全 文 ：Marine Sciences/Vol.31 , No.10/ 2007
条斑紫菜孢子体与配子体光合系统 II (PSII)稳定性研究
柳葵葵1 , 3 ,张海霞1 , Verena Linhard2 ,Hartmut M ichel2 , 彭国宏1 , 2
(1.中国科学院 海洋研究所 ,山东 青岛 266071;2.Max-P lanck-I nstitute of Biophy sics , Fankfur t am M ain ,
Germany , D-60438;3.中国科学院 研究生院 ,北京 100039)
摘要:膜蛋白是生物领域研究中的热点和难点。在光合作用研究中 , 对于藻类个体发育过程
中光合膜蛋白结构和功能的变化所知甚少 , 其中的一个限制因素是能否纯化得到大量高活
性的稳定且均一的光合膜蛋白。作者从条斑紫菜(Porphy ra yezoensis)孢子体和配子体中分
离纯化得到光合系统(PSII)复合物 , 并研究了其完整性和放氧活性。结果表明 , 孢子体和配
子体的 PSII 复合物 ,在 4℃条件下保存比在-80℃下保存放氧活性高 , 稳定性高。配子体
PSII复合物 ,在-80℃保存第 6 天就已经没有放氧活性 , 而孢子体 PSII 复合物仍有放氧活
性。对 4℃下保存的 PSII复合物进行分子筛柱层析 ,室温吸收光谱测定以及放氧活性测定 ,
发现随着放氧活性逐渐降低 ,蛋白大分子有聚合现象。室温吸收光谱表明经过长期的保存 ,
吸收峰向短波长方向偏移 ,叶绿素易降解成为脱镁叶绿素。
关键词:条斑紫菜(Porphy ra yezoensis);孢子体;配子体;光合系统(PSII)稳定性
中图分类号:Q945.11　　文献标识码:A　　文章编号:1000-3096(2007)10-0025-05
　　光合作用是地球上一切生物直接或间接的能量
来源[ 1] ,光合系统 II(PSII)通过一系列光驱动的电子
传递反应最终使光能转化为化学能 , 同时使水裂解
放氧。因此对光合膜蛋白研究具有重要意义。条斑
紫菜(Porphyra yezoensis)是一种大型海洋红藻 , 具
有孢子体和配子体的异型世代交替生活史[ 2] 。孢子
体和配子体在形态和生长环境上各不相同 , 但都能
进行光合作用。许多学者研究了高等植物和藻类个
体发育过程中光合作用生理特征方面的变化[ 3 ～ 5] 。
彭国宏等[ 6]发现条斑紫菜在个体发育过程中具有两
种不同的藻胆体。潘洁等[ 7]研究表明 ,条斑紫菜在个
体发育过程中两个光系统间激发能的分配有所不
同。在配子体阶段 , PSII 吸收到的过多激发能能够
传递给 PSI;而在孢子体阶段 , PSII 收到的过多激发
能没有传递给 PSI。因此 , 有必要进一步比较研究条
斑紫菜孢子体和配子体类囊体膜蛋白的结构和功
能。首先需要获得稳定均一的光合膜蛋白 ,并进一步
获得高分辨率的三维空间结构数据。但是膜蛋白具
有疏水性 , 致使分离纯化困难 , 并降低其稳定性[ 8] 。
作者采用纯化后的 PSI I复合物 , 研究分析了储存过
程中放氧活性与稳定性的变化 , 为进一步的结构和
功能研究提供依据。
1　材料和方法
1.1　细胞培养和材料采集
1.1.1　条斑紫菜孢子体的培养
条斑紫菜孢子体培养在 PES 海水培养基中[ 9] ,
温度为 18 ～ 21℃, 光强为 400 lx , 光照培养箱通气培
养 , 2 周后收集。
1.1.2　条斑紫菜配子体的采集
条斑紫菜配子体于 3 月中旬采自青岛汇泉湾海
域 , 用海水漂洗后悬挂阴干 , 保存于-20℃冰箱中。
使用前 24 h取出 ,在 PES 海水培养基中静置恢复培
养后用于实验 。
1.2　孢子体与配子体 PS II的分子筛柱层析
条斑紫菜孢子体和配子体离体类囊体膜的分离
参照梁军等[ 10]的方法。将分离得到的配子体与孢子
体的 PSII 复合物用 superdex200 3.2/ 3(Pharmacia
Smar t Sy stem)进行分子筛柱层析。分子筛层析柱预
先用缓冲液平衡(30 mmol/ L Na-pho sphate , pH 7.0;
0.05% NaN 3 , 0.03% Dodecyl-β-D-maltopy rano side),
流速为 50 μL/ min , 4℃条件下 , 上样量为 50 μL , 流
速为 50 μL / min ,检测波长 280、435 nm 处的光吸收
值 , 分别收集不同层析峰。
收稿日期:2006-06-20;修回日期:2006-10-20
基金项目:国家自然科学基金资助项目(B33023019 , M ax-
Planck-Gesel lsch af t)
作者简介:柳葵葵(1979-),女 ,山东栖霞人 ,硕士 ,研究方向
为海洋生物学 , E-m ail:liuk uikui@m s.qdio.ac.cn;彭国宏 ,
通讯作者 , E-mai l:ghpeng @ms.qdio.ac.cn , guohong.peng
@m pibp-f rankfurt.mpg.de
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1.3　室温吸收光谱分析
用 Pe rkin Elme r UV/ VIS spectrome te r Lamb-
da40 测定 PSII提取物的室温吸收光谱 , 扫描波长范
围为 400 nm 至 750 nm , 扫描速度为 500 nm/ min ,狭
缝为 0.5 nm。
1.4　PSII放氧活性测定
PSII的放氧活性用 Clark(Hansatech CB1D e lec-
trode , Hansatech , UK)型氧电极测定。 Dichlo rp-p-
benzoquinone(DCBQ)和 fer ricy anide(K3Fe(CN)6)作
为人工电子受体。电子传递是从 H 2O 到人工电子受
体 DCBQ 和 K 3 Fe(CN)6 。 测定液为 20 mmo l/ L
MES(pH 6.4), 5 mmol/ LCaCl2 , 2 mmol/ L fer ricy a-
nide , 0.2 mmol/ L DCBQ 。将含有 2.5 μg 到 5.0 μg
叶绿素的一份 PSII加入到测定液,最终体积是 1 mL[ 11] 。
测定温度为18℃。测定过程中以饱和光持续照射。
2　结果和讨论
2.1　分子筛柱层析分析结果
将纯化后得到的孢子体与配子体的 PSII 复合
物 ,分别保存在 4℃冰箱中 ,从制备之日起 , 每 4 d ,分
别取 50 μL 储备蛋白进行分子筛柱层析分析 super-
dex200 PC 3.2/ 3(Pharmacia sma rt system)。图 1 结
果显示 ,配子体的 PSII成份 , 随着储存时间的增长蛋
白 0.9 m L处洗脱峰逐渐降低 , 而在 1.1 mL 处逐渐
增加 ,同时峰位左移 , 说明在这段时间内配子体的蛋
白成分同时有聚合和降解现象发生。图 2 结果显示 ,
孢子体也有类似聚合的现象发生。
图 1　配子体 PSII 复合物 4℃储存条件下 ,不同时间的分子
筛柱层析
Fig.1　Gel f ilt ration analysis of PS II complexes f rom gam e-
t ophytes stored in 4℃
图 2　4℃储存条件下的孢子体 PS II复合物不同时间的分子
筛柱层析
Fig.2　Gel f ilt ration analysi s of PS II complexes f rom game-
tophy tes stored in 4℃
2.2　配子体与孢子体 PSII室温吸收光谱
分别测定新制备的 PSII 复合物与在 4℃下保存
12 d 的 PSII复合物的室温吸收光谱。在制备的新鲜
配子体 PSII的室温吸收光谱中 , 两个主要的峰为 435
nm 与 675 nm ,来自于叶绿素 a的吸收。同时在 417
nm 处有一个小的吸收肩。 在 4℃冰箱中保存 12 d
后 , 红区的吸收峰向左移 1 nm , 同时 435 nm 处的吸
收降低 , 417 nm 处的吸收峰成为蓝区主要的吸收峰
(图 3)。在新鲜制备的孢子体的室温吸收光谱中 , 两
个主要的吸收峰为 437 nm 与 678 nm , 417 nm 处也
有小的吸收肩。孢子体新鲜样品在 483 nm 处的小
峰可能是来自胡萝卜素的吸收 ,在 4℃冰箱中保存 12
d 后 483 nm 处的吸收峰消失 , 417 nm 处的吸收峰明
显高于 435 nm 处的吸收峰 , 同时红区的吸收峰由
678 nm 移至 674 nm。 417 nm 处的吸收可能来自于
脱镁叶绿素[ 12] , 说明在保存过程中部分叶绿素 a 转
变成为脱镁叶绿素(图 4)。
2.3　保存条件对孢子体与配子体 PSII 活性
的影响
　　将提取的 PSII样品分成 2 份 , 一份在4℃冰箱中
保存 , 一份液氮冷冻后在-80℃保存。每 48 h 测定
一次放氧活性 。配子体 PSII复合物放氧活性在光照
强度为1 856 lx , 18℃,叶绿素质量浓度为 5 mg/ L条
件下测定;孢子体 PSII 复合物放氧活性在光照强度
为2 240 lx , 18℃,叶绿素质量浓度为 5 mg/ L条件下
测定。图 5 , 6 结果显示 , 随着时间的推移 , PSII 的放
氧活性逐渐降低。但是相对于-80℃的保存条件 ,在
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图 3　制备的新鲜配子体 PSII 复合物与 4℃下储存 12 d的
样品的室温吸收光谱
Fig.3　Absorption spect roscopy at room tem perature of
f resh and old(stored in 4℃ for 12d)PSII comp lexes
and f rom gam etophytes
图 4　制备的新鲜孢子体 PSII 复合物与 4℃下储存 12d的
样品的室温吸收光谱
Fig.4　Absorption spect roscopy at room tem perature of
f resh and old(stored in 4℃ for 12d)PSII comp lexes
and f rom sporophytes
4℃条件下放氧活性较高。配子体 PSI I复合物在 4℃
条件下活性最初为 2 256.33 mmol/(g · h), 到第 10
天的时候只有 298.4 mmo l/(g · h)。孢子体 PSII 复合
物在 4℃条件下活性最初为 2 269.77 mmo l/(g · h),
到第 10 天只有 352.85 mmo l/(g · h)。 配子体在
-80℃下保存第 6 天就已经没有放氧活性 , 但是此
时-80 ℃保存的孢子体 PSII复合物仍然具有放氧
活性 , 而且保存在-80 ℃下第 10 天放氧活性仍然
有 293.6 mmo l/(g · h)。 分析配子体与孢子体差别
的原因 , 可能是由于 PSII 是一种含有色素的多亚基
膜蛋白复合物 , 在脱离了类囊体膜的情况下直接冷
冻 , 缓冲液中水分会很快形成冰晶 , 引起一系列不良
反应 , 如局部电解质浓度增高 , pH 值改变 , 部分蛋白
质由于上述原因而变性 ,引起 PSII内部电荷分离 , 电
子传递变化 , 导致放氧活性降低。
图 5　4 ℃与-80℃保存条件下 ,配子体 PSII 复合物活性的
变化
Fig.5　The oxygen evolut ion of PSII comp lexes f rom game-
t ophytes s tored at 4℃ and -80℃ during storage
图 6　4 ℃与-80℃保存条件下 ,孢子体 PSII 复合物活性的
变化
Fig.6　The oxygen evolu tion of PSII com plex es from sporo-
phy tes stored at 4℃ and -80℃ du ring s torage
条斑紫菜孢子体和配子体 PSII 复合物的光系统
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活性均随保存时间的延长而降低 , 但是孢子体与配
子体在-80℃下变化趋势的差别 ,可能是由于二者的
复合物结构差异所致。这可能与它们不同的生长环
境有关。条斑紫菜孢子体多生长在海底贝壳中 ,而配
子体则多生长在海边岩礁上[ 2] , 由于生长环境的不
同可能造成了二者对光强和温度条件的不同的色适
应性反应 ,从而导致了光系统的差异。 P rakash 等[ 13]
报道 , Cucumis sativus 子叶衰老过程中捕光天线组
成 、与反应中心的结合状态 、叶绿素分子的比例等均
发生变化。作者分析 PSII 的 SDS-PAGE 的结果已
表明它们之间亚基组成有所差别(结果待发)。由此
推测 ,在-80℃下 , 条斑紫菜孢子体和配子体 PSII复
合物光系统活性变化的差异 , 也可能是由于二者光
系统蛋白复合物上的亚基和叶绿素分子的组成差异
所致。上述研究结果表明条斑紫菜配子体与孢子体
的 PSII 复合物聚合状态下色素的组成对环境条件较
敏感 ,对如何增强其稳定性 , 提高其活性 ,尚待进一步
研究。
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(下转第 35页)
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Current calculation for the Huangmao Sea in extreme hydrology
conditions
LI Rui-jie , YAN Yi-xin , SHAO Yu-yang , TAO Ai-feng , TAO Jian-fu
(State Key Labor atory o f Hydrolog y-Water Resour ce s and Hydraulic Engineering , Hehai Univer sity , Key
Laboratory of Coastal Disaster and Defence , Ministry of Education , Hehai University , Nanjing 210098 , China)
Received:Aug., 26 , 2004
Key words:ext reme hydrology condition;current f ield;m odel of coastal and ocean engineering;the H uangmao Sea
Abstract:The Model of Coastal and Ocean Engineering is validated by observed data of the Huangmao Sea.
Then the model is used in current calculation for the Huangmao Sea in extreme hydrology conditions which are the
meeting of typhoon and spring tide and that of typhoon , spring tide and flood.The solutions show ed that , when the
ex treme conditions arise , all the velocity characteristics increase distinctly near Yamen.In o ther places , the character-
istics o f flow field decrease at ebb tide and increase at flood tide when typhoon and spring tide meet.When the meeting
of typhoon , spring tide and flo od happens , all the characteristics of flow field increase significantly , and the range of
increase is greater than that of the meeting of typhoon and spring tide.
(本文编辑:刘珊珊)
(上接第 28 页)
Stability analysis of PSII from gametophytes and sporophytes of
Por phyra yezoensis
LIU Kui-kui 1 , 3 , ZHANG Hai-xia 1 , Verena Linhard2 ,Hartmut Michel2 , PENG Guo-hong 1 , 2
(1.Institute o f Oceano lo gy , the Chinese Academy o f Science s , Qingdao 266071 , China;2.Max-P lanck-Insti-
tute of Biophy sics , Frankfurt am Main 60438 , Germany;3.Graduate Schoo l of the Chine se Academy of Sci-
ences , Beijing 100039 , China)
Received:Ju n., 20 , 2006
Key words:Porphy ra yezoensis;sporophytes;gametophytes;PSII s tabili ty
Abstract:Little is know n about the structural and functional alte rations of photo sy stem membrane pro-
teins during onto genesis.One limitation of such studies is the availability of sufficient amounts of pure , stable
and homogenous photo sy stem proteins w ith high ac tivities.In this repo r t , pho to sy stem II w as iso lated f rom
the sporophy te and gametophy te cells o f the r ed alg a Porphy ra yezoensis.PSII activ ity a ssay s w ere pe rformed
by measuring oxygen evolution during electron t ransfer f rom H2O to 1 , 4-benzoquinone , using an oxygen elec-
trode(Hansatech).The isolated PSII complexes we re sto red a t 4℃ and -80℃.The oxygen evolution activi-
ty wa s measured every other day.The re sults show ed that PS II activity from both gametophy tes and spo ro-
phytes decr eased during sto rage.The oxygen evo lution o f PS II sto red at 4℃ was higher than that sto red at
-80℃;At -80℃, Gametophy te PS II w as comple tely inac tive af te r 6 day s while spor ophy te PS II r etained
50% of activity , nearly the same as when stored at 4 C.The PSII complexe s sto red at 4℃ w ere fur the r ana-
lysed by gel filtration , oxygen evo lution and absorption spectro scopy at room temperature.The gel filtr ation
profiles showed tha t the pr otein complexes agg rega ted during stor age.The chlo rophy ll absorption at 435 nm
decreased , while the abso rption at 417 nm increa sed.This implies that chlor ophy ll in PS II deg r aded to pheo-
phytin.
(本文编辑:张培新)
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