全 文 ：红足蒿提取物抑菌活性的筛选
戴小阳1，谢 勉1，李 霞2，董新荣2* ，莫俊锐2，周宝磊2
(1．湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128;2．湖南农业大学理学院，湖南长沙 410128)
摘要 ［目的］研究湖南红足蒿枝叶乙醇提取物的抑菌作用。［方法］将红足蒿枝叶的乙醇提取物以不同溶剂萃取，分离得到石油醚萃
取物、乙酸乙酯萃取物和水溶液 3个部分，然后采用高效液相(HPLC)指纹图谱对几个部分的物质进行定性分析，并采用牛津杯法研究
各提取物对大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌活性。［结果］乙
醇提取物对大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的抑菌效果明显;乙酸乙酯萃取物对 3 种试验菌的抑菌效果较
好;石油醚萃取物和水溶液对 3种试验菌均无明显的抑菌效果。［结论］红足蒿抑菌活性主要成分为中极性化合物群，但水溶性极性成
分具有增效作用。
关键词 红足蒿(Artemisia rubripes Nakai);化学成分;抑菌;大肠杆菌;枯草芽孢杆菌;金黄色葡萄球菌
中图分类号 S567;R284 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)10 －05886 －05
The Screening of the Bacteriostatic Activities of Artemisia rubripes Nakai Extractives
DAI Xiao-yang et al (College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128)
Abstract ［Objective］The aim was to study the bacteriostasis of the ethanol extracts from Hunan A． rubripes branches and leaves． ［Meth-
ods］The ethanol extractives were extracted and separated from A． rubripes branches and leaves by different solvents，and petroleum ether ex-
tracts，ethyl acetate extracts and aqueous solution were obtained． Then，each fraction was analyzed qualitatively using HPLC，and their bacte-
riostatic activities on Escherichia coli，Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus were studied using Oxford cup method． ［Result］The bacteri-
ostatic effects of the ethanol extracts on E． coli and B． subtilis were obvious，and the bacteriostatic effects of the ethyl acetate extracts on the
above three test organisms were better;however，petroleum ether extracts and aqueous solution had no obvious bacteriostatic effect on the a-
bove three test organisms． ［Conclusion］The major antibacterium active constituents in A． rubripes were the semi-polar compounds，but polar
compounds in water solution had synergetic effect for these antibacterium activities．
Key words Artemisia rubripes Nakai;Chemical constituents;Antiseptic activity;Escherichia coli;Bacillus subtilis;Staphylococcus aureus
基金项目 湖南省科技厅资助项目:湖南红足蒿化学成分研究与生物
活性筛选(2011FJ6054)。
作者简介 戴小阳(1960 －) ，男，湖南邵阳人，副教授，从事生物化学与
植物资源的教学与研究工作，E-mail:dxy200708@ 163． com。
* 通讯作者，教授，博士，从事有机化学、天然药物化学的研
究与教学工作，E-mail:xinrong108@ yahoo． com． cn。
收稿日期 2011-12-26
红足蒿(Artemisia rubripes Nakai)为菊科(Asteraceae)蒿
属(Artemisia)植物，分布于东北、华北及山东、江苏、安徽、浙
江、江西和福建等地，与《中国药典》收载的艾(Artemisia argyi
Levl． et Vant．)及重要天然药物黄花蒿(Artemisia annua L．)
为同属植物［1］。其叶在分布地区亦作“艾叶”入药［2 －3］。20
世纪 80年代初，Koshihara 等报道中国红足蒿所含成分具有
选择性抑制脂肪氧合酶的作用［4］。Lao等从我国江苏海门县
产红足蒿全草中分离得到黄酮类、三萜类等 10 个化合物［5］。
蒿属植物为朝鲜民族的传统草药，临床用于治疗胃痛、呕吐、
腹泻和止血等症状。2004 年 Lee 等从产自韩国的红足蒿地
上部分分离得到几个倍半萜类化合物［6］。最近，该研究小组
对湖南产红足蒿嫩叶的资源进行了初步研究。结果表明，红
足蒿嫩叶乙醇提取物含有丰富的化合物信息［7］。湖南红足
蒿野生资源十分丰富，民间为药食两用植物。
HPLC指纹图谱技术具有分离效率高、分析速度快、检测
灵敏度高，方法重现性好的特点，近年来，在中药材及新药质
量控制上得到研究与应用［15］。1983年报道从江苏海门县产
红足蒿全草的乙醇提取物中用硅胶柱色谱法分离得到 10个
化合物，包括黄酮类以及一些结构新颖的三萜化合物［5］。
2004年报道从朝鲜产红足蒿的二氯甲烷提取物中用硅胶柱
色谱法分离得到 5 个化合物，包括三个倍半萜、一个香豆素
化合物和一个倍半萜烯内酯化合物［6］。最近，研究小组对湖
南产红足蒿嫩叶的资源进行了初步研究。结果表明，红足蒿
嫩叶乙醇提取物含有丰富的化合物信息［7］。为了全面了解
湖南产红足蒿枝叶中的化学成分，试验首先用乙醇提取物进
行了 HPLC分析的条件研究，对 HPLC分析中的流动相、流速
等色谱条件进行了优化，得到了优化的色谱条件，各成分分
离较好;最后对试验所得各部分的化合物进行了 HPLC指纹
图谱定性分析，以期为其进一步开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。野生红足蒿枝叶，于 2009年 9 月下旬采
摘于湖南农业大学校园内，经鉴定为 Artemisia rubripes Nakai。
1． 1． 2 主要仪器。SW － CJ －1B超净工作台，购自苏州净
化设备有限公司;303S －0型电热恒温培养箱，购自上海康路
仪器设备有限公司;TomYSs325 全自动高压灭菌锅，购自日
本公司制造;PL303电子天平，购自上海梅特勒 －托利多公
司;Agilent 1200型高效液相色谱仪，购自安捷伦科技有限公
司;3300 ELSD 蒸发光散射检测仪，购自埃文森科技有限
公司。
1． 1． 3 主要试剂。HPLC 分析用的色谱甲醇，购自天津市
大茂化学试剂厂;牛肉膏，蛋白胨，琼脂，均为生化试剂;其他
均为分析纯试剂，市售;水为二次蒸馏水。
1． 1． 4 试验菌种。大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢
杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus au-
reus)3种供试菌种，均由湖南农业大学生物工程系提供。
责任编辑 石金友 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(10):5886 － 5890
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.10.171
1． 2 方法
1． 2． 1 细菌培养基制备。牛肉膏蛋白胨培养基［8］。取搪瓷
杯加适量水，依次加入 10． 0 g蛋白胨、5． 0 g牛肉膏、5． 0 g氯
化钠，再加入 20． 0 g琼脂，加热溶解，待药品完全溶解后，再
补充水到 1 000 ml，调整 pH 7． 2，然后分装到 250 ml锥形瓶
中，每瓶 150 ml左右，于 121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min，待用。
1． 2． 2 含菌液与含菌平板的制备。把已活化的斜面菌种，
用 5 ml的移液枪吸取 5． 0 ml 上述无菌生理盐水，加入斜面
试管中，盖紧塞子，用手轻轻摇动试管，将供试菌种混匀，制
成高浓度的菌悬液，待试验备用［9］。将已灭菌的培养基倒入
9 cm无菌培养皿中，每培养皿 20 ml，水平放置，使培养基平
铺;待每个平皿中培养基都冷却凝固后，用无菌移液枪吸取
上述各种菌悬液 100 μl注入平皿，再用无菌的涂布棒迅速将
上述菌液涂抹均匀，制成含菌平板［10］。
1． 2． 3 红足蒿乙醇提取物的制备。将红足蒿枝叶阴干，
粉碎。
1． 2． 3． 1 石油醚脱脂。称取 150． 00 g 红足蒿粉末，先以
750 ml石油醚回流提取 2． 5 h，固液分离后，收集石油醚提取
液，残渣再用 600 ml石油醚分 2 次回流提取，每次 2 h，固液
分离后，合并提取液，减压回收溶剂，得石油醚提取物(I)。
1． 2． 3． 2 乙醇提取物制备。将石油醚脱脂后的残渣挥去石
油醚，称取 100． 00 g残渣，用 600 ml浓度 70%的乙醇回流提
取 2． 5 h，待固液分离后，收集乙醇提取液;残渣再用 500 ml
浓度 70%乙醇分 2次回流提取，每次 2 h，待固液分离，合并
提取液，减压回收乙醇，得乙醇提取物(II)。
1． 2． 4 乙醇提取物的萃取分离。取上述浸膏适量，加水分
散，依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取 2 次，收集各自的有机
相，回收有机溶剂，分别得到石油醚萃取物(II － 1)及乙酸乙
酯萃取物(II － 2) ，水溶液减压蒸馏去水后得到水相物(II －
3)。红足蒿提取物制备流程如图 1所示。
1． 2． 5 红足蒿抑菌活性测定。
1． 2． 5． 1 红足蒿提取物抑菌溶液配制。①红足蒿提取物溶
液(浓溶液)配制。分别定量称取待测样品适量，乙醇提取物
(II)用浓度 70%的乙醇将其溶解;石油醚提取物(I)、石油醚
萃取物和乙酸乙酯萃取物加入适量乙酸乙酯将其溶解;水相
用适量的蒸馏水将其溶解，配制成一定浓度的红足蒿提取物
溶液(浓溶液)。石油醚提取物(I)、乙醇提取物(II)、石油醚
萃取物、乙酸乙酯萃取物及水相物的浓度分别为 0． 075 10、
0． 054 91、0． 063 70、0． 098 91 和 0． 057 32 g /ml。②不同浓度
乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物溶液配制。将原液(浓溶液)
中具有抑菌效果的乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物，分别配制
成原液浓度的 1 /2和 1 /4，抑菌试验溶液为取适量上述浓溶
液及按一定比例用相应溶剂稀释而成的稀溶液。
1． 2． 5． 2 抗菌活性测定。抗菌活性测定采用牛津杯
法［11 －12］。将牛津杯置于菌种涂布均匀的琼脂平板上，在牛
津杯中加入 100 μl已知浓度的红足蒿提取液。把培养皿放
入恒温培养箱中培养 24 h，温度为 32 ℃。红足蒿提取液就
自牛津小杯处向平板四周扩散，在抑菌浓度所达的范围内敏
图 1 红足蒿提取物制备流程
感菌的生长被抑制而出现抑菌圈。根据抑菌圈的大小判断
不同提取液对供试菌的抑制效果［13］。
1． 2． 6 红足蒿提取物的 HPLC指纹谱表征。
1． 2． 6． 1 样品溶液制备。分别称取上述各提取物于10 ml容
量瓶中，以无水甲醇溶解并定容;乙酸乙酯萃取后的水溶液则
取适量，减压蒸去水后以无水甲醇溶解，并定容至 10 ml。
1． 2． 6． 2 色谱条件。色谱柱为 Eclips XDB － C18色谱柱
(250 mm × 4． 6 mm，5 μm) ;以无水甲醇 －水(V /V)梯度洗
脱，无水甲醇随时间梯度变化为:0 ～ 15 min为 1% ～ 25%，15
～30 min为 25% ～ 50%，30 ～ 45 min 为 50% ～ 70%，45 ～ 60
min为 70% ～80%，60 ～70 min为 80%，70 ～100 min为 80%
～100%;流速为 1． 0 ml /min;紫外检测波长为 280 nm，柱温
为 35 ℃;进样体积为 20 μl;ELSD的气流量为 1． 5 L /min;温
度为 50 ℃。
2 结果与分析
2． 1 红足蒿提取物的抑菌试验筛选 试验对从自然阴干
的 600 g红足蒿枝叶进行石油醚脱脂，得到石油醚提取物
25． 1 g(I) ;脱脂后经浓度 70%乙醇回流提取，得到乙醇提取
浓缩物 65． 3 g(II)。乙醇提取物进一步以石油醚、乙酸乙酯
萃取，回收溶剂分别得到石油醚萃取物 7． 9 g (II － 1)、乙酸
乙酯萃取物 14． 2 g (II － 2) ，水溶液减压蒸馏去水后得到水
相物(II － 3)。
2． 1． 1 红足蒿提取物原液抑菌效果。根据抑菌圈的大小判
断不同提取液对供试菌的抑制效果［13］。由表1可知，红足蒿
乙醇提取物在浓溶液时对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑菌效
果明显，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果好。由图 2 可知，
(A)是乙醇提取物对枯草芽孢杆菌抑菌效果显示，其抑菌圈
较大且清晰透明，直径在 45 mm左右;(B)是乙醇提取物对
大肠杆菌抑菌效果显示，其抑菌圈相对(A)稍小，抑菌圈直
径在 40 mm左右;(C)中乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑
菌效果显示，其抑菌圈清晰透明，边缘无杂菌，直径在 22 mm
左右，而乙醇对照组对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡
萄球菌均无抑菌效果。
788540 卷 10 期 戴小阳等 红足蒿提取物抑菌活性的筛选
表 1 红足蒿提取物原液对细菌的抑菌效果
细菌
提取物
Ⅰ Ⅱ
乙醇提取物的分离
Ⅱ－1 Ⅱ－2 Ⅱ－3
空白对照
E EE W
大肠杆菌 － + + + + － + + － － － －
金黄色葡萄球菌 － + + + － + － － － －
枯草芽孢杆菌 + － + + + + － + + + － － － －
注:Ⅰ，石油醚提取物;Ⅱ，乙醇提取物;Ⅱ－1，石油醚萃取物;Ⅱ－2，乙酸乙酯萃取物;Ⅱ－3，水相物;E，乙醇;EE，乙酸乙酯;W，水;+表示有抑菌效果，－
表示无抑菌效果;E + －表示抑菌效果不明显;E +表示抑菌圈直径 10 ～15 mm;E + +表示抑菌圈直径 16 ～ 20 mm;E + + +表示抑菌圈直径 21
～25 mm;E + + + +表示抑菌圈直径 26 mm以上。
注:A为枯草芽孢杆菌;B为大肠杆杆菌;C为金黄色葡萄球菌。空白对照:A0 为枯草芽孢杆菌;B0 为大肠杆杆菌;C0 为金黄色葡萄球菌。
图 2 乙醇提取物的抑菌效果
结果表明，浓度较高的乙酸乙酯萃取物对枯草芽孢杆菌
和大肠杆菌的抑菌效果好，而对金黄色葡萄球菌的抑菌效果
较差。浓度较高的石油醚萃取物和水相物及对照组乙酸乙
酯溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均无抑
菌效果。此外，红足蒿用乙醇提取前以石油醚脱脂，得到的
石油醚提取物(I)对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌无抑菌效果;
对枯草芽孢杆菌表现出微弱的抑菌活性。在红足蒿经石油
醚脱脂、乙醇提取得到的乙醇提取物经石油醚、乙酸乙酯萃
取粗分离共得到 5个不同成分中，乙醇提取物的抑菌活性最
好，其次为乙酸乙酯萃取物，明显优于其他部位。
2． 1． 2 不同浓度乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物的抑菌活
性。在红足蒿提取物浓溶液抑菌活性测定的基础上，将对
供试菌种有抑菌效果的乙醇提取物及乙酸乙酯萃取物的浓
溶液进行稀释，配制成不同浓度的红足蒿提取液，进一步测
定提取物对供试菌种的最低抑制浓度［14］。由表 2 可知，在
不同浓度乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物的抑菌试验中，红
足蒿乙醇提取物对大肠杆菌抑菌效果明显。当乙醇提取物
浓度变化时，培养皿中大肠杆菌的抑菌圈直径随浓度呈梯
度变化;随着提取物浓度的降低，乙醇提取物对大肠杆菌的
抑制作用降低幅度不明显，当浓度降低至 0． 013 7 g /ml 时，
仍有较好的抑菌效果。乙醇对照组对大肠杆菌无抑菌
效果。
表 2 不同浓度乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物对细菌的抑菌效果
细菌
乙醇提取物∥g /ml
0． 054 9 0． 027 4 0． 013 7
乙酸乙酯提取物∥g /ml
0． 098 9 0． 049 4 0． 024 7
空白对照
E EE
大肠杆菌 + + + + + + + + + + + + + + － －
金黄色葡萄球菌 + + + － － + + － － －
枯草芽孢杆菌 + + + + + + + + + － － － －
注:E，乙醇;EE，乙酸乙酯;+表示有抑菌效果，－表示无抑菌效果;E + －表示抑菌效果不明显;E +表示抑菌圈直径10 ～15 mm;E + +表示抑菌圈
直径 16 ～20 mm;E + + +表示抑菌圈直径 21 ～25 mm;E + + + +表示抑菌圈直径 26 mm以上。
8885 安徽农业科学 2012年
在高浓度时，乙醇提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果明
显，但随着提取物浓度的降低乙醇提取物对枯草芽孢杆菌的
抑制作用降低幅度较大，当浓度降低至 0． 013 7 g /ml 时也有
抑菌效果。乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好，
但随着提取物浓度的降低乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的
抑制作用降低明显，当浓度降低至 0． 013 7 g /ml 时无抑菌效
果，在浓度为 0． 054 9 g /ml时才有抑菌效果。
红足蒿乙酸乙酯萃取物对大肠杆菌抑菌效果较好，随着
提取物浓度的降低乙酸乙酯萃取物对大肠杆菌的抑制作用
也降低，在浓度降低至 0． 024 7 g /ml时仍有抑菌性;对金黄色
葡萄球菌的抑菌性相对较弱，在浓度降低至 0． 024 7 g /ml 时
无抑菌性，在浓度为 0． 049 5 g /ml时才有弱的抑菌性;对枯草
芽孢杆菌的抑菌作用较小，浓度低于 0． 049 5 g /ml 时就无抑
菌性。
2． 2 HPLC 指纹谱分析与红足蒿抑菌活性成分的定性分
析 从HPLC指纹谱分析可知，乙醇提取物中含有多种化学
物质。从极性来看，这些物质包含有极性差异较大的一系列
化合物群。此外，由紫外检测器与蒸发光散射检测器
(ELSD)检测得到的色谱图显现一定的差异，说明红足蒿枝
叶所含化合物的结构存在较大的差异，这进一步说明湖南产
红足蒿含有丰富的化合物，为其利用提供了科学依据。
红足蒿石油醚提取物主要为非极性成分，对试验选用的大
肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌基本没有抑制作用;
经石油醚脱脂后的乙醇提取物对上述 3种致病菌的抑菌活性
最好，但乙醇提取物经石油醚及乙酸乙酯萃取后得到的 3个分
离物的抑菌活性表现很大的差异。其中，乙酸乙酯萃取物具有
与乙醇提取物类似的抑菌活性，但抑菌活性比乙醇提取物低一
些;而石油醚萃取物及水相则基本没有抑菌活性。结合以上抑
菌试验结果与 HPLC指纹谱分析，说明红足蒿中对上述 3种致
病菌有抑制活性的物质主要为极性化合物群，但就乙酸乙酯萃
取物与水相物的抑菌活性分析，红足蒿对上述 3种致病菌有抑
制作用的物质主要为乙酸乙酯萃取物中所含的中等极性化合
物群，但石油醚萃取物及水相物中所含化合物群虽然其抑菌活
性很低，但对乙酸乙酯萃取物具有协同作用。
注:a为乙醇提取物图谱;b为石油醚萃取物图谱;c为乙酸乙酯萃取物图谱;d为水相图谱。
图 3 红足蒿乙醇提取物的 HPLC指纹图谱
3 结论
HPLC指纹谱分析表明，红足蒿乙醇提取物抑菌效果好
的物质基础可能是其中所含的极性化合物群;乙酸乙酯萃
取物所含中极性化合物是乙醇提取物具有抑菌作用的重要
988540 卷 10 期 戴小阳等 红足蒿提取物抑菌活性的筛选
物质基础，但石油醚萃取物及水相中所含化合物尽管基本
没有抑菌活性，但对中极性化合物群的抑菌作用具有明显
的增效作用。
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181 －183．
(上接第 5880页)
点，近年来得到了广泛的研究。微波降解法虽然操作简单、
高效快捷，但研究应用较少，有待于进一步研究。对原人参
二醇的结构改造主要有化学法、酶法和微生物法。主要是对
其醇羟基的氚化、酯化和氧化还原等，得到［3，12-3H］原人参
二醇、烷基衍生物、脂肪酸酯及其碱金属盐、氨基酸衍生物
等，都具有较好的药理活性。
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0985 安徽农业科学 2012年