全 文 ：基因组学与应用生物学，2014年，第 33卷，第 3期，第 624-632页
Genomics and Applied Biology, 2014, Vol.33, No.3, 624-632
研究报告
Research Report
三七及屏边三七病程相关基因克隆的新策略
李瑞博 1,2 申业 1* 文国松 3 冯光泉 4 曲媛 2 崔秀明 2 黄璐琦 1*
1中国中医科学院中药资源中心,北京, 100070; 2昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明, 650000; 3云南农业大学中药材研究所,昆明,
650201; 4文山学院文山三七研究院,文山, 663000
*通讯作者, shenye70@hotmail.com, huangluqi@263.net
摘 要 三七[Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen]是我国传统名贵中药材之一。近年来，三七的病虫害问题
变得越来越严峻，现已成为限制三七产业可持续发展的一个重要因素。观察发现，作为三七的近缘物种屏边
三七[Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng]在其相同的生长环境下抗病性状表现优异。如何从分子角
度挖掘利用植物本身所具备的抗病基因必将成为三七未来研究当中的一个热点问题。本研究利用人参、西
洋参的 EST数据库，通过基因注释、KEGG作图找到病原与植物识别代谢途径上有关植物病程相关的基因。
然后经 RT-PCR和 TA克隆分别获得了若干个三七和屏边三七病程相关基因，该技术的应用为三七抗病基
因的研究和克隆开辟了新的技术途径，同时也对其他药用植物的抗病研究具有参考意义。
关键词 三七,屏边三七,抗病基因,电子克隆
A New Strategy of Cloning of Resistance Genes in Panax notoginseng and
Panax stipuleanatus
Li Ruibo 1,2 Shen Ye 1* Wen Guosong 3 Feng Guangquan 4 Qu Yuan 2 Cui Xiuming 2 Huang Luqi 1*
1 National Resource Center for Chinese Materia of China, Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, 100070; Facuty of Life Science and Tech-
nology, Kunming, 650000; 2 Kunming University of Science and technology, Kunming, 650000; 3 Institute of Chinese Materia Medica of Yunnan
Agricultural University, Kunming, 650201; 4 Institute of Sanqi of Wenshan University, Wenshan, 663000
* Corresponding authors, shenye70@hotmail.com, huangluqi@263.net
DOI: 10.13417/j.gab.033.000624
Abstract Panax notoginseng is a traditional Chinese famous medicinal material. It is an undeniable fact that the
disease problem becomes increasingly serious. Now the disease has become an important factor to limit industrial
sustainable development. It was observed the disease resistant trait of Panax stipuleanatus is better than notogin-
seng in equivalent environment. It would be one of the hot topics to cloning resistant gene. Some resistance genes
of plant-pathogens interaction in Panax notoginseng and stipuleanatus were cloned by homology PCR based on
gene annotation and KEGG analysis data of related species. This method is a new way to clone gene of notogin-
seng, meanwhile, the research is also a reference to other medicinal plant of pathological research.
Keywords Panax notoginseng, Panax stipuleanatus, Resistance gene, Electronic cloning
基金项目：本研究由国家自然基金项目(81360617, 81130070, 81173490)和云南省应用基础研究计划项目(2013FA031)共同资助
植物病害是农业生产当中所面临的一种主要限
制因子，药用植物在其栽培过程中也同样面临着一
样的问题。植物受到病害感染之后，常常表现为严重
的连作障碍问题、产量剧减、药用有效成分降低及品
质变劣等一系列问题。三七[Panax notoginseng (Burk)
F.H.Chen]为五加科人参属植物，又称“南国神草”、
“金不换”等，是我国重要的名贵中药材之一。三七属
于块根入药，有显著的止血、活血化淤、消肿定痛之
功效，其使用历史已有近 600 年(崔秀明和王朝梁,
2000)。现代医学实践也证明，三七具有多种生理活性
成分，药理作用十分广泛。能够预防和治疗血液系
统、心血管系统、神经系统、免疫系统和代谢系统疾
病，以及在抗炎、抗衰老、抗肿瘤方面都有一定效力
(胡勇, 2000;何晶, 2004;刘刚等, 2005)。三七属于栽
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Genomics and Applied Biology
培驯化较早的中药材之一，至今为止其人工栽培历
史已有 400多年。而这种长期的、规模化的栽培使得
三七在自身种植中暴露出很多问题，主要表现为品
质降低、产量不稳定、极易感染病虫害等等(崔秀明
等, 2003)。屏边三七[Panax stipuleanatus H. T. Tsai et
K. M. Feng]亦是人参属植物，为三七近缘植物物种
之一，又名“野三七”、“香刺”、“土三七”等。据三七研
究院孙玉琴等(2009)老师们长期的观察发现：在同样
的生长及栽培环境条件下，发现屏边三七表现为极
少感病，基本上对三七叶部病害表现为免疫。杨涛等
(2006)人对三七的黑斑病抗性进行了研究，实验发现
人工接种三七黑斑病致病原菌后，不同植株间的抗
病性存在有一定的差异，尽管抗病植株数量很少但
还是存在。这就为三七抗病基因的挖掘、开发利用提
供了可能。
近年来，克隆植物抗性基因的研究引起了愈来
愈多的植物病理学家和育种学家的关注。1992年，
Hm1成为植物中第一个被克隆的 R基因(Gurmu and
Steven, 1992)，随着研究的进步，越来越多植物中的
R基因被成功克隆。依据原理，目前基因克隆方法主
要有以下四种方法，即基于基因产物的克隆方法；基
于基因加标签的克隆方法；基于基因序列的克隆方
法和基于基因图谱的克隆方法。其中，图位克隆(po
sitional cloning, map-based cloning)和转座子标签技
术(transposon tagging)是植物的抗病基因克隆前期研
究工作中最常用的两种技术。如玉米抗圆斑病基因
Hm1 (Gurmu and Steven, 1992)、番茄抗叶霉病基因
Cf-4、Cf-5、Cf-9 (Mark et al., 1996; Clowyn et al.,
1997)、抗花叶病毒基因 Tm-2、烟草抗花叶病毒基因
N (Dinesh et al., 1995)、亚麻抗叶锈基因 L6 (Gregory
et al., 1995)和 M (Peter et al., 1997)等均是利用转座
子标记技术克隆到的抗病基因。利用图位克隆技术
得到大麦(抗白粉病基因 Mlo)、番茄(抗叶霉病基因
Cf-2,抗叶斑病基因 Pto 和 Prf 基因, 抗枯萎病基因
I2 )、拟南芥(抗丁香假单胞杆菌基因 RPS2, RPM1)和
水稻(抗白叶枯病基因 Xa21, Xa1,抗稻瘟病基因 Pib)
的各类抗病基因(Andrew et al.,1994; Dixon et al.,
1995; Song et al., 1995)。然而，转座子标签法需要筛
选并鉴定突变体、工作量较大、插入的位点也具有不
确定性；图位克隆法则要求有高密度的分子标记图
谱，而药用植物中大都存在有遗传背景不清、分子标
记缺失等诸如此类的问题，因此传统方法在药用植
物的抗病基因应用中具有一定的限制性。
从已被克隆 R基因的产物结构来看，这些 R基
因虽针对不同的细菌、真菌、病毒和线虫，但其产物
结构具有着令人惊奇的相似性。而且抗性基因常常
以基因家族(family)的形式出现，不同植物中的同类
基因之间具有着较高的保守性。随着人们对植物抗
病基因研究的越来越成熟，大量的抗性基因被成功
克隆，人们可以更加详细地、准确地掌握抗病基因家
族间的整个进化趋势，同时基因间存在的保守特性
也为开展基于基因序列的克隆工作奠定了良好的基
础。其中，根据克隆策略不同，基于基因序列的克隆
方法又可以分为两种形式：通过分子杂交克隆和通
过 PCR扩增基因法。分子杂交克隆是依据基因序列
同源保守性从一种生物中分离获得的基因用于制作
分子探针，然后从另一种生物的基因组文库中分离
出此生物的同源基因；而 PCR扩增则是通过设计特
异引物，利用 PCR技术直接从生物基因组或 cDNA
中扩增出目的基因。
与此同时，植物寄主与病原相互作用分子机理
的研究也得到了迅速的发展(Keen, 1992)，一些病原
物侵袭生长发育过程中的植物时常使其表现为抗病
或感病，植物在长期的相互作用、相互选择、协同进
化的过程中逐渐获得了一系列复杂的自我保护防御
机制来(Gabrel and Rolfe, 1990)。这些机制包括植物
细胞对病原菌的识别，胞内信号的转换与传导，防卫
反应的开启与系统获得抗性的形成。植物体最终会
表现为产生加固并阻止病原生长的细胞壁成分
(Gabrel and Rolfe, 1990)；合成小分子抑菌物质如植保
素(phytoalexin)和毒性酚类小分子化合物(Hahlbrock
and Scheel, 1989)；诱导并产生各种病程的相关蛋白
(pathogenesis related, PR蛋白)如几丁质酶和葡聚糖酶
等(Dixon and Lamb, 1990)；生成蛋白酶抑制剂；释放
各类活性氧；诱导植产生物内原激素等等一系列复
杂的生化过程。其中，寄主植物细胞与病原菌的识别
属于防御机制建立的首要步骤，此过程将会涉及到
植物与病原之间复杂的信号识别反应。19世纪 90年
代以来，伴随着生命科学和计算机科学的迅猛发展，
生物信息学应运而生。它通过综合利用生物学、计算
机科学和信息技术的优势来揭示大量而复杂的生物
数据所赋予的生物学奥秘。在越来越多的植物基因
组完成了测序的大时代背景下，京都基因与基因组
数据库(KEGG)能够对生物体更高层次和更复杂细
胞生命活动进行完整的演绎和推算。借助于生物信
息学的力量，抗性基因的克隆宣示着进入了一个全
新的时代。
本研究尝试通过使用三七近缘属植物人参、西
625
洋参 EST数据，经序列拼接、基因功能注释、KEGG
作图，最后成功地克隆出三七和屏边三七中部分病
程相关功能基因，这些基因在其他药用植物研究当
中还没有相关报道。
1结果与分析
1.1现有人参和西洋参 EST序列生物信息学分析
截至 2012年 6月 5号，NCBI数据库网站(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/)共收录人参(Panax ginseng) EST
序列 11 412 条、西洋参(Panax quinquefoliusm) EST
序列 5 018条。首先使用 EGassembler工具对这些序
列进行拼接，具体如下：人参当中的 6 158条拼接成
了 1 304条更长的 EST，而另外的 5 254条无法拼成
更长的 EST，因此最后总共得到了 6 558条拼接好的
序列。这些拼接好的序列用 KAAS工具进行 KEGG
注释。6 558个拼接好的序列中 1 536个有 KEGG注
释，分布在 278条 KEGG通路上，其中和代谢相关的
图 1植物-病原互作KEGG图示
Figure 1 KEGG for plant-pahogen interaction
通路有 113 条；西洋参当中的 2 147 条拼接成了
539 条更长的 EST，而另外的 2 871条无法拼成更长
的 EST，因此最后总共得到了 3 410条拼接好的序
列。这些拼接好的序列用 KAAS工具进行 KEGG注
释。3 410个拼接好的序列中 812个有 KEGG注释，
分布在 253条 KEGG通路上，其中和代谢相关的通
路有 101条，具体见图 1。
1.2总 RNA提取及反转录
三七和屏边三七根组织中均含有大量的酚类、
糖类及其它代谢产物，在进行液氮研磨时，其中的
酚类化合物极易被氧化成醌类物质，与 RNA分子
发生不可逆结合，产生褐化效应，干扰了 RNA的提
取过程，最终对 RNA提取的产量和质量均造成很
大的影响。
经过反复摸索，我们认为优化 Trizol法比较适
合两种材料根组织总 RNA的提取，采用该方法能够
获得纯度高、完整性好的总 RNA。如图 2所示，三七
三七及屏边三七病程相关基因克隆的新策略
A New Strategy of Cloning of Resistance Genes in Panax notoginseng and Panax stipuleanatus 626
基因组学与应用生物学
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和屏边三根组织中总 RNA 中具有清晰的 28S 和
18S特征条带，亮度比接近 2:1，说明提取的总 RNA
较为完整，无基因组 DNA污染，无降解，符合后续功
能基因克隆表达的要求。
随后，用所提取的三七和屏边三七总RNA做模板，
进行反转录，反转录产物置于-20℃冰箱保存，备用。
1.3 RT-PCR扩增目的基因
据基因注释结果及病原与植物间互作代谢通路
图基因分布，最终挑选出 9个完整或者相对完整的
病程候选基因。其中 7个候选基因的编码区内具有
完整的开放阅读框(ORF)，而另外的 2个候选基因仅
有起始密码子。使用引物设计软件 primer 5.0对具有
完整开放阅读框的 9 个候选基因分别进行引物设
计，正向引物位于或者包含起始密码子、反向引物位
于或者包含终止密码子。另外 2个相对不完整候选
基因引物设计时，除正向引物包含起始密码子外，反
向引物设计时尽可能靠近 3末端，引物相关详细信
息见表 1。
利用 9对已设计好的病程相关基因引物，分别
以屏边三七和三七反转录合成的 cDNA为模板，做
RT-PCR，具体 PCR扩增结果详见下图 3。从图 3中
可以看出来，9对引物在三七中全部能够扩增出目标
条带。在屏边三七中除了一对引物无法扩增外，其他
均能够得到有效扩增。说明利用人参属植物的基因
相关数据可以进行三七的基因功能研究。
将扩增得到的 PCR产物做 TA克隆，同时以各
个病程相关基因所设计的引物进行菌液 PCR 检测
后，选择阳性菌液送华大基因公司测序，同时保存剩
余菌液。测序结果进行后续生物信息学分析，包括在
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行 BLAST同
源比对、功能预测等。
1.4三七和屏边三七扩增序列的生物信息学分析
将克隆所得到的全长或部分 cDNA 序列用
图 2三七与屏边三七根总 RNA琼脂糖凝胶电泳
注: 1,2:屏边三七; 3,4:三七
Figure 2 Agarose electrophoresis of extraction of total RNA
Note: 1,2: P. notoginseng; 3,4: P. stipuleanatus
图 3九个病程相关候选引物在三七及屏边三七中的 PCR扩
增结果
注: M: DL2000 DNA Marker; PN:三七; PS:屏边三七; 1: cn; 2:
contig27; 3: contig156; 4: contig335; 5: contig534; 6: contig552;
7: contig622; 8: contig829; 9: contig1030
Figure 3 Agarose electrophoresis of product of RT-PCR
Note: M: DL2000 DNA Marker; PN: P. notoginseng; PS: P. stip－
uleanateus; 1: cn; 2: contig27; 3: contig156; 4: contig335; 5: con-
tig534; 6: contig552; 7: contig622; 8: contig829; 9: contig1030
BLAST 程 序 在 Non-redundant GenBan +EMBL +
DDBJ+PDB 和 Non-redundant GenBank CDS transla-
tion+PDB+Swissprot+Superdate +PIR 数据库中进行
核苷酸同源性检索，其结果如下：三七 CN引物克隆
得到的钙调蛋白相关蛋白(calmodulin-related protein)
基因与斑点钝眼蜱 (Amblyomma maculatum)、葡萄
(Vitis vinifera)的钙调蛋白相关蛋白(calmodulin-relat-
ed protein)有 99%的同源性，因此，暂命名为 pnc-1。
三七 contig-27引物克隆所得到的 heat shock protein
基因与野茶树(Camellia sinensis)的热激蛋白 90 (heat
shock protein 90)具有 98%的同源性，因此暂命名为
pnh-1。三七 contig552引物克隆得到的发病原相关
蛋白 1 (pathogenesis-related protein 1)基因与葡萄
(Vitis vinifera)的病程相关蛋白 1有 91%的同源性，
因此暂命名为 pnpr-1。三七 contig-622引物克隆所
得到的钙调蛋白相关蛋白(calmodulin-related protein)
基因与斑点钝眼蜱 (Amblyomma maculatum)、葡萄
(Vitis vinifera)的钙调蛋白相关蛋白(calmodulin-relat-
ed protein)有 96%的同源性，因此，暂命名为 pnc-2；
屏边三七 CN 引物克隆得到的钙调蛋白相关蛋白
(calmodulin-related protein)基因分别与斑点钝眼蜱
(Amblyomma maculatum)、葡萄(Vitis vinifera)的钙调
蛋白相关蛋白(calmodulin-related protein)有 95%和
96%的同源性，因此，暂命名为 psc-1。屏边三七
contig-27引物克隆所得到的热激蛋白 (heat shock
protein)基因与野茶树(Camellia sinensis)的热激蛋白
(heat shock protein) 90具有 98%的同源性，因此暂命
名为 psh-1。屏边三七 contig-335引物克隆得到的钙
调蛋白相关蛋白(calmodulin-related protein)基因与斑
627
表 1病程候选基因引物设计详细信息表
Table 1 The details of primer for R candidate genes
编号
No.
Contig552
Contig1030
Contig829
Contig534
CN845943
Contig622
Contig335
Contig27
Contig156
是否全长
cDNA length
全长
Full length
全长
Full length
全长
Full length
全长
Full length
全长
Full length
全长
Full length
全长
Full length
部分序列
Partial sequence
部分序列
Partial sequence
功能注释
Function annotation
Pathogenesis-related protein 1
Protein TIFY 10A
EF hand family protein
Heat shock protein 90-1
Calmodulin 7
Calmodulin
Calmodulin
Heat shock protein 90
Protein TIFY 10A
来源
Sources
人参
Ginseng
人参
Ginseng
人参
Ginseng
人参
Ginseng
人参
Ginseng
人参
Ginseng
西洋参
Gen-seng
西洋参
Gen-seng
西洋参
Gen-seng
引物设计(5-3)
Primer sequence (5-3)
Contig552-F: CTTCACGAAATGGCATTCAC
Contig552-R: GATTAATTACTTGGATGAAAC
Contig1030-F: CTGGAAAGTATGTCCACCTCG
Contig1030-R: CTATGCCTACAATTCGCTTTC
Contig829-F: ACGGTATCAATGGGGAAAGATC
Contig829-R: CACAATCGCCACAAATCACTT
Contig534-F: ATCGATAATGGCGGATACAGAG
Contig534-R: GTTTACCAAGGACCACTCATGAG
CN-F: GAAGGAATATATGGCGGATC
CN-R: GTAATCACTTGGCCATCATAA
Contig622-F: GATAGATATGGCGGATCAGCTCAC
Contig622-R: GTAATCACTTGGCCATCATAAC
Contig335-F: TAGATATGGCGGATCAGCTCAC
Contig335-R: GTGGAGCTCATCACTTGGCCAT
Contig27-F: GTAATGGCGGATACAGAG
Contig27-R: AGAAGTATCTCTGGTAACTG
Contig156-F: AGTATGTCGAGTTCTTCGGAG
Contig156-R: CTCTTATTGTTCAAATTTCAC
点钝眼蜱(Amblyomma maculatum)、葡萄(Vitis vinifera)
的钙调蛋白相关蛋白(calmodulin-related protein)均有
97%的同源性，因此，暂命名为 psc-2。屏边三七
contig552引物克隆得到的发病原相关蛋白 1 (patho-
genesis-related protein 1)基因与葡萄(Vitis vinifera)的
病程相关蛋白 1 有 80%的同源性，因此暂命名为
pspr-1。屏边三七 contig-622引物克隆所得到的钙调
蛋白相关蛋白(calmodulin-related protein)基因与斑点
钝眼蜱(Amblyomma maculatum)、葡萄 (Vitis vinifera)
的钙调蛋白相关蛋白(calmodulin-related protein)均有
96%的同源性，因此，暂命名为 psc-3。屏边三七
contig829 引物克隆得到的 EF 家族蛋白 (EF hand
family protein)基因与野生马铃薯(Solanum demissum)
的 EF家族蛋白(EF hand family protein)有 91%的同
源性，因此暂命名为 psef-1。
从比对结果来看(表 2)，9对引物所扩增得到的基
因产物全部和预期结果相符，且片段大小也基本相
似。这也从侧面证实了可以利用人参属其他植物基
因组数据开展三七功能基因的相关研究，此方法简
便、可行而且有效。
然而 9个目的基因中，大部分为基因均是一些
基因的表达调控元件，如锌指蛋白、钙调蛋白、热激
蛋白等。这些目的基因产物可能是特异性地参与植
物抗病基因表达调控的复杂网络，引起植物的一系
列的抗性反应。其中，9个目的基因当中有一个为植
物病程相关蛋白(PR1)基因，此蛋白的表达常常作为
植物系统获得性抗性存在的一种标志，其重要程度
不言而喻。三七和屏边三七中均克隆了到此基因，幸
运的是所克隆到的两个 PR1基因均具有完整的开放
阅读框，这为研究该基因的功能奠定了基础。
2讨论
一般来讲，基因克隆的策略可以分为正向遗传
学途径和反向遗传学途径两条途经。正向遗传学途径
是已知待克隆基因功能表现型，通过鉴定其产物或某
种表型的突变的方式进行克隆，常见的有功能克隆
(functional cloning)和表型克隆(phenotype cloning)；而
反向遗传学途径则以基因本身特定序列或者在基因
组中的特定位置为基础进行克隆，如定位克隆(posi-
tional cloning)和序列克隆(sequence cloning)。其中，
功能克隆是较为经典的一种基因克隆策略，其优点
是能分离出纯度较高的单一蛋白质。Inoue等(1996)
利用功能克隆法克隆了闭鞘姜(Costus speciosus)呋甾
烷 26-O-β- 葡糖苷酶基因；Grothe 等(2001)也通过
此法克隆出罂粟(Papazer somniferum) Salutaridinol乙
酰转移酶的全长序列。本研究中分离并纯化得到抗
病蛋白具有一定的难度，因此功能克隆策略并不适
合。前人研究显示，利用表型差异克隆技术可对有明
显差异表型的材料相关基因进行克隆，常用手段有差
异显示技术(DD-PCR) (Liang et al., 1992)、cDNA-AFLP
三七及屏边三七病程相关基因克隆的新策略
A New Strategy of Cloning of Resistance Genes in Panax notoginseng and Panax stipuleanatus 628
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
法(Bachemc et al., 1996)、差减扣除杂交(SSH)法(Di-
atchenko et al., 1996)及微阵列杂交(Chee et al., 1996)
等。相同生境条件下，屏边三七抗性表现明显优于三
七(孙玉琴等, 2009)；同一块地中，三七不同植株间对
黑斑病的抗病表现亦具有明显差异(杨涛等, 2006)，
因此，表型差异克隆策略将会是下一步三七抗病基
因克隆研究的主要方向。
克隆得到植物抗病基因是深入了解植物抗病机
制的基础，也是未来进行植物抗病遗传工程研究中
重要的基因资源，目前已经有 70多个植物抗病基因
从不同植物中被克隆鉴定(李智强等, 2011)。自 1994
年 Boguski等学者首次利用生物信息技术克隆新的
表 2三七及屏边三七扩增序列功能蛋白比对详细信息表
Table 2 The details of protein comparison in P. stipuleanatus and P. notoginseng
编号
No.
Contig552
Contig1030
Contig829
Contig534
CN845943
Contig622
Contig335
Contig27
Contig156
植物材料
Plant material
屏边三七
P. stipuleanatus
三七
P. notoginseng
屏边三七
P. stipuleanatus
三七
P. notoginseng
屏边三七
P. stipuleanatus
三七
P. notoginseng
屏边三七
P. stipuleanatus
三七
P. notoginseng
屏边三七
P. stipuleanatus
三七
P. notoginseng
屏边三七
P. stipuleanatus
三七
P. notoginseng
屏边三七
P. stipuleanatus
三七
P. notoginseng
屏边三七
P. stipuleanatus
三七
P. notoginseng
三七
P. notoginseng
基因功能
Gene function
病程相关蛋白 1
Pathogenesis-related protein 1
蛋白质 TIFY10A
Protein TIFY 10A
EF手家族蛋白
EF hand family protein
热休克蛋白
Heat shock protein
钙调素相关蛋白
Calmodulin-related protein
钙调素相关蛋白
Calmodulin-related protein
钙调素相关蛋白
Calmodulin-related protein
热休克蛋白
Heat shock protein
蛋白质 TIFY 10A
Protein TIFY 10A
同源物种
Congeneric species
葡萄
Vitis vinifera
葡萄
Vitis vinifera
葡萄
Vitis vinifera
葡萄
Vitis vinifera
西红柿
Solanum lycopersicum
西红柿
Solanum lycopersicum
巴旦木
Prunus persica
巴旦木
Prunus persica
斑点钝眼蜱
Amblyomma maculatum
葡萄
Vitis vinifera
斑点钝眼蜱
Amblyomma maculatum
葡萄
Vitis vinifera
葡萄
Vitis vinifera
葡萄
Vitis vinifera
野茶树
Camellia sinensis
野茶树
Camellia sinensis
葡萄
Vitis vinifera
同源性(%)
Identity (%)
80
91
57
57
91
93
96
96
95
99
96
96
97
97
98
98
53
基因开始，伴随着基因组计划和 EST计划的实施，人
们借助于电子计算机的巨大运算能力，通过 EST或基
因组的序列组装和拼接，越来越多的新基因利用
RT-PCR的方法被克隆得到(李鑫等, 2004)。例如，水
稻中的耐盐胁迫锌指蛋白基因 OsZFP、胞质核糖体蛋
白基因 OsRPS7、小 GTP蛋白基因 Osrab5B和葡萄糖
-6-磷酸脱氢酶基因OsG6PDH等基因的克隆均是通
过电子克隆方法得到(黄骥等, 2002; Habermann et al.,
2004;王东东等, 2006)。随着生物信息学的发展和许
多药用植物全基因组测序计划的实施，电子克隆技术
将在药用植物基因功能研究领域扮演着重要作用。
与传统基因克隆技术相比，电子克隆优势主要
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表现在以下几个方面：(1)基因克隆快速：同源性比较、
序列拼接组装等工作可以在计算机上迅速完成，然
后随即进行 RT-PCR验证。(2)成本低：电子克隆技术
绝大部分工作在计算机上完成，只需配备普通 PCR
仪等设备就可以开展工作。(3)针对性强：借助于计算
机的分析，人们对所克隆基因功能、核酸组成等所有
性状大都比较明确，因此在开展基因克隆或者基因
工程应用时具有较强的目的性。从本文研究来看，我
们利用 EST数据库相对丰富的三七近缘属植物人参
和西洋参，通过对这些序列进行拼接和功能注释，然
后在 KEGG平台上进行梳理，专门挑选那些参与植
物抗病免疫代谢途径的编码基因，最后在三七及屏
边三七中进行 RT-PCR实验验证。结果发现，绝大多
数基因均能在三七和屏边三七上得到有效扩增，且
片段大小和预测目的基因大小基本相似。例如三七
和屏边三七植物病程相关蛋白 PR-1基因核酸序列
与最初拼接而成的 contig人参病程相关蛋白序列同
源性达到为 98%和 96.4%，其中病程相关蛋白 1的
功能结构 SCP保守域在三七、屏边三七和拼接而成
的人参当中结构组成完全一致。由于植物抗病基因
大都属于进化上比较保守的基因，同一基因在不同
植物中或者某个植物中的同一基因家族均存在有很
强的保守性，这可能是电子克隆技术能够成功的根
本原因。因此，电子克隆技术对那些种间保守性差的
基因和外显子数目多而且短的基因不适用，这是该
技术所存在的弊端之一(万海伟, 2004)。另外，电子克
隆技术主要依靠电脑和网络资源，对于那些植物数
据库资料缺乏或者资料不完整的植物，获得 cDNA
全序列的概率小而且难度大，这也限制了该技术的
普遍性应用。
随着许多药用植物 EST计划与基因组计划的开
展和相关数据库的发布，电子克隆技术将在药用植
物相关基因研究中做出巨大的贡献。此外，电子克隆
能够起到大大加速植物基因结构、功能研究的进程，
推动比较基因组学的发展和植物基因的进化、起源、
发育方面的研究(Bikram, 2004)。通过电子克隆获得
新基因，经序列分析和功能验证，确定为基因功能，
将为功能基因组学与蛋白质组学研究提供新的线索
和基础。屏边三七在抗病性状表现上优于三七，从本
文研究结果来看，9个病程相关基因核酸序列三七与
屏边三七的同源性范围在 83%~98%之间，至于这种
抗性差异与基因序列差异有无相关性，仍需进一步
的实验数据支持，同时这也将会成为我们课题组下
一步的研究方向。综上所述，电子克隆技术以其自身
独具的优势能够在很多规模较小的实验室均可以得
到应用，此外还可利用该技术在基因水平上研究某
些复杂事件或途径的机制。因此，我们有理由相信，
随着基因组序列信息的日益丰富以及计算方法和数
据库的不断完善，电子克隆技术将在药用植物基因
全长 cDNA克隆和分析中发挥更加重要的作用。
3材料与方法
3.1实验材料
三七(P. notoginseng)及屏边三七(P. stipuleanatus)
全株均采自云南省农业科学院药用植物研究所，经
昆明理工大学崔秀明研究员鉴定确认。样品采集后
用清水冲洗 3~5次，然后用吸水纸吸去水分后立即
置于液氮中速冻，提取 RNA直接使用或-80℃冰箱
保存备用。
Trizol试剂购自 Invitrogen生物技术有限公司；
分子质量标准 DL2000、克隆载体 pGEM-T Easy、反
转录试剂盒、DNA Taq聚合酶、T4 DNA连接酶、大肠
杆菌菌株 DH5α均购自于 TaKaRa 公司；DNA胶回
收试剂盒以及质粒回收试剂盒购于上海生工有限公
司；卡那霉素、β-巯基乙醇、等化学试剂购于 Sigma
公司；其它生化试剂均为国产分析纯。
3.2总 RNA的提取及反转录
三七及屏边三七总 RNA提取使用 Trizol 优化
方法。具体操作：从-80℃冰箱中取出 200 mg根组
织，放入研钵中充分研磨至粉末状，立刻转移至装有
1 mL Trizol RNA提取溶液的 1.5 mL离心管中，涡旋
混匀，室温放置 10 min 使其组织充分裂解；4℃、
12 000 r/ min离心 10 min，弃沉淀，收集上清液至新
的离心管中；加入 200 μL氯仿:异戊醇(24: 1)、15 μL
β-巯基乙醇、1% PVP 10 μL，旋涡混匀，冰浴 10 min；
4℃、12 000 r/ min离心 15 min，收集上层上清液至新
的离心管中；加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，
-20℃静置沉淀 1 h；4℃、12 000 r/ min 离心 10 min，
弃上清液；用 1 mL 的 75%乙醇洗涤沉淀；4℃、
12 000 r/min离心 5 min，弃上清液，空气干燥沉淀
10 min，加入 20 μL经 DEPC处理的去离子水溶解
RNA，-80℃保存备用。RNA完整性通过 1%琼脂糖
凝胶电泳进行检测，其浓度采用 Quawell Q3000微量
核酸蛋白测定仪测定，-80℃冰箱保存备用。以提取
的 RNA为模板，以 Oligo(dT)18为反转录引物，按照
TaKaRa 公司的 Prime ScriptTM RT Reagent 试剂盒说
明书操作。
三七及屏边三七病程相关基因克隆的新策略
A New Strategy of Cloning of Resistance Genes in Panax notoginseng and Panax stipuleanatus 630
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
3.3抗病基因编码蛋白的生物信息学分析
以反转录的 cDNA为模板进行相关基因的 PCR
扩增，将回收的特异性扩增片段克隆到 pGEM-T
Easy载体中，挑取阳性克隆进行序列分析。
利用 NCBI数据库搜索相关植物蛋白及其编码
基因，并在保守结构域数据库(CDD)中进行序列比
对；通过 www.ExPASy.ProtParamtool.htm在线分析
各个基因编码氨基酸大小及其等电点，同时亦可利
用 DNAMAN、BioEdit 等生物学软件预测其可能的
信号肽区域和跨膜区域，限于篇幅原因本文未进行
各种后续分析。
作者贡献
通讯作者崔秀明和黄璐琦负责实验指导及论文
修改；李瑞博负责实验具体实施和论文撰写；申业负
责引物设计工作和部分数据分析；文国松参与部分
实验并提出建议；其他作者均参与了本实验的具体
实施工作；全体作者均已阅读并同意提交本稿。
致谢
感谢国家自然基金项目(81360617, 81130070,
81173490)和云南省应用基础研究计划项目(2013FA-
031)对本研究的资助。
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