全 文 ：香草兰生防细菌的筛选、 分子鉴定
及其抑菌机制的初步研究①
高圣风 1,2)②刘爱勤 1,2)③桑利伟 1,2)孙世伟 1,2)苟亚峰 1,2)
(1 中国热带农业科学院香料饮料研究所 海南万宁 571533
2 海南省热带香辛饮料作物遗传改良与品质调控重点实验室 海南万宁 571533)
摘 要 通过平板对峙法从香草兰根际微生物中筛选出对香草兰根(茎)腐病菌(Fusarium oxysporum)、 香草兰疫
病菌(Phytophthora nicotianae)和香草兰细菌性软腐病菌(Erwinia carotovora)均有良好抑制效果的生防菌 10株。 通
过 16S rDNA序列比对及系统发育树分析， 其中 7株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus. amyloliquefaciens)， 2株为枯草
芽孢杆菌(B. subtils)， 1株为甲基营养型芽孢杆菌(B. methylotrophicus)。 提取脂肽类化合物进行抑菌分析， 发现
10株生防菌脂肽类提取物对香草兰根(茎)腐病菌和香草兰疫病菌均有良好的抑制效果， 有 4株的脂肽类粗提物
对香草兰细菌性软腐病菌有强烈的抑制活性。 对其中2个菌株脂肽类粗提物进行 MALDI-TOF/TOF-MS检测， 发现
菌株 VX2R11产生表面活性素(Surfactin)和伊枯草素 A(IturinA)2种脂肽类化合物， 菌株 VX2S02仅产生伊枯
草素 A， 推测产生伊枯草素 A是菌株 VX2R11和 VX2S02拮抗香草兰根(茎)腐病菌和疫病菌重要机制； 产生表面
活性素是菌株 VX2R11拮抗香草兰细菌性软腐病菌的重要机制。
关键词 香草兰 ； 芽孢杆菌 ； 16S rDNA鉴定 ； 脂肽类化合物
分类号 S435.73Doi： 10.12008/j.issn.1009-2196.2016.01.009
Screening and Identification of Bio-control Bacteria Strains
from Rhizosphere of Vanilla and the Analysis of
the Isolates Lipopeptide Compounds
GAO Shengfeng1,2) LIU Aiqin1,2) SANG Liwei1,2) SUN Shiwei1,2) GOU Yafeng1,2)
(1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China
2 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation
for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China)
Abstract Ten bio-control Bacillus strains were selected via dual culture method from the isolates
obtained from vanilla rhizosphere of Wanning city and Qionghai city in Hainan province. The selected
isolates were highly antagonistic against vanilla pathogens： Fusarium oxysporum， Phytophthora nicotianae
and Erwinia carotovora. Seven B. amyloliquefaciens strains, two B. subtils strains and one B.
methylotrophicus strain were identified by the assays of 16S rDNA sequence and the phylogenefic tree.
Lipopeptide compound analysis via dual culture method showed that all 10 lipopeptide extractions from
each bio-control strain exhibited highly antagonistic against F. oxysporum and P. nicotianae, while 4
lipopeptide extractions were highly antagonistic against E. carotovora. Lipopeptide compound analysis via
MALDI-TOF/TOF -MS showed that strain VX2R11 produced Surfactin and IturinA， while strain
VX2S02 produced Iturin A, suggesting that strainVX2R11and VX2S02 might via the production of IturinA
to antagonize pathogens F. oxysporum and P. nicotianae, while strainVX2R11 might via the production of
Surfactin to antagonize pathogen E. carotovora.
Vol．36, No．1
2016年1月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第36卷第1期
Jan． 2016
① 海南省自然科学基金项目(No.314136)。
收稿日期： 2015-10-28； 责任编辑/叶庆亮； 编辑部 E-mail: rdnk@163.com。
② 高圣风(1982～)， 男， 助理研究员， 博士， 主要从事香料饮料作物主要病害生物防控， E-mail: gsfkl@163.com。
③ 通讯作者： 刘爱勤(1966～)， 女， 研究员， 主要从事热带特色香料饮料作物病虫害防控， E-mail: Laq3680@163.com。
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2016年1月 第36卷第1期热带农业科学
香草兰[Vanilla fragrans(salisb.)Ames(V.planifo-
lia)]是一种经济附加值极高的热带经济作物， 素有
“食品香料之王” 的称誉。 香草兰根(茎)腐病是一
种危害极大的土传病害， 其病原物是尖孢镰刀菌
(Fusarium. oxysporum)[1]。 镰刀菌土传病害是世界
性防治难题， 其化学防治成本高、 风险大； 而且香
草兰栽培品种极其单一， 没有抗性品种， 目前对该
病害严重缺乏简单有效的防治手段。 近年来， 香草
兰根(茎)腐病已在我国香草兰种植区爆发流行， 造
成很多香草兰种植园荒废， 严重阻碍了香草兰产业
的发展[2]。 同时， 香草兰疫病和香草兰细菌性软腐
病也是香草兰上重要病害， 其病原物分别为烟草疫
霉(Phytophthora nicotianae)和胡萝卜欧文氏杆菌
(Erwinia carotovora)， 每种病害每年给香草兰产业
造成约 15%～30%的损失， 也是香草兰生产上的重
要问题。
生物防治技术日益兴起， 其防治谱广和对环境
友好的特点使其成为当前的研究热点之一。 目前，
国内外已经开始利用生防菌防治香草兰病害的探
索。 Ramalingam等[3]发现荧光假单胞(Fluorescent
pseudomonads)等生防菌株在温室和田间均能够显
著降低香草兰根(茎)腐病的严重度 。 Radjacom-
marea等[4]发现 17株木霉(Trichodema)对包括香草
兰根(茎)腐病菌有抑制活性， 其中2株木霉菌与荧
光假单胞菌和壳多糖相结合获得了良好的大田防病
效果。 曾会才等[5]发现枯草芽孢杆菌(Bacillus sub-
tilis)OBS-2菌株在盆栽和大田试验上对香草兰根
(茎)腐病和香草兰疫病具有良好的防治效果。 李霞
等[6]在对搜集到的9株木霉、 枯草芽孢杆菌和荧光
假单孢菌进行了平板抑制活性分析。
迄今为止， 国内外对香草兰生防菌筛选和应用
的报道极少， 对香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病
的报道几乎空白。 已报道的生防菌株也多为分离自
其他作物的外源菌株， 鲜有来自香草兰生境的天然
生防菌。 这些香草兰生防菌的生防机制也尚未见报
道。 本研究以香草兰上主要病害香草兰根(茎)腐
病、 香草兰疫病和香草兰软腐病菌为靶标， 对香草
兰根际生防细菌开展了筛选、 鉴定及作用机理分析
等工作， 为进一步研究香草兰重要病害的绿色高效
防控提供基础。
1 材料和方法
1.1材料
1.1.1培养基
本研究中平板对峙培养所用培养基为马铃薯葡
萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar， PDA)， 细菌培
养所用培养基为Luria-Bertani(LB)培养基； 生防
菌发酵所用培养基为Landy培养基[7]。
1.1.2菌株
本研究所用 3种病原菌香草兰根(茎)腐病菌、
香草兰疫病菌和香草兰细菌性软腐病菌均来自中国
热带农业科学院香料饮料研究所。
1.1.3试剂和引物合成
本研究基因组的提取和PCR扩增均使用天根生
化科技(北京)有限公司 “快速 DNA提取扩增套装”
试剂盒完成； PCR片段纯化均采用天根生化科技(北
京)有限公司 “琼脂糖凝胶回收试剂盒” 完成； PCR
引物的合成均在深圳华大基因科技服务有限公司完
成； 其他试剂如氯化钠、 磷酸二氢钾、 七水硫酸镁、
氯化钾、 L-苯丙氨酸、 硫酸锰、 五水硫酸铜、 七水
硫酸亚铁等均为分析纯。 PCR所用引物为细菌 16S
rDNA通用引物 27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)
和1492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT- 3′)[7]。
1.2方法
1.2.1生防菌筛选
采用平板对峙培养法进行生防菌筛选。 将香草
兰根(茎)腐病和香草兰疫病的病原菌在 PDA平板上
活化后打成直径 0.5cm的圆形菌丝块， 然后将菌
丝块接种在新平板中央并在四周接种活化后的香草
兰根际细菌。 将浓度为109cfu/mL的香草兰细菌性
软腐病菌以 2%比例加入到冷却至约 50℃的 PDA培
养基中， 摇匀后倒平板； 然后将浓度为109cfu/mL
的香草兰根际细菌液 5μL接种在含菌平板上。 所
有平板均放置在 28℃恒温培养箱中培养， 5～7 d
后测量抑菌圈直径。
1.2.2生防菌 16S rDNA 序列分析鉴定
Keywords Vanilla fragrans ; Bacillus spp ; 16S rDNA sequence ; lipopeptide
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高圣风 等 香草兰生防细菌的筛选、 分子鉴定及其抑菌机制的初步研究
图1 生防菌对香草兰根(茎)腐病菌(左上)、 香草兰疫
病菌(右上)和香草兰细菌性软腐病菌(下)的抑菌活性检测
表1 香草兰根际生防菌16S rDNA GenBank登录号及其抑菌活性
菌株
16S rDNA
GenBank
登录号
抑制香草兰根
(茎)腐病菌活性
抑制香草兰疫病
病菌活性
抑制细菌软腐
病菌活性
菌体 菌体 菌体 脂肽类粗提物
VD18R19 KT026052 ++++ ++++ +++ ++++
VD18S15 KT026051 ++++ ++++ +++ ++++
VD18S27 KT008123 ++++ +++ +++ -
VD21R27 KT026058 ++++ ++++ ++ -
VX1R02 KT026059 +++ ++++ ++ -
VX1S06 KT026053 ++++ ++++ +++ ++++
VX2R11 KT026054 +++ ++++ +++ ++++
VX2S02 KT026055 +++ ++++ ++ -
VX4S09 KT026056 +++ ++++ +++ -
VX4S18 KT026057 ++++ ++++ +++ -
脂肽类粗提物 脂肽类粗提物
++++ ++++
++++ ++++
++++ +++
++++ ++++
++++ ++++
++ +++
++++ +++
++++ +++
++++ ++++
++ ++
说明： -： 抑菌圈直径 0 mm； ++： 抑菌圈直径 10～15 mm； +++： 抑菌圈直径 15～20 mm；
++++： 抑菌圈直径＞20mm。
生防菌提取基因组DNA后， 采用细菌16S rDNA
通用引物进行16S序列扩增[7]。 PCR产物经1%琼脂
糖凝胶电泳分离后通过紫外凝胶成像仪检测并切胶
回收， 回收产物送到深圳华大基因科技服务有限公
司测序。 测序结果在 NCBI网站的基本局部比对搜
索工具(The Basic Local Alignment Search Tool, BLAST)进
行序列比对分析。
将本研究获得的生防菌 16S rDNA序列上传到
GenBank， 下载近源菌株的16S rDNA序列用于系统
发育树的构建。 用 Clustal X 2.1和 MEGA6.06软
件进行系统发育树构建[7]。
1.2.3脂肽类化合物分析
将待测菌株接种在LB培养基中200r/min37℃
条件下培养12h； 然后以3%比例转接入50mLlandy
培 养 基 ， 在 200 r/min
30℃条件下发酵40h； 用
酸沉淀法[8]提取脂肽类
化合物， 粗提物浓缩至3
mL后经 0.22μm孔径滤
膜过滤后备用。 采用平板
对峙培养法检测各菌株脂
肽类粗提物的抑菌活性，
方法见本研究 “1.2.1生
防菌筛选”， 仅将 “接种
生防菌 ” 更换为 “滴加
10μL脂肽类粗提物”。 通
过 AB SCIEX 5800 MAL-
DI-TOF/TOF-MS仪器进行
飞行时间质谱检测， 根据质谱结果初步判断物质种
类[9-10]。
2 结果与分析
2.1生防菌筛选
通过平板对峙培养法从香草兰根际细菌中筛选
到对香草兰根(茎)腐病菌、 香草兰疫病菌和香草兰
细菌性软腐病菌3种病原菌均有良好抑菌效果的菌
株 10株； 对香草兰根(茎)腐病菌和香草兰疫病菌
的抑菌圈平均直径均＞15mm， 对香草兰细菌性软
腐病菌的抑菌圈平均直径均＞10mm(图1、 表1)。
2.2香草兰根际生防菌鉴定
以生防菌 DNA为模板扩增 16S rDNA片段， 获
得大小约 1.5kb的 PCR片段， 将测序结果在 NCBI
网站通过 BLAST软件与 GenBank中己知序列进行
比对分析。 结果表明： GenBank中与 10株生防菌
16S序列同源性最高的菌株均为芽孢杆菌属菌株；
其中菌株 VD18S15与甲基营养型芽孢杆菌 HB26的
16S rDNA的序列同源性为 99%， 菌株 VD18R19和
VX1R02与枯草芽孢杆菌 168的 16S rDNA的序列
同源性均为 100%， 菌株 VD18S27与解淀粉芽孢杆
菌 D15的 16S rDNA的序列同源性为 100%， 菌株
VD21R27和 VX1S06与解淀粉芽孢杆菌 D12的 16S
rDNA的序列同源性均为 100%， 菌株 VX2R11和
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2016年1月 第36卷第1期热带农业科学
图3 生防菌脂肽类粗提物对香草兰根(茎)
腐病菌(左上)、 香草兰疫病菌(右上)和
香草兰细菌性软腐病菌(下)的抑菌活性检测
VX2S02与解淀粉芽孢杆菌的 16SrDNA序列同源性
均为 100%， 菌株 VX4S09和 VX4S18与解淀粉芽孢
杆菌SQR-7的16SrDNA序列同源性均为100%。
以1株荧光假单胞菌株WCS365(登陆号： KP253039)
为外群， 以枯草芽孢杆菌168(登陆号： KP318826)、 甲
基营养型芽孢杆菌 HB26(登陆号： KM659227)和解淀粉
芽孢杆菌SQR-7(登陆号： KC888017)为参照， 构建系统
发育树(图2)。 结果发现： 10株生防菌被聚类为3
个分支 ； 其 中 菌 株 VX4S09、 VX2S02、 VX4S18、
VD18S27、 VD21R27、 VX2R11、 VX1S06与解淀粉芽
孢杆菌SQR-7聚类在同一分支， 菌株VD18S15与甲
基营养型芽孢杆菌 HB26被聚类在相同分枝， 菌株
VD18R19和 VX1R02与枯草芽孢杆菌 168被聚类在
同一分支。
2.3脂肽类化合物分析
10株生防菌发酵后均能成功得到脂肽类粗提
物。 所有的脂肽类粗提物对病原真菌 F. oxysporum
VFO62和病原细菌 P. nicotianae VPN01的抑菌圈平
均直径均＞15mm， 大部分粗提物的抑菌圈平均直
径达 20mm以上(表 1、 图 3)。 说明脂肽类化合物
在这 10株生防芽孢杆菌的抑制真菌机制和抑制卵
菌机制中均起重要作用。 但是对病原细菌 E. caro-
tovoraVEC03的抑菌效果呈现两极分化， 出现强烈
抑菌和完全不抑菌两组(表 1、 图 3)： VD18R19、
VD18S15、 VX1S06、 VX2R11等 4个菌株的抑菌圈平
均直径均 ＞20mm； 其他 6个菌株检测不到抑菌效
果。 该结果表明， 脂肽类化合物在菌株 VD18R19、
VD18S15、 VX1S06和 VX2R11的抑制细菌机制中起
重要作用； 同时推测， 其他6株生防菌可能产生其
他种类的抑细菌物质。
从生防菌脂肽类粗提物中选取对真菌、 卵菌和
细菌均有良好抑制效果的VX2R11以及仅对真菌和卵
菌抑制效果良好的 VX2S02进行 MALDI-TOF/TOF-MS
检测。 检测图谱显示(图4)， 菌株VX2R11在m/z值
为1030.6310， 1 044.621 9， 1 058.660 9处有离
子峰的出现， 这3个离子峰对应于表面活性素的分
子质量[9]； 在m/z值为1065.5341， 1079.5466，
1093.5621， 1109.5358处有离子峰的出现， 这
4个离子峰对应于伊枯草素 A的分子质量[10]。 菌
株 VX2S02在 m/z值为 1065.5040， 1079.5154，
1093.5331， 1109.5054处有离子峰的出现， 这4
个离子峰对应于伊枯草素 A的分子质量[10]。 MAL-
DI-TOF/TOF-MS质谱分析结果表明， 菌株 VX2R11
产生脂肽类化合物表面活性素和伊枯草素 A， 菌株
VX2S02仅产伊枯草素A。
3 讨论与结论
香草兰通常种植于温暖、 潮湿、 荫蔽的环境中，
该环境适于病原菌孳生， 极易产生病害。 本研究从
香草兰根际筛选生防菌， 希望利用香草兰生境中天
然的生防菌来抑制病原菌数量达到防病的目的。 本
研究以香草兰上3种重要的病害为靶标进行抑菌筛
图2 基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树
KT026056(VX4S09)
KT026055(VX2S02)
KT026057(VX4S18)
KC888017(B. amyloliquefaciens SQR-7)
KT026058(VD18R27)
KT026059(VD21R27)
KT026054(VX2R11)
KT026053(VX1S06)
KM659227(B. methylotrophicus HB26)
KT026052(VD18S15)
KT026052(VD18R19)
KP318826(B. subtilis 168)
KT008123(VX1R02)
KP253039(P. fluorescens WCS365)
0.11
0.11
0.01
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高圣风 等 香草兰生防细菌的筛选、 分子鉴定及其抑菌机制的初步研究
选， 得到了广谱生防菌10株。 经过16SrDNA序列
鉴定和系统发育树分析， 发现 10株生防菌均为芽
孢杆菌属菌株， 包含解淀粉芽孢杆菌7株、 枯草芽
孢杆菌2株和甲基营养型芽孢杆菌1株。 芽孢杆菌
类生防菌广泛分布于各种自然环境中， 容易进行人
工培养， 可以产生芽孢抵抗紫外线、 干旱、 高温、
低温等逆境， 耐贮藏和运输， 使芽孢杆菌类生防菌
在开发和应用上更具优势。
当前国内外对香草兰生防菌的研究多在应用层
面， 对其生防机制知之甚少。 脂肽类化合物是芽孢
杆菌产生的最主要的抑菌物质[11-14]， 其分子量一般
在 900～2000[15]。 本研究通过生防菌脂肽类化合物
分析来探讨其生防机制。 采用酸沉淀法提取生防菌
脂肽类化合物进行抑菌分析， 结果发现， 10株生防
菌脂肽类粗提物对病原真菌和卵菌有良好的抑菌效
果， 4个菌株的脂肽类粗提物对病原细菌抑制效果
良好。 该结果说明， 脂肽类化合物在生防菌抑制香
草兰病原真菌、 卵菌和细菌过程中起重要作用。
为了进一步分析香草兰生防菌的生防机制， 本
研究选出2个菌株， 脂肽类粗提物对3种病原菌均
有良好抑制活性的 VX2R11菌株以及仅抑制 2种病
原菌的 VX2S02菌株进行 MALDI-TOF/TOF-MS检测，
发现菌株 VX2R11产生表面活性素和伊枯草素 A两
种脂肽类化合物， 菌株 VX2S02仅产生伊枯草素A。
前人研究表明， 芽孢杆菌产生的脂肽类化合物中，
表面活性素对细菌和病毒有良好的抑制活性[12,16]，
伊枯草素A对真菌和卵菌具有强烈的抑制活性[14-15]，
与本研究结果相符 。 由此推断 ， 菌株 VX2R11及
VX2S02对香草兰根(茎)腐病菌和香草兰疫病菌的拮
抗效果可能通过产生伊枯草素 A实现 ； 菌株
VX2R11对香草兰细菌性软腐病菌的拮抗效果可能
通过产生表面活性素实现； 菌株 VX2S02对病原细
菌的拮抗效果可能来自于菌株产生的非脂肽类物
质， 其物质种类还有待于进一步研究。
本研究从拮抗物质的角度初步探讨了香草兰根
际生防菌的生防机制。 此外， 还可能存在竞争、 诱
导寄主植物抗性等生防机制， 需要更多的深入研
究。 虽然生防菌的应用目前尚不成熟， 但是生防芽
孢杆菌自身的天然、 环境友好、 易培养、 耐贮藏、
广谱等特性赋予其广阔的应用前景。
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图4 菌株VX2R11(左)和VX2S02(右)的MALDI-TOF-MS检测结果
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