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收稿日期:2013-09-02
基金项目:国家科技部子课题(2011BAI07B05-4);河北省科技厅项目(10965511D) ;唐山市科技重大项目(12130203A)
作者简介:马艳芝(1977-)，女，硕士，副教授，主要从事药用植物与生物技术研究;E-mail:mayanzhiwxd@ 163. com。
菘蓝四倍体株系细胞形态学和流式细胞术鉴定
马艳芝，客绍英
(唐山师范学院生命科学系，河北 唐山 063000)
摘要 目的:进行菘蓝四倍体株系形态学、细胞学及流式细胞术鉴定。方法:将进行了根尖压片染色体计数鉴
定的菘蓝四倍体株系组培苗，经生根、炼苗后移栽大田，以田间栽培苗为实验材料。宏观观察进行外观形态鉴定;
徒手切片法进行观察，研究叶片的气孔长度、宽度、气孔密度;用流式细胞仪法进行倍性鉴定。结果:四倍体植株和
二倍体植株相比，外观形态发生明显的变化;四倍体株系的气孔长度均显著大于二倍体，气孔保卫细胞叶绿体数目
均显著多于二倍体植株;流式细胞术鉴定证明供试材料均为四倍体。结论:供试材料是四倍体，而且宏观观察、微
观气孔长度、保卫细胞叶绿体数目可进行诱变材料倍性的辅助鉴定，同时流式细胞术可用于菘蓝的倍性鉴定。
关键词 菘蓝四倍体;细胞形态学;流式细胞术
中图分类号:Ｒ282. 2 文献标志码:A 文章编号:1001-4454(2014)05-0736-05
Identification of Cellular Morphology and Flow Cytometry on Different Tetraploid Isatis indigotica Strains
MA Yan-zhi，KE Shao-ying
(Department of Life Sciences，Tangshan Normal University，Tangshan 063000，China)
Abstract Objective:To identify tetraploid Isatis indigotica strains through morphology and flow cytometry. Methods:The tissue
culture seedlings of tetraploid Isatis indigotica were root-tip squashed and chromosome counted before rooted climatized and transplanted
in field. The plants in field were taken as experimental materials. Macroscopic observation was applied to identify by form and structure;
Free-hand section was used to observe the length，width and density of stomas;And flow cytometry was applied to identify the
ploidy. Ｒesults:Compared with diploid plants，tetraploid plants had obvious changes in form and structure. The stomas from the tetra-
ploid were notably longer，and the number of guard cells in chloroplasts was remarkably larger. The experiment materials were proved to
be tetraploid by flow cytometry. Conclusion:The materials are tetraploid plants. Macroscopic observation，the length of stoma and the
number of guard cells in chloroplasts can be taken as aided identification for ploidy of mutagenesis materials. Meanwhile，flow cytometry
can be applied to identify the ploidy of Isatis indigotica.
Key words Isatis indigotica Fort. tetraploids;Cellular morphology;Flow cytometry
菘蓝 Isatis indigotica Fort. 为十字花科菘蓝属二
年生草本植物，以根(板蓝根)、叶(大青叶)入药。
具清热解毒，凉血利咽(消斑)等功效〔1〕，是传统常
用的中药材。
·637· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 5 期 2014 年 5 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2014.05.009
植物组织经过多倍化处理后，一部分材料的染
色体加倍成为多倍体，一部分未能加倍而仍为二倍
体，还有一些为嵌合体。因此，准确地辨认多倍体并
将其挑选出来，是多倍体研究中的重要环节。形态
鉴定法是最直观、最简易方法。多倍体植株的生长
缓慢、茎变粗、节间短、叶片加厚、叶色加深等外观形
态特征与二倍体有明显的差异，通过以上特征进行
观察，可初步判定其倍性，但必须和其他方法结合才
能确定其准确倍性。在一定范围内气孔多少与倍性
成负相关，气孔大小、叶绿体数与倍性成显著正相
关〔2，3〕，花粉粒细胞都是以染色体数量的多少而增
减体积的。乔传卓等〔4〕发现菘蓝花粉粒的大小及
其不同形状的花粉数目可鉴定倍性。多倍体最本质
的特性是染色体数目增加，因此可通过检测分生旺
盛的器官、组织的染色体数目来进行鉴定，不失为一
种最直接、最可靠的鉴定方法。取材上，用组培芽进
行染色体鉴定也是一种快速而有效的方法〔5〕。目
前，国内外通用的制备植物染色体标本的方法是采
用常规压片法和去壁低渗-火焰干燥法，两种方法各
有特点，又相互融合〔6〕，现广泛用于药用植物的多
倍体鉴定。不过染色体记数法尽管检测倍性很准
确，但很费时。近年来，有报道利用流式细胞仪测定
植物细胞核 DNA含量可鉴定其细胞倍性〔7〕。
目前国内对菘蓝四倍体倍性鉴定方法研究还不
多。菘蓝二倍体染色体数为 14 条，染色体小，经过
加倍后形成的四倍体的染色体数为 28 条，进行根尖
压片观察难度较大。本课题组经过多年研究，反复
试验进行了菘蓝四倍体株系鉴定。鉴于此，本研究
以本课题组诱导并经过组培苗根尖压片鉴定后获得
的菘蓝四倍体株系大田栽培苗为实验材料，通过对
其进行形态学、气孔的细胞学观察以及流式细胞术
鉴定，进行辅助倍性鉴定，为菘蓝四倍体鉴定提供参
考。
1 材料与仪器
1. 1 材料 经课题组诱导并进行室内至少三次根
尖压片染色体计数鉴定的菘蓝四倍体株系组培苗，
生根生长，当根长约 1. 5 ～ 2. 0 cm 时炼苗 4 d，移栽
至温室内，移栽基质为蛭石∶珍珠岩 = 1∶ 2，幼苗生长
1 ～ 2 个月后定植于大田，常规管理。观察田间植株
外部形态、进行细胞学及流式细胞术鉴定。
1. 2 仪器 美国 Beckman-Coulter(贝克曼库尔特)
公司生产的 Epics Altra II流式细胞分析分选仪;Ni-
kon 光学显微镜。
2 方法
2. 1 田间移栽苗形态观察 对经过室内鉴定确认
是四倍体的株系，进行加速繁殖，生根后移栽到田间
(每个株系 30 ～ 50 株)。在其营养生长时期定期对
各株系进行形态观察。
2. 2 田间移栽苗细胞学观察 于晴天上午 9 ∶ 00，
采集不同倍性菘蓝植株的新鲜叶片(上数第二片
叶，每种 3 片)，撕取下表皮，蒸馏水冲洗两次，置于
无菌水中浸泡 35 ～ 40 min 后取出置于载玻片上，
碘-碘化钾染色 30 min，加盖玻片，放在显微照相仪
器(数码显微摄像系统于 Motic Image plus3. 2 软件)
上进行观察并照相。每种材料随机统计 10 个 100
倍视野下的气孔数目，在 400 倍视野下测 100 个气
孔大小(长度，取平均值)和 400 倍视野 100 个气孔
保卫细胞叶绿体数目(取平均值)，对所得数据进行
统计分析。
2. 3 田间移栽苗流式细胞术鉴定 本试验内容在
河北农科院昌黎果树研究所完成。田间移栽苗染色
体鉴定采用流式细胞法:取幼嫩叶片样品约 0. 5 g，
在滴有 1. 5 mL提取缓冲液的培养皿中用锋利的手
术刀片切碎，然后用 500 目的尼龙网过滤，滤液加入
等量染色缓冲液进行 DNA 特异性染色，避光染色
20 min后，进行流式分析，以二倍体亲本种子萌发的
植株幼嫩叶片 DNA含量作对照。
提取缓冲液成分:15 mmol /L Tris-Cl，80 mmol /L
KCl，20 mmol /L NaCl，2 mmol /L EDTA-Na2，15 mmol /L
巯基乙醇，0. 05%的 TritonX-100(pH 8. 0)。
染色缓冲液:提取缓冲液内加入 20 μg /mL 的
ＲNaseA和 20 μg /mL PI(碘化丙锭)。
倍性鉴定:采用 Epics Altra II 流式细胞分析分
选仪，激发光源为 15 氩离子，激发波长为 488 nm，
通过激发光源照射可激发经荧光染色分子促发荧
光，测定荧光强度，荧光信号强度与 DNA 含量成正
比。同时理论上认为，随着染色体数目的成倍增加，
细胞核 DNA 含量也必然成倍增加，因此可用 DNA
含量来估计细胞染色体的倍性(Dolezel，1989)。然
后经与仪器连接的计算机分析软件———EXPO32 即
可对荧光强度自动统计分析，最后绘制出 DNA含量
(倍性)的分布直方图。直方图的纵坐标为细胞核
数(表示细胞的相对数)，横坐标为道数(Channel
No. )(表示荧光强度)。
二倍体菘蓝为对照，所有测试样品细胞核 DNA
含量是以对照为标准的相对值。每个样品重复三
次，每次检测时至少收集 10 000 个细胞核。
3 结果与分析
3. 1 菘蓝不同四倍体株系田间移栽苗形态观察
四倍体植株和二倍体植株相比，各种农艺性状均发
·737·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 5 期 2014 年 5 月
生明显的变化(见图 1)。叶部形状变化主要体现在
叶片的宽窄、颜色及叶缘上:二倍体叶色较浅，叶片
较细长，薄而平展，叶片边缘无或有较浅锯齿状波
浪;而四倍体植株叶色深绿，叶片较为宽大，叶片厚，
叶面粗糙，叶片边缘有锯齿状波浪使叶片呈扭曲形。
株型和生长势主要表现为:四倍体植株普遍比原植
株生长势旺而浓绿，粗壮，植株分蘖能力强。
图 1 菘蓝二倍体及 16 个四倍体株系
a. 2n b. DB1 c. DB2 d. DB3 e. DB4 f. DB5 g. DB6
h. DB7 i. DB8 j. DB9 k. DB10 l. DB11 m. DB12
n. DB13 o. DB14 p. DB15 q. DB16
3. 2 田间移栽苗的细胞学观察 在早期辨认多倍
体，多以植株外部形态特征来进行初步判定。本实
验选取外部形态有变异的田间菘蓝植株，进一步对
其叶片的气孔结构进行显微观察，结果如图 2。发
现变异株的气孔长度均显著大于二倍体，而且每视
野中有 6 个多倍体株系的气孔数目均多于二倍体的
气孔(表 1)外，其他株系气孔数目或显著低于二倍
体或与二倍体无明显差异，分析原因，可能由于田间
苗依生长状态不同气孔开闭程度不同影响的结果，
因此笔者认为作为倍性比较，气孔长度较气孔密度
更能准确表示多倍体的变异特征。
此外，实验观察了菘蓝不同倍性植株的保卫细
胞叶绿体数目(表 1)，发现外部形态有变异植株的
气孔保卫细胞叶绿体数目均显著多于二倍体植株。
说明保卫细胞叶绿体数目及气孔的巨大型是鉴定菘
蓝多倍体的一个典型特征指标。
3. 3 田间移栽苗流式细胞术鉴定 自引入植物学
研究之后，流式细胞仪技术被频繁应用于 DNA倍性
水平的分析和核基因组大小的确定〔6〕。流式细胞
分析仪具有快速、简便、准确的特点，准备好的细胞
核样品在数分钟内即可完成测定和分析，所以特别
适合于样品较多的倍性检测分析。应用流式细胞仪
计算测量细胞核内 DNA 含量实际上是细胞周期的
测量。由于细胞核 G1 期的 DNA 含量反应一个细
胞的倍性，因此常常用 DNA 含量来估计细胞的倍
性〔7〕。
本研究将已经倍性鉴定为四倍体的优良株系移
栽至大田，在生长中期，选取大田生长发育良好的变
异株系，利用分子生物学水平的流式细胞计数法进
行倍性鉴定，结果见图3。每个直方图的第一个峰
图 2 部分菘蓝四倍体株系气孔
表 1 菘蓝苗四倍体与二倍体田间植株的气孔情况
编号 气孔长度 /μm 气孔密度 保卫细胞叶绿体数目 /个
2n(CK) 7. 58h 119. 94cd 14. 25i
DB1 12. 41b 94. 00gh 19. 99defg
DB2 11. 82cd 117. 60cde 20. 88bc
DB3 11. 55def 134. 80ab 20. 08defg
DB4 11. 59def 126. 70bc 20. 51cde
DB5 11. 71cdef 110. 30de 20. 22cdef
DB6 12. 06bcd 88. 80gh 19. 55fg
DB7 9. 63g 94. 00gh 19. 42g
DB8 11. 26def 95. 10fg 20. 52bcde
DB9 9. 88g 137. 90ab 20. 75bcd
DB10 11. 20fg 141. 60a 19. 08efg
DB11 11. 56def 122. 90c 19. 86efg
DB12 11. 80cde 106. 30ef 18. 02h
DB13 14. 35a 86. 20gh 21. 30b
DB14 12. 18bc 85. 24gh 22. 39a
DB15 9. 87g 143. 00a 19. 86defg
DB16 11. 24f 83. 30hi 20. 39cde
·837· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 5 期 2014 年 5 月
图 3 部分大田菘蓝不同株系的 DNA含量分布
a . 2n b. DB1 c . DB2 d. DB3 e . DB4 f . DB5 g. DB6
h. DB7 i. DB8 j. DB9
均为杂峰。a为菘蓝二倍体，作为对照，其 G1 期的
荧光强度值约为 200，其他直方图中 G1 期的荧光强
度值约为 400，以此说明所选四倍体株系均为四倍
体，证明流式细胞术可成功应用在菘蓝四倍体鉴定
研究中。
4 小结与讨论
与二倍体相比较，四倍体通常表现为叶片厚、颜
色深、植株粗壮、气孔面积增大等现象〔8，9〕。本研究
对菘蓝多倍体诱导后，对诱导材料分别进行了根尖
压片染色体数目的鉴定，并对经染色体数目计数后
所得四倍体材料进行大田栽培观察研究，发现四倍
体田间移栽苗与二倍体田间移栽苗之间均表现了很
大差异:四倍体田间移栽苗叶色深绿，叶片宽厚变
形，叶面粗糙，叶缘锯齿状，整株生长势旺盛，分蘖能
力强。因此通过形态特征鉴定可初步筛选出变异植
株。
同时观察菘蓝四倍体显微结构，发现菘蓝四倍
体植株与二倍体相比，表现了气孔巨大、保卫细胞叶
绿体数目增多，因此得出气孔巨型性、保卫细胞叶绿
体数目增多也是鉴定菘蓝多倍体的一个典型特征。
目前，最快速有效地鉴别染色体倍性的方法是
采用流式细胞仪测定法〔10〕，它可以直接测定细胞的
DNA含量〔11，12〕，从而快速鉴别植株的染色体倍性水
平，这种方法已经成功用于苹果、草莓等的倍性鉴定
上〔13，14〕。本研究采用幼叶流式细胞仪法成功、准确
的鉴定了菘蓝田间移栽苗的染色体倍性，并得出实
验中可根据材料的多少选择鉴定染色体倍性鉴定的
方法，如观察材料较少时可采用常规压片法，材料较
多时可利用分子生物学水平的流式细胞计数法，以
便充分发挥各自的优势，快捷准确的做出倍性鉴定。
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收稿日期:2013-10-14
基金项目:国家科技支撑计划课题(2011BAI06B01)
作者简介:仉劲(1989-)，男，在读硕士研究生，专业方向:药用植物资源与利用;E-mail:zhjin0214@ 163. com。
* 通讯作者:王建华，E-mail:jhwangjh@ 163. com。
不同品种金银花生长过程中生理性状变化研究
仉 劲，房信胜，王建华*
(山东农业大学农学院，山东 泰安 271018)
摘要 目的:了解不同品种金银花生长过程中生理性状变化，掌握金银花的生长规律。方法:观察研究 3 个品
种金银花的生长发育过程中花蕾长度、颜色、折干率和开花率等的变化，并运用 SPSS 非线性回归分析得出金银花
生长模拟曲线方程。结果:不同品种之间以及同一枝条不同节位之间金银花生长均呈现相似规律，折干率均在三
青期呈现最大值，二白期百花重最大，且品种间无差异。筛选的两个曲线方程拟合度分别为 0. 996、0. 995。结论:
本研究所得曲线能很好地反应金银花的生长规律，较系统的研究了金银花生长过程，能很好的应用于农业生产的
指导。
关键词 金银花;生理性状;SPSS;生长曲线
中图分类号:Ｒ282. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)05-0740-04
Study on Physiological Trait Changes in Growth Process of Different Varieties of Lonicera japonica
ZHANG Jin，FANG Xin-sheng，WANG Jian-hua
(College of Agronomy，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China)
Abstract Objective:To study the physiological trait changes in the growth process of different varieties of Lonicera japonica，and
to explore the growth regularity. Methods:Length，color，flowering rate and drying rate in the growth and development process of different
varieties of Lonicera japonica were observed. Nonlinear regression analysis was used to conclude the growth simulation curve
equation. Ｒesults:Among different varieties and different sections of the same branch，the growth showed a similar law，the drying rates
of the‘sanqing’period got the maximum value in all of the three varieties，the weight of the flower in‘erbai’period was the highest，and
no differences between varieties. The Ｒ2 of the two curve equations was 0. 996 and 0. 995，respectively. Conclusion:Both of two curve e-
quations can reply the growth regularity of Lonicera japonica flower very well. Study on the growth process systematically can guide the
agricultural production very well.
Key words Lonicera japonica Thunb. ;Physiological trait;SPSS;Growth curve
金银花为忍冬科植物忍冬 Lonicera japonica
Thunb. 初开的花或花蕾，是我国传统的大宗中药材
和出口药材，主产于山东、河南等地，山东以平邑县
种植最为普遍，产量最大。性甘寒气芳香，既能宣散
风热，还善清解血毒，用于痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热
毒血痢、风热感冒和温病发热等症〔1〕，效果显著。
绿原酸(Chlorogcnic Acid)为金银花中的主要活性成
分之一，具有明显的降压、降脂、抗肿瘤、镇痛等药理
作用，可广泛应用于医药、食品、保健等领域〔2-4〕。
生长曲线广泛应用于描述动植物的生长过程，
运用非线性生长模型对生长曲线进行拟合，利用生
长曲线提供的信息可以较好地预测机体的生长发育
情况，进行饲养种植管理，提高了经济效益〔5，6〕。以
往对金银花侧重于有效成分及药理活性方面的研
究，对金银花的自然生长生理过程的研究不多。金
银花花期时间短，不同花期的质量差异较大，往往由
于来不及采集而造成巨大的资源浪费。通过对金银
花生长过程的跟踪调查，利用统计软件 SPSS拟合花
·047· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 5 期 2014 年 5 月