谢
恩义等［29］用 ＲAPD技术对礁膜、袋礁膜和宽礁膜
进行了 DNA 多样性分析，认为礁膜和宽礁膜之
间的亲缘关系最近，与袋礁膜的关系较远;沈颂
东等［30］、张耀东等［31］主要用 5. 8S rＲNA 和 18S
rＲNA 序列来分析礁膜与浒苔等的亲缘关系;
Yuumi等［32］通过分析日本经济绿藻产品的 ITS2
序列和 5S rDNA序列来鉴定它们的种类。
本研究首先是对样品的外形进行了较为细
致的观察，并与海藻志的藻体特征一一对比，能
大致判断其为礁膜属藻类。进一步采用现代分
子生物学技术，对样品的 ITS序列进行分析，并构
建的 NJ树和 UPGMA 系统树，获得的结果一致，
而且与形态学观察结果一致，因此，将样品鉴定
为礁膜。由于传统鉴定方法需要改善，因此，在
今后的藻类鉴定中，用传统方法鉴定的同时，尽
可能利用分子生物学方法进行确认使鉴定的结
·8951· 浙江农业学报 第 27 卷 第 9 期
果更为精确。
3． 2 礁膜的发育方式
礁膜属种类的生活史已有较多报道，无性生
殖产生游孢子，有性生殖为同配或异配，有时配
子也能进行孤雌生殖。但目前报道最为详细的
还是宽礁膜的生活史［33］。
与已经报道过的礁膜属藻类的生活史基本
相似［2，34 － 35］，本试验中礁膜的生活史是独立生活
的大型膜状配子体和微小孢子体之间的不等异
形世代交替，叶状配子体成熟后放出雌雄配子，
雌雄配子游动一段时间后结合为圆形合子，经过
一段时间，合子逐渐转化为孢子囊，孢子囊成熟
后放出游孢子，游孢子附着发育成配子体，完成
一个有性生殖过程。无性生殖是未经结合的配
子直接附着发育成孢子体，然后转化为成熟的孢
子囊释放游孢子，游孢子附着后萌发形成相应的
雌雄配子体。本试验尚未发现新的发育方式。
3． 3 礁膜的价值
在我国，褐藻、红藻已发展为海藻行业中的
领军产业，而且海带、紫菜(含条斑紫菜和坛紫
菜)在全世界产量中均列第一，但绿藻的开发尚
处于起步阶段。
浙江省既产礁膜又产浒苔，具有发展天然绿
藻产业的优势，野生产品加工已获得较好的经济
收益，人工栽培产业化必将使该产业有一个质的
飞跃。礁膜是活性物质丰富、实用价值和深加工
价值高的优质藻类资源，广受国内外的好评，日
本、美国等国家都急需这种原料。我国有绵长的
海岸线、广阔的浅海区，近海的季节变化以及丰
富的营养盐有利于众多大型海藻繁殖生长，礁膜
在我国部分沿海地区已有生长，礁膜的人工栽培
具有一定发展潜力。只要解决了礁膜的生物学、
生态学基础，探索出最佳的育苗、栽培技术，其产
业化将得到十分迅速的发展，并可成为一个新的
海洋经济增长点。
目前，我国礁膜的研究水平还处于初步阶
段，本研究利用形态学观察结合分子生物学的方
法鉴定出礁膜的种类，不仅为其研究提供了基础
的参考资料，有利于礁膜的育苗栽培，还将推动
该项目的顺利进行。后续试验将在分子生物学
研究的基础上，对礁膜的营养成分和栽培技术进
行深入研究，使礁膜产业得到更好的推广，使礁
膜资源得到合理的开发利用。
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(责任编辑 侯春晓)
·0061· 浙江农业学报 第 27 卷 第 9 期