全 文 ：第 1 7卷 第6 期 海 洋 通 报
9 19 8年 2 1月 M ARI N E SCI EN〔二U E BI J L EI N T
Vol
.
1 7
,
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6
I又 e . , 1 9 9 8
江篱原生质体分离和培养的初步研究
初建松` 刘万顺 ’ 张朝阳 2
,
( * 岛海洋大学海洋生命学院 , 青岛 2 “ 0 0 3 )
2 ( 中国轻工总会翻盐工业科研所 , 天津 30 04 5 0)
摘 共 以 江蔺 6彻澎口、
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.
) P a讲 n fu ” 为材料 . 用徽生物发醉法提取的琼胶醉成功地分离到江
蔺的原生质体 , 经初步培葬 , 原生质体发 , 为愈伤组织 , 为江蔺生物工程研究和育苗利用提供了可能 。
关 . 切 江臼 琼胶曲 原生质体
江禽 G r ac il a 门油
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a ( H u ds
.
) P a p e nf us s 属红藻门江禽科江禽属的一种 , 为青岛沿海
常见经济种之一 。 江蔺中琼胶含 t 高 , 可作化工原料 l1[ 。 另外 , 江禽中还含有一些特殊物质 ,
如含硫多精 , 可作医药原料 a[] 。
目前用于海燕细胞的解壁酶类 , 多是从海产食藻动物如海螺 、 海兔 、 海胆和鲍等的消化
腺中提取的复合酶 , 该酶对单层叶状体紫菜细胞有很好的解壁作用 。 但由于其中所含琼胶酶
活性较低 , 对所含胶质 t 多的海燕细胞原生质体分离效果较差 , 而且海螺酶的生产受酶源生
物盆的限制而远不能满足科研 、 生产的需要 。 国际上利用海藻腐烂处的细菌如弧菌川 ( V l’b ior
sP
.
)
、 假单胞菌 (尸“ “ 以潮~ s p
.
)队幻等产生的胞外酶进行海藻细胞原生质体分离 。 由于技术
保密等原因 , 国内尚未开发 。 本研究将简易发醉法获取的粗酶制剂用于 海膜 、 江禽原生质体
的分离 , 均获成功 。
1 材料和方法
,
.
1 材料的采绍和衍葬
江蔺采集于青岛太平角海湾 , 选用幼嫩而健康的藻体 , 长约 5 ~ 15 c m 。 待用的江篱可放
! 在洁净海水中于 10 ℃左右低温暂养 。 暂养时间不适宜过长 。
飞. 2 醉液
琼胶醉 : 从海洋红藻中分离出高效分泌琼胶酶的菌株 . 进行发酵培养并提取制备出琼胶
粗酶 。
纤维素醉 : 日本产 C e l lu la s e “ O N ( ) Z U K A ” R一 1 0 。
混合醉液 : 以 过滤 消毒海水为溶剂 , 配制含琼胶酶和纤维素酶各 1% (W / V ) , 以及
0
.
sm ol / L 山梨醉的酶液 。
收稿 日期 . 1 9 9 8一0 6一 2 0
海 洋 通 报 17卷
1
.
3材料的处理和原生质体的分离
取江篱 , 用毛笔刷去附着杂藻和原生动物 , 在含 0 . 7% K l 的消毒海水中浸泡 10 m in , 再用
消毒海水反复冲洗多次 , 最后将藻体用滤纸吸干 。 将吸干后的藻体 ( 1 9 ) 用刀片切成小块 , 过
3 0 0 目筛绢滤洗去碎屑后置于锥形瓶中 , 加人 10 m L 已预先配好的混合酶液 , 置 25 ℃恒温水浴
摇床低速摇动 , 进行黑暗酶解 。
组织块经 3h 酶解后镜检发现细胞间连系松散 , 轻压即可相互分开 , 且已有大量单细胞游
离时即可停止酶解 , 用 3 0 0 目筛绢过滤 , 将滤出液静置 20m i n 后离心 3 ~ 4 m i n ( 5 0 0 r / m in , 8 0 0
型 离心 机 ) , 弃上清液 , 用高渗消毒海水 (含 4 . 5% W /V N a CI ) 冲洗 , 再反 复经离心 , 弃上清
液 、 冲洗等过程 2~ 3 次 , 即得大量原生质体 。
,
.
4 江蔺原生质体的鉴定闪
用蒸馏水溶涨法处理样品 , 迅速在显微镜下观察细胞是否涨破 , 涨破后是否有细胞壁存
在 。 若不涨破 , 或涨破后有壁的存在 , 则不是原生质体 。
,
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5 培养苍及培养条件
培养基 : 在过滤海水中加人 2写 P E IS 培养液 , 于 1 21 ` C 以上灭菌 15 m in 后 , 冷却备用田 。
培养条件 : 将收集到的原生质体 , 用 4 . 5% ( W / V ) N a CI 的高渗海水悬浮后 , 直接滴在
盛有高渗海水培养基的培养皿中的载玻片上 , 在低温室中 ( 10 ` C ) 培养一周 , 每两天换一次
培养基溶液并逐渐降低盐度至普通海水培养基 。 然后在 20 `C 条件下培养 , 光照时间均为 1 2 h /
d
, 光强约 注5 0 0~ 2 0 0 o l x 。
2 结果与讨论
2
,
1 原生质体分离和制备
a ) 混合酶液
海洋微生物发酵法提取制备的琼胶酶 , 具有制备方法简便 、 酶活力强等优点 。 在本研究
中 , 混合酶液中的任何一种酶均不能有效去除细胞壁 , 当二者混合使用时则效果极为显著 , 这
也说明琼胶酶能作用于琼胶 。
琼胶酶和纤维素酶都是复合酶 , 其组分比较复杂 , 也含有一些有害成分 。 一般酶浓度越
高 , 对细胞的毒害就越大 。 所以 , 在能满足分离一定量原生质体的基础上 , 应尽可能地降低
酶浓度 , 这有助于提高原生质体的活力川 。
b ) 渗透剂
吴少波等研究认为 , 采用 。 . 75 m ol / L 的 N a CI 作为渗透剂 , 比其它渗透剂如甘露醇效果
理想 。 本研究分别采用 1 . 0 m o l / L 甘露醇 、 1 . 0 m o l / L 山梨醇 、 0 . 8 m o l / L 山梨醉与 0 . 7 5 m o l /
L N a C I作渗透剂 , 进行海藻细胞解壁试验 , 结果 (见表 1) 表明 , 第一种渗透剂效果较差 , 后
两种渗透剂效果较好 。
c ) p H 值和温度
琼胶酶的最适反应 p H 值为 6 . 5 , 因此本试验采用 p H 6 . 5 的混合酶液进行酶解 。 为提高酶
活性及保证原生质体成活率 , 海藻细胞解壁一般在 25 C 下进行 , 因此本试验在 25 ` C 下进行黑
暗酶解 。 未作其它比较研究 。

2 0海 洋 通 报7 1 卷
7 M or r i ce eta l
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C a r r鳍 e e n a s e f r o价 p s e u d o mo n a s c a r r a g e e n o v o r a
9 纪明侯等 . 用 1 3C 一 N M R 光谱法研究儿种红藻含硫半乳袱锗的结构特征 。 海洋与湖沼 , 1 9 9 6 , 27 ( 3) : 3 30 ~ 3 35
1 0 P o hi e 一 F u lle r , M i e r o gr a n i s m a : d ig e , t e r o f se 脚 e e d e e lls · H y d r o b i o l姐 i a · 1 9 8 7 , 1 5 1 / 1 5 2 , 4 0 5~ 40 9
作者简介 : 初建松 , 男 , 1 9 7 0 年 3 月生 , 硕士 , 讲师 。 主要从事海洋生物活性物质方 面研究
发表论文 12 篇 。
A P r e l im i n a r y S t u d y o n t h e I s o l a t io n a n d C u l t i v a t i o n
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