全 文 ：第 38卷 第 4期 海 洋 与 湖 沼 Vol.38, No.4
2 0 0 7 年 7 月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA July, 2007

* 国家“十五”科技攻关项目, 2001BA708B04-07号。付万冬, 硕士, E-mail: fwd2002fwd@sohu.com
①通讯作者: 韩宝芹, 教授, E-mail: baoqinh@ouc.edu.cn
收稿日期: 2006-09-20, 收修改稿日期: 2006-12-28
琼胶降解菌 F-6筛选、培养条件及对条斑紫菜
(Porphyra yezoensis)细胞解离作用的研究*
付万冬 韩宝芹① 王常红 刘万顺
(中国海洋大学海洋生命学院 青岛 266003)
提要 利用琼胶作为唯一的碳源从青岛太平角海域的海水和红藻样品中筛选分离得到一
株高产琼胶酶的海洋菌 F-6, 对其最适的产酶条件, 利用琼胶酶分离条斑紫菜的原生质体和
原生质体的培养进行研究。结果表明, 通过单次单因子和正交实验确定琼胶降解菌株 F-6最
适产酶培养基配方为(W/V): 琼胶 0.7%; 酵母粉 0.3%; 蛋白胨 0.5%; NaCl 2.0%; K2HPO4
0.1%; CaCl2 0.02%; MgSO4·7H2O 0.05%; FeSO4·7H2O 0.002%; 起始 pH = 7.5, 最适的发酵
产酶条件为: 26℃培养 36h。经条件优化后, 粗酶液的酶活高达 631.6U/ml。发酵液经过
6000g 离心 30min 得到粗酶液, 粗酶液经过 8k 分离膜超滤, 加入 1mol/L 渗透剂, 0.22µm滤
膜过滤除菌后降解条斑紫菜组织块, 成功地分离得到大量的紫菜原生质体, 其产率为 3×106
个原生质体/g新鲜紫菜组织。原生质体经初步培养发育成愈伤组织, 其成活率为 60%。
关键词 琼胶降解菌, 琼胶酶, 培养条件优化, 条斑紫菜, 原生质体
中图分类号 Q556.3
琼胶(琼脂)由琼脂糖和琼胶酯组成, 琼脂糖
是由(1→3)-O-β-D-半乳糖和(1→4)-O-3, 6-内醚-
α-L -半乳糖交替组成的线形链状分子(Sugano et
al, 1993); 琼胶酯由复杂的长短不一的半乳糖残
基的多糖链组成, 其中包含有多种取代基如硫酸
基、甲基等。随着对海洋资源的开发和利用, 越
来越多的海洋低聚糖被证明具有良好的生物活性
和药理作用, 琼胶低聚糖具有抗氧化等重要的生
理功能(徐强等, 2002), 一定聚合度的琼胶类硫酸
多糖对 B型流感病毒、腮腺炎、脑膜炎病毒等有
抑制作用(王静雪等, 2001)。琼胶酶降解琼胶制备
低聚糖由于其具有专一性、高效性和清洁无污染,
在研究和生产中越来越受到重视 (毛文君等 ,
2001)。琼胶酶根据降解琼胶的作用方式不同, 把
它们分为两类: α-琼胶酶(EC3.2.1.-), 作用于琼
脂糖的α(1→3)糖苷键, 产物为琼胶寡糖, 以 3,
6-内醚-α-L-半乳糖作为还原性末端; β-琼胶酶
(EC3.2.1.81)水解 D-半乳糖残基和 3, 6-内醚-α-
L-半乳糖残基之间的β(1→4)糖苷键, 产生的琼
胶寡糖以 D-半乳糖残基作为还原性末端。天然琼
胶主要存在于某些海藻的细胞壁中, 琼胶酶在这
些海藻的单细胞分离、酶解破壁制备原生质体等
过程中具有重要的使用价值, 是一种海藻遗传工
程的工具酶 (Sugano, 1993; Araki et al, 1994,
1998a), 同时 , 琼胶酶在分子生物学方面也多有
应用。因此, 对琼胶酶的研究具有重要的理论意
义和应用价值。
作者从海洋中分离得到一株高产琼胶酶的
海洋菌, 对其发酵产酶条件进行优化, 确定最佳
产酶条件。发酵液经过 6000g离心 30min得到粗
酶液, 粗酶液经过 8k 分离膜超滤、加入 1mol/L
葡萄糖、0.22µm滤膜过滤除菌后降解条斑紫菜组
织块。分离得到大量的紫菜原生质体, 原生质体
经培养发育成愈伤组织。
344 海 洋 与 湖 沼 38卷
1 材料与方法
1.1 培养基组成
1.1.1 分离培养基成分 (W/V) 琼胶 2.0%,
NaCl 2.0%, MgSO4·7H2O 0.05%, NaNO3 0.2%,
K2HPO4 0.1%, FeSO4·7H2O 0.002%, CaCl2 0.02%,
pH 7.5。
1.1.2 发酵培养基成分(W/V) 琼胶 0.7%, 蛋
白胨 0.5%, MgSO4·7H2O 0.05%, 酵母粉 0.3%,
NaCl 2.0%, CaCl2 0.02%, K2HPO4 0.1%,
FeSO4·7H2O 0.002%, pH 7.5。
1.2 菌株的筛选
1.2.1 取样 分别用无菌的三角瓶取海水、泥
沙、红藻。
1.2.2 样品的处理 海水直接用无菌生理盐
水稀释 10－4—10－6涂布平板, 底泥和红藻加入到
装有无菌生理盐水的三角瓶中, 充分摇匀, 然后
系列稀释取合适浓度涂布, 25℃恒温培养 72h。
1.3 初筛和复筛
1.3.1 初筛 以琼胶作为唯一碳源, 分离和筛
选琼胶降解菌, 25℃恒温培养 72h 后, 根据菌落
周围透明圈大小初步判断菌株降解能力大小。
1.3.2 复筛 初筛分离纯化得到的菌株, 分别
接种斜面和平板培养。平板培养 72h 后, 用卢卡
氏碘液染色观察。斜面接种至发酵培养基中, 于
25℃恒温条件下, 150r/min摇荡培养 36h, 检测发
酵液的酶活力。
1.4 酶活力测定
将发酵液在 4℃下, 经 6000g离心 20min, 取
上清液作为粗酶液。每 100µl 酶液加入到 900µl
含 50mmol/L (pH 7.0)磷酸盐作为缓冲液 0.5%琼
胶底物中, 50℃保温 15min, 用沸水浴灭活 5min
的酶液作为对照, DNS法测定还原糖含量(北京大
学生物教研室, 1992)。酶活力单位定义为在 50℃、
pH 7.0条件下 1ml酶液每分钟催化产生 1µg还原
糖(以半乳糖计)所需要的酶量(U)。
1.5 发酵条件优化
除非特定说明外, 培养温度为 26℃, 时间为
36h, 摇床转速为 150r/min, 接种量为 2%, 菌体
浓度为(1.0—3.0)×108cfu/ml, 500ml 三角瓶装液
量为 100ml, 每组试验重复 3次, 每次试验 3组平
行样, 优化结果都用于以后试验。
1.5.1 培养时间对产酶的影响 菌体在液体
培养基培养 12h后, 每隔 4h取样, 测定酶活力和
菌体的生长密度, 以及培养时间对菌株生长和产
酶的影响。
1.5.2 培养基起始 pH 值对产酶的影响 培养
基的起始 pH值分别为 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、
7.0、7.5、8.0、8.5、9.0, 培养 36h 后, 测定发酵
液的酶活力, 以及培养基起始 pH 值对菌株产酶
的影响。
1.5.3 培养温度对产酶的影响 培养温度分别
为 20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、
34℃, 培养 36h 后, 测定发酵液的酶活力, 以及
温度对菌株产酶的影响。
1.5.4 NaCl 浓度对产酶的影响 发酵培养基
中 NaCl浓度(W/V)分别为 0%、0.5%、1.0%、1.5%、
2.0%、2.5%、3.0%、3.5%, 培养 36h 后 , 测定
发酵液的酶活力, 以及 NaCl 浓度对菌株产酶的
影响。
1.5.5 琼胶浓度对产酶的影响 发酵培养基
中琼胶浓度(W/V)分别 0.10%、0.20%、0.30%、
0.40%、0.50%、0.60%、0.70%、0.80%、0.90%、
1.0%, 培养 36h 后, 测定发酵液的酶活力, 以及
琼胶浓度对菌株产酶的影响。
1.5.6 不同浓度的酵母粉对产酶的影响 发
酵培养基中的酵母粉浓度(W/V)分别为 0.10%、
0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%, 培养 36h
后, 测定发酵液的酶活力, 以及酵母粉浓度对菌
株产酶的影响。
1.5.7 不同浓度的氮源对产酶的影响 发酵
培养基中氮源分别为碳酸氢铵、草酸铵、尿素、
硝酸铵、牛肉浸膏、蛋白胨、硫酸氢二钾、硝酸
钠和硝酸钾浓度(W/V)为 0.30%和 0.50%, 培养
36h 后, 测定发酵液的酶活力, 以及氮源对菌株
产酶的影响。
1.5.8 培养基成分的正交实验 实验按四因
素三水平安排正交 L9(34), 培养中 NaCl 浓度
(W/V), A1=1.5%, A2=2.0%, A3=2.5%; 酵母粉浓度
(W/V), B1=0.10%, B2=0.30%, B3=0.50%; 氮源(蛋白
胨)浓度(W/V), C1=0.30%, C2=0.50%, C3=0.70%;
琼胶浓度(W/V), D1=0.30%, D2=0.50%, D3=0.70%。
按正交实验进一步优化发酵产酶条件。
4期 付万冬等: 琼胶降解菌 F-6筛选、培养条件及对条斑紫菜(Porphyra yezoensis)细胞解离作用的研究 345
1.6 琼胶酶对条斑紫菜细胞的解离作用
1.6.1 酶液的配制 发酵液经过 6000g 离心
30min, 上清液通过 8K 分离膜超滤后加入
1.0mol/L 渗透稳定剂, 然后用 0.22 µm 滤膜过滤
除菌, 放在 4℃下保存备用。
1.6.2 条斑紫菜的处理和原生质体的分离
(1) 材料处理 取新鲜的条斑紫菜
(Porphyra yezoensis), 刷去附着的杂藻和原生动
物, 在含0.7% KI的消毒海水中浸泡20min, 进一步
杀死藻体上的原生动物, 用消毒海水反复冲洗, 滤
纸吸干。称取藻体约 1g, 用刀片切成细碎小块, 过
300 目绢以滤洗去机械损伤的细胞内容物, 加入装
有 10ml 酶液的三角瓶中, 25℃下低速摇动黑暗酶
解。
(2) 原生质体鉴定方法 用蒸馏水渗涨法
处理样品 , 迅速在显微镜下观察细胞是否涨破 ,
涨破后有无细胞壁存在。若不涨破或涨破后有细
胞壁的残余存在, 则不是原生质体。
(3) 原生质体的分离 藻体经 3—4h 酶解
后有大量的原生质体, 单细胞从组织块游离出来,
停止酶解 , 然后用 300 目绢过滤 , 将滤出液以
800g 离心 3—4min, 用吸管小心吸去上清液, 沉
淀反复用高渗海水(4.5% W/V, NaCl) 轻轻冲洗、
离心, 即得大量原生质体。
1.6.3 单细胞和原生质体产率和成活率的统计
用血球计数板统计酶解总细胞数和游离细胞和原
生质体数, 单细胞和原生质体产率为酶解物中单
细胞和原生质体总数占酶解总细胞数的百分比。
原生质体的成活率为发育成愈伤组织的原生质体
占酶解中单细胞和原生质体总数的百分比。
1.6.4 酶解时间对条斑紫菜细胞解离的影响
1.0mol/L 葡萄糖作为渗透稳定剂条件下, 酶解时
间分别为 2.5h、3.0h、3.5h、4.0h后, 统计了原生
质体产率和成活率的影响。
1 . 6 . 5 渗透剂对条斑紫菜细胞解离的影响
以 1.0mol/L NaCl、1.0mol/L葡萄糖、1.0mol/L甘
露醇、1.0mol/L山梨醇作为渗透剂在酶解 3.5h后,
统计原生质体的产率和成活率。
1.6.6 原生质体的培养 过滤海水于 121℃高
温灭菌 20min, 冷却后加入 1% PESI备用。将收
集到的原生质体, 用高渗消毒海水悬浮后, 加入
到盛有高渗海水的灭菌平板中, 移入到 20℃培养
室培养, 并逐步降低盐度至普通海水, 光照时间
为 12h/d, 光照强度为 1500—2000 lx。在培养过
程中, 每两天观察一次, 定期检查细胞健康状况
及典型发育情况, 对细胞存活率进行统计。
2 结果与分析
2.1 初筛和复筛
作者在本实验中从青岛太平角海域海水和
红藻样品中筛选出多株琼胶降解菌, 经过液体发
酵培养复筛 , 比较了不同菌株产酶能力的大小 ,
得到一株具有高效产琼胶酶能力的菌株 F-6(表 1),
用于本实验发酵条件优化和酶对条斑紫菜的解离
作用的实验。该菌株能在以琼胶作为唯一碳源的
平板上生长, 分泌胞外酶降解琼胶, 使得菌落周
围形成凹陷的透明圈。平板培养 72h后用卢卡氏
碘液染色观察降解效果。琼胶平板未被降解的地
方可以被染色, 而琼胶降解菌产生琼胶酶降解了
菌落周围的琼胶形成透明圈, 降解形成的琼胶寡
糖因具有还原性, 不能被卢卡氏碘液染色。从图
1 可以观察到菌株 F-6 具有两个明显的降解圈,
而其他菌株只有一个降解圈。据作者初步判断可
能是菌株 F-6 产两种琼胶酶, 它们的降解方式、
降解活性和渗透性能不一样。透明圈 1可能被某
一种酶降解或两种酶共同作用, 降解成为低分子
量、具有高还原性的寡糖, 因不能被卢卡氏碘液
染色而透明圈较亮; 而透明圈 2 可能被另一种酶
因其具有高渗透性能和降解方式不一样, 琼胶被
降解为相对高的分子量、低还原性的寡糖, 透明
圈较暗。这与文献报道的琼胶降解菌产多种琼胶
酶相一致(Araki et al, 1998a)。具体的机制有待进
一步研究。

表 1 摇瓶复筛结果
Tab.1 Results of shaking cultivation screening of agarolytic strains
菌株 F-1 F-2 F-3 F-4 F-5 F-6
酶活(U/ml) 218 235 260.2 245 267 330
346 海 洋 与 湖 沼 38卷

图 1 不同琼胶降解菌株卢卡氏碘液染色效果(平板培养 72h)
Fig.1 Results of Lugol dyeing of different agarolytic
strains (growing on plate for 72h)


图 2 菌株 F-6生长曲线和产酶曲线
Fig.2 Duration of growth and enzyme formation of strain F-6

2.2 发酵条件的优化
2.2.1 培养时间对产酶的影响 随着培养时间
的延长, 菌体的密度和发酵液的酶活力都持续增长,
培养 36h 后, 菌体的密度和酶活力几乎同时达到最
大值, 之后两者都逐渐降低(图 2)。

2.2.2 培养基起始 pH 值对产酶的影响 培养
基的起始 pH值对产酶影响较大, pH值在 7.0—8.0
时, 发酵液酶活力较高, 当起始 pH值小于 6.5或
大于 8.5时发酵液酶活力都很低(表 2)。
2.2.3 培养温度对产酶的影响 试验结果表
明, 在 20—34℃范围内琼胶降解菌株 F-6 都能生
长, 但在 24—28℃范围内, 菌体产酶活性高, 在
26℃时, 酶活性最高(表 3)。
2.2.4 NaCl 对产酶的影响 试验结果表明在低
浓度 NaCl下, 不利于琼胶降解菌的产酶。在 NaCl
浓度为 2.0%—3.0%条件下, 菌株产酶能力较强(表
4), 这说明了该菌株具有海洋菌的特性。
2.2.5 琼胶浓度对产酶的影响 实验结果表
明, 在一定的范围内, 琼胶浓度的增加有利于诱
导菌株产琼胶酶, 最适琼胶浓度为 0.6%—0.7%。
琼胶浓度过高又会抑制菌株产酶。琼胶浓度过低
时, 培养基粘度小、通气量大, 使菌体利用琼胶
的速度快。但由于培养基中的琼胶浓度低, 菌体
在较短时间内开始利用已降解产生的小分子糖
作碳源。降解琼胶的产物——小分子还原糖抑制
酶的产生, 同时缺乏琼胶底物的诱导, 菌体产琼
胶酶的能力下降。但随着培养基中的琼胶浓度的
增加, 培养基的粘度增加, 通气量小, 菌体难以
被诱导产生琼胶酶 , 降解琼胶产生小分子还原
糖以维持菌株正常的生命代谢活动 , 因此过量
的琼胶底物会抑制琼胶酶的产生(表 5)。
2.2.6 酵母粉含量对产酶的影响 试验结果
表明在满足了菌体生长所必需的生长因子后酵母
粉的浓度对产酶影响不大(表 6)。

表 2 培养基起始 pH值对产酶的影响
Tab.2 Effects of initial pH of medium on agarase production
pH值 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0
相对酶活力(%) 0 29.7 33.9 41.1 69.1 85.2 100 76.9 69.6 47.8

表 3 培养温度对产酶的影响
Tab.3 Effects of cultivation temperature on agarase production
温度(℃) 20 22 24 26 28 30 32 34
相对酶活力(%) 47.6 60.4 77.7 100 91.1 87.7 82.7 74.9

表 4 NaCl浓度对产酶的影响
Tab.4 Effects of concentration of NaCl on agarase production
NaCl浓度(W/V, %) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
相对酶活力(%) 31.6 42.7 48.5 75.8 88.8 100 89.5 82.7
4期 付万冬等: 琼胶降解菌 F-6筛选、培养条件及对条斑紫菜(Porphyra yezoensis)细胞解离作用的研究 347
表 5 琼胶浓度对产酶的影响
Tab.5 Effects of concentration of agar on agarase production
琼胶浓度(W/V,%) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
相对酶活力(%) 44.2 46.5 51.4 54.2 57.0 93.4 100 39.8 38.2 33.2

表 6 酵母粉浓度对产酶的影响
Tab.6 Effects of concentration of yeast powder on agarase production
酵母粉浓度(W/V,%) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
相对酶活力(%) 87.1 100 96.6 94.4 92.2 85.4

2.2.7 氮源对产酶的影响 试验结果表明菌株
F-6 能在多种不同氮源中生长, 但在两个不同浓度
(0.30%和 0.50%)的不同种氮源产酶能力差别较大。
蛋白胨和 NaNO3 为氮源浓度为 0.30%的培养基中
有利于菌株 F-6产酶(图 3)。
2.2.8 正交试验的结果与分析 试验的结果
见表 7 和表 8, 从表 8 可以看出琼胶浓度和蛋白
胨浓度对菌株产酶影响显著, 所以控制好氮源和
琼胶浓度, 能确保高效产酶。而 NaCl浓度和酵母
粉浓度对菌株的产酶影响不显著。这说明了 NaCl
和酵母粉浓度在一定范围内, 菌株产酶具有稳定
性。从表 7 可以得出最佳的培养基成分组合为
A3B3C2D3。通过单次单因子和正交实验, 确定最
佳的培养基成分(W/V): 琼胶 0.7%, 酵母粉 0.3%,
蛋白胨 0 .5%, NaCl 2 .0%, K 2 HPO 4 0 .1%,
MgSO4·7H2O 0.05%, FeSO4·7H2O 0.002%, CaCl2
0.02%, pH＝7.5。最佳的培养条件为 26℃, 摇床
转速为 150r/min, 接种量为 2%, 500ml 三角瓶装
液量为 100ml, 培养 36h。


图 3 不同浓度的氮源对产酶的影响
Fig.3 Effects of different concentration of
nitrogenous sources on agarase production

表 7 正交实验结果
Tab.7 Results of orthogonal experiment
因 素

酶活力(U/ml)
序号
A B C D X1 X2 X3 Xi
1 1 1 1 1 427.7 420.4 451.0 1299.1
2 1 2 2 2 512.7 554.0 536.0 1602.7
3 1 3 3 3 580.7 563.9 631.6 1776.2
4 2 1 2 3 602.5 563.9 607.4 1773.8
5 2 2 3 1 419.8 493.3 498.1 1411.2
6 2 3 1 2 469.0 459.3 483.6 1411.9
7 3 1 3 2 512.7 488.4 541.8 1542.9
8 3 2 1 3 571.0 537.0 556.4 1664.4
9 3 3 2 1 566.1 512.7 498.1 1576.9
T1 4678.0 4615.8 4375.4 4287.2 ∑=14059.1
T2 4596.9 4678.3 4953.4 4557.5
T3 4784.2 4765.0 4730.3 5214.4
348 海 洋 与 湖 沼 38卷
表 8 正交实验结果方差分析
Tab.8 Analysis of variance of results of orthogonal experiment
因素 平方和 自由度 均方 F值
A 1960.6 2 980.3 1.29
B 1247.6 2 623.8 0.82
C 18881.9 2 9441.0 12.39**
D 50528.9 2 25264 33.16**
误差 13714.9 18 761.9
总的 86333.9 26
**表示 F0.01(2, 20) = 5.85

2.3 琼胶酶的对条斑紫菜细胞的解离作用
2.3.1 原生质体的制备和培养 以超滤浓缩滤
菌后的琼胶酶为工具酶, 酶解条斑紫菜藻块, 2.0h
以后组织块开始有些软化, 显微镜下观察, 藻块边
缘细胞的细胞壁疏松, 2.5h 后, 大约 25%细胞从组
织块中游离出来; 3.5—4h 后大约 80%细胞已经从
组织块中解离下来。收集于离心管底部的条斑紫菜
原生质体呈现淡红色。用蒸馏水渗涨法处理样品后,
观察到 85%的细胞已经去除了细胞壁。经血球计数
板观察计数, 换算, 每克新鲜紫菜原生质体产率为
3×106个。在显微镜下观察这些原生质体, 多数呈
淡红色和红色, 均有浓厚的原生质。细胞大小不一,
原生质体的直径为 5—12µm。这可能与酶解材料的
部位有关, 髓部细胞和表皮细胞较大, 皮层细胞则
较小。原生质体的发育过程见图 4。
2.3.2 酶解时间对原生质体产率和成活率的影
响 随着酶解时间的增加, 原生质体产率也增
加, 但是原生质体的成活率却下降了(表 9)。琼胶
酶是复合酶, 其组分复杂, 也含有有害成分。一
般说来, 酶浓度越高, 对细胞的毒害就越大。所
以在能满足分离一定量的原生质体的基础上, 应
尽可能地降低酶浓度, 这有助于提高原生质体的
成活(Araki et al, 1990)。
2.3.3 渗透剂对原生质体产率和成活率的影响
不同的渗透剂对原生质体的产率和成活率影响不
同, 以葡萄糖作为渗透剂为好(表 10)。


图 4 原生质体发育过程(10×40)
Fig.4 The processes of development of P. yezoensis
protoplast (10×40)
a: 降解分离得到条斑紫菜原生质体; b: 培养 3—4天后,
原生质体再生了细胞壁; c: 培养 5—6天后, 部分细胞有
出芽现象; d: 培养 7—10 天后, 大部分细胞有出芽现象;
e: 细胞初始部位发育成固着器; f: 培养 16天后, 细胞发
育成愈伤组织

表 9 不同时间的酶解效果
Tab.9 Effects of different times on enzymatic hydrolysis to P. yezoensis
项 目 2.5h 3.0h 3.5h 4.0h
原生质体产率(%) 25 55 75 80
成活率(%) 70 65 60 50

表 10 不同渗透剂的酶解效果
Tab.10 Effects of different permeabilization agents on enzymatic hydrolysis to P. yezoensis
渗透剂(1mol/L) NaCl 葡萄糖 甘露醇 山梨醇
产率(%) 70 80 55 60
成活率(%) 45 60 50 50
注: 表 9和表 10试验结果是重复 3次试验的结果的平均值
4期 付万冬等: 琼胶降解菌 F-6筛选、培养条件及对条斑紫菜(Porphyra yezoensis)细胞解离作用的研究 349
3 讨 论
3.1 产酶菌株的筛选和条件优化
本实验中利用琼胶作为唯一碳源的选择性
培养基, 从青岛近海海水中筛选到一株具有高琼
胶降解能力的海洋菌 F-6, 通过培养条件优化 ,
该菌在发酵培养基中 36h 达到产酶高峰, 产酶能
力较高而且稳定, 发酵液酶活力达到 631.6U/ml,
高于一些报道的产琼胶酶菌株(Vera et al, 1998;
Leon et al, 1992), 为酶的分离纯化、产业化生产
及活性琼胶低聚糖的开发奠定了基础, 同时对该
菌株的菌种鉴定和其酶蛋白结构的分析、酶基因
的克隆及序列分析等尚待进一步研究。
3.2 酶的生物学效应
本实验利用发酵液离心, 上清液通过超滤浓
缩, 过 0.22µm滤膜除菌来降解紫菜组织块, 能够
较好的分离得到大约 3×106个/g鲜藻的原生质体,
与以往报道的利用琼胶酶和纤维素酶等混合酶液
(Sugano, 1993)才能很好除去细胞壁相比有一定
的优势。
参 考 文 献
王静雪, 江晓路, 胡晓珂, 2001. 细菌降解琼胶的研究进
展. 中国水产科学, 8(3): 94
毛文君 , 林 洪 , 管华诗 , 2001. 琼胶寡糖的制备及
13C-NMR研究. 水产学报, 25(6): 582—584
北京大学生物教研室 , 1992. 生物化学实验指导 . 北京 :
高等教育出版社, 4
徐 强, 薛长湖, 赵 雪等, 2002. 酸解法制备琼胶低聚
糖及其抗氧化性评价. 中国海洋药物, 85: 19—22
Araki T, Hayakawa M, Lu Z et al, 1998a. Purification and
characterization of agarases from a marine bacterium,
Vibro sp. PO-303. Marine Biotechnology, 6(4): 260—265
Araki T, Hayakawa M, Tamaru Y et al, 1994. Isolation and
regeneration of haploid protoplasts from Bangia
atropurpurea (Rhodophyta) with marine bacterial
enzymes. Phycology, 30: 1040—1046
Araki T, Lu Z, Morishita T, 1998b. Optimization of
parameters for isolation of protoplasts from Gracilaria
verrucosa (Rhodophyta). Journal of Marine Biotec-
hnology, 6(3): 193—197
Araki T, Morishita T, 1990. Fusion of Protoplasts from wild
type Porphyra yezoensis and green type P. tenera Thalli
(Rhodophyta). Nippon Suisan Gakkaishi, 56(7): 1161
Leon O, Quintana L, Peruzzo G et al, 1992. Purification and
properties of an extracellular agarase from Alteromonas
sp. strain C-1. Applied and Environmental Micro-
biology, 58(12): 4060
Sugano Y, 1993. Purification and characterization of a new
agarase from a marine bacterium, Vibro Strain JT107.
Applied and Environmental Microbiology, 1549—1554
Sugano Y, Matsumoto T, Kodama H et al, 1993. Cloning and
sequencing of agaA, a unique Agarase 0107 gene from
a marine bacterium, Vibrio sp. Strain JT0107. Applied
and Environmental Microbiology, 59(11): 3570
Vera J, Alvarex R, Murano E et al, 1998. Identification of a
marine agarolytic Pseudoalteromonas isolate and
characterization of its extra cellular agarase. Applied
and Environmental Microbiology, 64(11): 4378
350 海 洋 与 湖 沼 38卷
SCREENING AND CULTIVATION OF AGAROLYTIC BACTERIUM F-6 AND THE
DECOMPOSING EFFECT OF AGARASE ON CELLS OF PORPHYRA YEZOENSIS
FU Wan-Dong, HAN Bao-Qin, WANG Chang-Hong, LIU Wan-Shun
(College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao, 266003)
Abstract The authors isolated F-6, a marine agarolytic bacterium able to produce agarase effectively from red
algae in coastal seawater in Qingdao, Shandong of China, using agarose medium as the only-carbon source. The
experiment was carried out from Sep. 2004 to Mar. 2005 for studying the decomposition effect by agarase on
Porphyra yezoensis cells.
With one-factor-at-a-time method and orthogonal experiment, the optimal fermentation condition of strain F-6
was determined. Besides, the decomposition effect by agarase on P. yezoensis cells was studied. Main procedures
of experiment of decomposition effect were 1) centrifuged the fermentation broth at 6000g for 30min to obtain
supernatant for culture; 2) ultrafiltrated the supernatant and then mixed with 1mol/L permeabilization agents;
3) filtrated the mixture for removing bacteria by 0.22µm separate film; 4) decomposed P. yezoensis tissue for
producing protoplasts; 5) poured the collected protoplasts into hyperosmotic and sterilized in sea water with 1%
PESI; 6) cultivated the protoplasts in 20℃ in light scheme of 12h/day at 1500—2000 lx until the salt
concentration was gradually declined to normal sea water level. We also examined the healthy condition of the
protoplasts, typical development of cells and their survival rate.
The optimal fermentation condition of strain F-6 was agar 0.7%; yeast powder 0.3%; peptone 0.5%; NaCl 2.0%;
K2HPO4 0.1%; MgSO4·7H2O 0.05%; FeSO4·7H2O 0.002%; CaCl2 0.02%; and initial pH 7.5. The optimal
temperature and duration were 26℃ and 36h, respectively, at which the highest agarase activity reached
631.6U/ml. The experiments of decomposition effect of agarase on P. yezoensis cells and protoplast cultivation
showed that the agarase could easily decompose P. yezoensis tissue into protoplasts at production rate of about 3×
106 protoplasts per gram of the tissue. The optimal duration of enzymatic hydrolysis to P. yezoensis was 3.5h. The
permeabilization agent of glucose (1mol/L) could obviously improve the production rate and survival rate of the
protoplasts. The protoplasts could develop into callus at survival rate of approximately 60%.
Key words Agarolytic bacterium, Agarase, Optimization of cultivation condition, Porphyra yezoensis,
Protoplast