全 文 ：第９卷第３期
２０１１年５月
生　物　加　工　过　程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．３
Ｍａｙ２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０３．００８
收稿日期：２０１１－０１－１３
基金项目：国家创新性基金项目（１０１０４２２３９）；山东大学科技立项重点项目专项基金（Ａ１００１０）
作者简介：朱启忠（１９５７—），男，山东单县人，教授，研究方向：生物化学和酶工程，Ｅｍａｉｌ：ｈｚｚｑｚ＠ｓｄｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
海洋细菌ＡｇａｒｉｖｏｒａｎｓａｌｂｕｓＮＢＲＣ１０２６０３琼胶酶的分离纯化
朱启忠，朱慧文，孙艳娜，周晓龙，郝　梅，郭振博
（山东大学威海分校 海洋学院，威海 ２６４２０９）
摘　要：利用盐析、分子筛和离子交换等方法对海洋细菌 ＡｇａｒｉｖｏｒａｎｓａｌｂｕｓＮＢＲＣ１０２６０３分泌的琼胶酶粗酶液进行
分离纯化，得到琼胶酶Ａ和琼胶酶Ｂ。琼胶酶Ａ纯化倍数为１７５１倍，酶比活力为８８１８２Ｕ／ｍｇ；琼胶酶Ｂ纯化倍
数为１６６４倍，酶比活力为８３８３２Ｕ／ｍｇ。纯化的琼胶酶经 ＳＤＳＰＡＧＥ检测，显示为单一条带，其相对分子质量分
别为酶Ａ８３６×１０４和酶Ｂ３６８×１０４。
关键词：海洋细菌；琼胶酶；分离；纯化
中图分类号：Ｑ９３３３１　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０３－００３７－０４
ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｇａｒａｓｅｆｒｏｍｍａｒｉｎｅｂａｃｔｅｒｉａＡｇａｒｉｖｏｒａｎｓａｌｂｕｓＮＢＲＣ１０２６０３
ＺＨＵＱｉｚｈｏｎｇ，ＺＨＵＨｕｉｗｅｎ，ＳＵＮＹａｎｎａ，ＺＨＯＵＸｉａｏｌｏｎｇ，ＨＡＯＭｅｉ，ＧＵＯＺｈｅｎｂｏ
（ＭａｒｉｎｅＣｏｌｅｇｅ，ＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙａｔＷｅｉｈａｉ，Ｗｅｉｈａｉ２６４２０９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｇａｒａｓｅｓＡａｎｄＢｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｓａｌｔｉｎｇｏｕｔ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｉｅｖｅ，ａｎｄｉｏｎｅｘ
ｃｈａｎｇｅｆｒｏｍｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｏｆｍａｒｉｎｅｂａｃｔｅｒｉａＡｇａｒｉｖｏｒａｎｓａｌｂｕｓＮＢＲＣ１０２６０３．Ｔｈｅｏｂｔａｉｎｅｄｅｎｚｙｍｅ
ａｇａｒａｓｅＡｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄ１７．６ｆｏｌｄｓｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ８８１８２Ｕ／ｍｇ，ｗｈｉｌｅａｇａｒａｓｅＢｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄ
１６６４ｆｏｌｄｓｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ８３８２Ｕ／ｍｇ．Ｔｈｅｅｎｚｙｍｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｏｂｅｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｂｙ
ＳＤＳＰＡＧＥ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓｅｓｗｅｒｅ８３６×１０４ａｎｄ３６８×１０４，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍａｒｉｎｅｂａｃｔｅｒｉａ；ａｇａｒａｓｅ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　　琼胶是一种重要的海藻多糖，主要由琼胶糖和硫
琼胶组成［１］。琼胶酶是降解琼胶糖最有潜力的方法，
其降解过程具有得率高、污染小和产物安全性高等优
点，降解琼胶糖得到的琼寡糖产品已广泛应用于食品
业、化妆品业和医药工业［２－５］，可作为天然的防腐剂、
淀粉老化抑制剂、功能性食品基料、抗氧化剂等。此
外，琼胶酶是一种海藻遗传工程的工具酶，利用琼胶
酶降解琼胶糖从琼胶糖凝胶中回收 ＤＮＡ和 ＲＮＡ［５］
已经被证明是最好的方法之一；大多数琼胶酶的研究
都是针对于陆地微生物，虽有少量关于海洋细菌琼胶
酶的研究［６－９］，但大多数集中于菌株筛选、发酵条件
优化和性质等方面，而对该酶的分离纯化研究较少，
仅见解卉等［１０－１１］对海洋ＡｇａｒｉｖｏｒａｎｓａｌｂｕｓＱＭ３８和海
洋紫色杆菌菌株做过分离纯化。为扩大琼脂酶生产
菌株来源，了解不同菌株产琼脂酶特性的异同，笔者
在对海洋细菌ＡｇａｒｉｖｏｒａｎｓａｌｂｕｓＮＢＲＣ１０２６０３分泌琼
胶酶发酵条件优化的基础上，对发酵粗酶液进行分离
纯化，以对该酶性质、固定化的进一步研究和获得高
纯度的琼胶糖建立基础方法。
１　材料与方法
１１　菌种
琼胶酶高产菌株（Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓａｌｂｕｓ）ＮＢＲＣ１０２６０３，
由山东大学威海分校海洋学院微生物实验室提供。
１２　主要试剂及仪器
１２１　主要试剂
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ １００，上海拜力生物科技有限公
司；ＤＥＡＥ纤维素（ＤＥＡＥ３２），Ｓｉｇｍａ公司；Ａｇａｒ
ｏｓｅＬＥ，ＭＤＢｉｏ，Ｉｎｃ蛋白标准品，Ｔａｋａｒａ公司。
１２２　主要仪器
ＴｈｅｒｅｔｏＯｒｉｏｎ８１８型ｐＨ测试仪，美国奥力龙公
司；ＨＬ ２恒流泵、ＨＤ ３紫外检测仪、ＢＳ １６０Ａ自
动部分收集器，上海泸西分析仪器厂；ＸＷＴ Ｓ台式
纪录仪，上海自动化仪器三厂；ＤＹＹ６Ｃ型电泳仪，
北京六一仪器厂；７５２型紫外分光光度计，上海光谱
仪器有限公司。
１３　培养基
发酵培养基：蛋白胨４ｇ，酵母浸膏１２５ｇ，磷酸
高铁００１ｇ，琼胶粉５ｇ，陈海水１Ｌ，ｐＨ７２～７８。
１４　琼胶酶活性测定
参照文献［１２］测定琼胶酶活性。取０２ｍＬ酶
液于试管中，４０℃水浴环境下加入１８ｍＬ底物溶
液，混匀，反应１０ｍｉｎ后加入１５ｍＬ３，５ 二硝基
水杨酸（ＤＮＳ）溶液，置于沸水浴中５ｍｉｎ，然后用流
动水迅速冷却，加水至２５ｍＬ，在５４０ｎｍ处测吸光
值。按每毫升发酵液每分钟降解产生１μｍｏｌ还原
糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，Ｕ。
１５　酶的分离纯化
１５１　（ＮＨ４）２ＳＯ４盐析
发酵上清液中加入（ＮＨ４）２ＳＯ４粉末至０～９０％
饱和度，４℃静置过夜，６０００ｒ／ｍｉｎ冷冻离心３０ｍｉｎ
收集沉淀，用少量冷却的磷酸盐缓冲液溶解，置于
透析袋中透析除盐。测定不同区间透析液的酶活
力和蛋白质浓度，计算酶的比活力，由此确定此琼
胶酶分段盐析最适的（ＮＨ４）２ＳＯ４饱和度。
１５２　ＤＥ３２离子交换层析
透析后所得酶液通过０２２μｍ的微孔滤膜以
除去杂质，上样于２０ｍｍｏｌ／ＬｐＨ７２ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲
液平衡的ＤＥＡＥ纤维素 ３２柱（１５ｃｍ×１５ｃｍ）
进行离子交换层析，用同样缓冲液配制的含 ＮａＣｌ
（０～０５ｍｏｌ／Ｌ）的梯度溶液洗脱，流速约为 ０５
ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长为２８０ｎｍ。洗脱液分部收集，每
管４５ｍＬ。测定洗脱管峰部分的试管中溶液的酶
活力，将有活性的部分合并。
１５３　葡聚糖凝胶Ｇ １００凝胶过滤层析
将１５２得到的酶液，取３ｍＬ上样于２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ｐＨ７２ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液平衡的葡聚糖 Ｇ １００凝胶柱
（２０ｃｍ×８０ｃｍ）进行凝胶柱层析，用２０ｍｍｏｌ／ＬｐＨ
７２ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液洗脱，控制流速为０５ｍＬ／ｍｉｎ。洗
脱液经紫外检测并分部收集（每管４５ｍＬ），分别测定
出峰部分试管的酶活力，将有活性的部分合并。
１６　ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析
参照文献［１３］的方法进行 ＳＤＳＰＡＧＥ。分离胶
质量分数１２％，浓缩胶质量分数８％，蛋白染色与脱
色均采用常规考马斯亮蓝染色法和脱色技术。
２　结果与讨论
２１　（ＮＨ４）２ＳＯ４盐析结果
测定不同（ＮＨ４）２ＳＯ４饱和度下得到的酶液酶
活，结果如图 １所示。由图 １可知：该琼胶酶在
（ＮＨ４）２ＳＯ４饱和度大于３０％时开始析出，并且在较
广泛的饱和度范围内存在，故在后续步骤中，制取
酶制品时先除去０～３０％（ＮＨ４）２ＳＯ４饱和区间内的
杂蛋白，然后收集３０％～９０％饱和区间内的蛋白沉
淀进行透析。
图１　（ＮＨ４）２ＳＯ４盐析结果
Ｆｉｇ．１　Ｓａｌｔｉｎｇｏｕｔｒｅｓｕｌｔｓｗｉｔｈａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ
２２　ＤＥＡＥ阴离子交换层析结果
透析后酶液经０２２μｍ的微孔滤膜、ＤＥＡＥ阴
离子交换层析后得到很好的纯化效果，结果如图２
所示。由图２可知：经该步纯化，可去掉大量杂蛋
白，从第２０号管出现具有酶活蛋白，到４０号管酶活
蛋白消失，并且出现２个酶活高峰，分别在２４～２５
管和２９～３２号管，酶活蛋白分布较为集中。
２３　葡聚糖 Ｇ １００凝胶过滤层析结果
葡聚糖 Ｇ １００凝胶过滤层析结果如图 ３所
示，得到纯化的琼胶酶Ａ（第１个活性峰）和 Ｂ（第２
个活性峰）。由图３可知：该步纯化又进一步去掉
了部分杂蛋白，并且和上步纯化非常吻合，出现２个
比较集中的酶活峰。酶Ａ峰从第１２号管开始到２０
８３ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷　
图２　ＤＥＡＥ离子交换色谱
Ｆｉｇ．２　Ｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈＤＥＡＥ
号管结束，酶Ｂ峰从２４号管到３２号结束，２个酶活
峰之间无交叉，说明２个具有酶活的琼胶酶 Ａ和琼
胶酶Ｂ得到很好的分离。
图３　葡聚糖 Ｇ １００凝胶过滤层析色谱
Ｆｉｇ．３　ＧｅｌｆｉｌｔｅｒｉｎｇｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００
２４　琼脂酶纯化结果
上清液经上述各纯化步骤后，得到纯化的琼胶
酶Ａ和Ｂ，结果如表１所示。由表１可知：琼胶酶Ａ
的比活力为８８１８２Ｕ／ｍｇ，产率为１１９４％，纯化倍
　　　表１　琼脂酶的纯化
Ｔａｂｌｅ１　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｇａｒａｓｅ
纯化步骤 ｍ（总蛋白）／ｍｇ 总酶活力／Ｕ 比活力／（Ｕ·ｍｇ－１） 产率／％ 纯化倍数
发酵上清液 ５６４７ ２８４４５ ５０３７ １００００ １００
（ＮＨ４）２ＳＯ４沉淀 ２５４２ ２０９４９ ８２４１ ７３６４ １６４
ＤＥＡＥ阴离子交换层析 １６４ ９１４１ ５５７３５ ３２１３ １１０６
酶Ａ（葡聚糖 Ｇ １００）凝胶过滤层析 ０３９ ３３９５ ８８１８１ １１９４ １７５１
酶Ｂ（葡聚糖 Ｇ １００）凝胶过滤层析 ０３１ ２５９９ ８３８３２ ９１４ １６６４
　
数为１７５１；琼胶酶 Ｂ的比活力为８３８３２Ｕ／ｍｇ，产
率为９１４％，纯化倍数为１６６４。
图４　ＳＤＳＰＡＧ结果
Ｆｉｇ．４　ＲｅｓｕｌｔｏｆＳＤＳＰＡＧＥ
２５　琼胶酶的纯度鉴定及相对分子质量的测定
经纯化后的蛋白经 ＳＤＳＰＡＧＥ电泳，结果如图
４所示。图４中，对比试样蛋白质的相对迁移距离
与已知相对分子质量标准蛋白（Ｍ）的相对迁移距
离，计算得到试样蛋白质的相对分子质量分别为酶
Ａ８３６×１０４和酶Ｂ３６８×１０４。
３　结论
采用（ＮＨ４）２ＳＯ４盐析、阴离子交换层析、凝胶过滤
层析对琼胶粗酶进行纯化，得到２个具有琼胶酶活力
的洗脱峰，分别命名为琼胶酶Ａ、琼胶酶Ｂ。琼胶酶Ａ
纯化倍数为１７５１倍，酶比活力为８８１８２Ｕ／ｍｇ；琼胶
酶Ｂ纯化倍数为１６６４倍，酶比活力为８３８３２Ｕ／ｍｇ。
经过ＳＤＳＰＡＧＥ检验，２个洗脱峰均呈单条带，其相对
分子质量确定为酶Ａ８３６×１０４和酶Ｂ３６８×１０４。
参考文献：
［１］　ＬａｋｓｈｍｉｋａｎｔｈＭ，ＭａｎｏｈａｒＳ，ＳｏｕｃｈｅＹ，ｅｔａｌ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒβａｇａ
ｌａｓｅＬＳＬ１ｐｒｏｄｕｃｊｎｇｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅｆｒｏｍａｎｅｗｌｙｉｓｏｌａｔｅｄａｇａｒ
ｌｉｑｕｆｙｉｎｇｓｏｉｌｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐ．，ＡＧＬＳＬ１［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ
ＪｏｕｎｒａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，２２：１０８７１０９４．
［２］　ＹｏｕｎｇＫＳ，ＢｈａｔａｃｈａｒｊｅｅＳＳ，ＹａｐｈｅＷ．Ｅｎｚｙｍｉｃｌｅａｖａｇｅｏｆｔｈｅ
αｌｉｎｋａｇｅｓｉｎａｇａｒｏｓｅ，ｔｏｙｉｅｌｄａｇａｒｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ［Ｊ］．Ｃａｒｂｏ
ｈｙｄｒＲｅｓ，１９７８，６６：２０７２１２．
［３］　ＫｏｂａｙａｓｈｉＲ，ＴａｋｉｓａｄａＭ，ＳｕｚｕｋｉＴ，ｅｔａｌ．Ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅａｓａｎｏ
ｖｅｌｍｏｉｓｔｕｒｉｚｅｒｗｉｔｈｗｈｉｔｅｎｉｎｇｅｆｅｃｔ［Ｊ］．ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏ
９３　第３期 朱启忠等：海洋细菌ＡｇａｒｉｖｏｒａｎｓａｌｂｕｓＮＢＲＣ１０２６０３琼胶酶的分离纯化
ｃｈｅｍ，１９９７，６１（１）：１６２１６３．
［４］　ＹｏｓｈｉｚａｗａＹ，ＡｍｅｔａｎｉＡ，ＴｓｕｎｅｈｉｒｏＪ，ｅｔａｌ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｔｉｍｕｌａ
ｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍａｍａｒｉｎｅａｌｇａ
（Ｐｏｒｐｈｙｒａｙｅｚｏｅｎｓｉｓ）：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｆｕｎｃｔｉｏｎｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓａｎｄｉｍ
ｐｒｏｖｅｄｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］．ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，１９９５，５９（１０）：
１９３３１９３７．
［５］　ＳｕｇａｎｏＹ，ＴｅｒａｄａＩ，ＡｒｉｔａＭ，ｅｔａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ
ｔｉｏｎｏｆａｎｅｗβａｇａｒａｓｅｆｒｏｍｍａｒｉｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｖｉｂｒｉｏｓｐ．ｓｔｒａｉｎＪＴ
０１０７［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９５，５９（５）：１５４９１５５４．
［６］　杜宗军，王鹏，李筠．两株琼胶酶高产细菌的筛选和鉴定［Ｊ］．
海洋科学，２００２，２６（３）：１３．
［７］　褚艳，于文功，韩峰．琼胶酶高产海洋假单胞菌 ＣＹ２４的筛选
及培养条件优化［Ｊ］．中国海洋药物，２００３，１５（５）：１４．
［８］　陈惠源，蔡俊鹏，刘江涛．海洋细菌产琼胶酶的条件优化［Ｊ］．
现代食品科技，２００５，２１（３）：４８５０．
［９］　王静雪，江晓路，牟海津．海洋弧菌 ＱＪＨ１２发酵产琼胶酶条
件的优化［Ｊ］．海洋科学，２００７，３１（７）：８１３．
［１０］　解卉，韩宝芹，董文．一种海洋琼胶酶的分离纯化、酶学性质
研究及降解产物分析［Ｊ］．微生物学报，２００９，４９（７）：
８９６９０１．
［１１］　时岩玲，于文功，路新枝．海洋紫色杆菌β 琼胶酶的分离纯化
及性质［Ｊ］．武汉大学学报：理学版，２００８，５４（４）：４９７５０２．
［１２］　ＩｍｏｔｏＴ，ＹｅｇｉｓｈｉｔａＫ．Ａｓｉｍｐｌｅａｃｔｉｖｉｔｙｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｌｙｓｏｚｙｍｅ
［Ｊ］．ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７ｌ，３５：１１５４１１５６．
［１３］　ＬａｅｍｍｉＵＫ．Ｃｌｅａｖａｇｅｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅａｓｓｅｍｂｌｙ
ｏｆｔｈｅｈｅａｄｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ４［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９７０，２２７：
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
６８０６８５．
国外动态
光合效率超自然树叶１０倍的“人造树叶”
在美国化学协会第２４届全国会议上，麻省理工学院化学家称，他们在可持续能源方面取得了里程碑式
突破，真正的实用型“人造树叶”首次开发成功，其光合作用效率是自然界树叶的１０倍。这种“人造树叶”并
非真的像自然界绿色植物的叶子，研究小组只是以树叶作为他们设计太阳能电池的一种风格，由硅、电子元
件、催化剂等构成。把它放入约４５Ｌ水中并暴露在阳光下，这种设备产生的电力足够支持一个发展中国家
家庭一天的用电量。
转基因酵母能进行多种糖分混合发酵
美国伊利诺伊大学香槟分校食品科学与人类营养系、加州大学劳伦斯伯克利国家实验室和英国石油公
司（ＢＰ）的科学家表示：他们对酿酒酵母进行了基因改造，新得到的酵母菌株可以发酵葡萄糖、纤维二糖和木
糖，能更好更多地把植物发酵成替代燃料乙醇。新酵母菌种将木糖转化为乙醇的效率至少比目前已知酵母
菌高２０％，使其成为最好的发酵木糖的细菌。相关研究成果发表在美国《国家科学院院刊》上。
（胡晓丽）
０４ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷