全 文 ：文章编号:1001-4829(2001)01-0091-05
　　收稿日期:1999-06-22;2000-06-02修回
　　作者简介:黄萍 (1971-), 女 , 助理研究员 , 从事生物技术
研究
绿菇子实体菌株的原生质体分离及再生菌株的获得
黄　萍 , 沈孝善
(贵州省农业科学院　生物技术研究所 , 贵州 贵阳　550006)
摘　要:收集 30℃下 , 暗培养 36 ～ 48hr 的菌体 , 放入酶液中并把菌丝分散 , 经过 3 ～ 8hr的酶
解 , 菌体产生的分生孢子 95%以上成为原生质体。经过滤 、 离心纯化 , 原生质体的产量在 0.1×
10
6 ～ 1.75×107 个/g (鲜重)。以液体浅层培养 , 在 30℃下培养离心纯化的原生质体 2 ～ 7hr , 原
生质体形成萌发管 , 48hr 形成肉眼可见的菌落。再生率随分离原生质体的条件变化很大 , 在
3.0%～ 67.7%。在 15℃下培养也能形成再生菌落。培养菌体的时间 、 酶浓度 、酶解时间 、 酶解
温度 、 震荡与否影响原生质体的形成和再生 。以 CaCl2 高渗缓冲液酶解 7 ～ 24hr , 原生质体的再
生率为 45.7%～ 67.6%, 是使用其他高渗缓冲液酶解 3 ～ 5hr的 2 ～ 6倍 。
关键词:绿菇;分生孢子;原生质体;再生;渗透压稳定剂;二氯化钙
中图分类号:S567.3　文献标识码:A
Isolation of the protoplasts from the strain isolated from fruit body
of Russula virescens and regeneration of the protoplasts
HUANG Ping , SHEN Xiao-shao
(Inst itute of Biotechnology , Guizhou Academy of Agricultural Sciences , Guiyang 550006 , China)
Abstract:Protoplast s of Russula virescens (Schaef)Fr.w ere isolated f rom the spores produced by the mycelia , w hich collected from
the cultures init iated f rom actively growing cultures(incubated at 30℃ less than 72 hours) and cultured in the dark at 30℃ f or 36-62
hours , in solutions containing snailase (1-20mg/ml), Mes (0.1M)and various osm ot ica (0.6 osmole).The yield of the protoplast
w as in the range of 0.1×106 to 1.75×107.The purified protoplasts being incubated at 30℃ f ormed germinat ing tubes and regenerated
mycelia in 2-7 hours using liquid thin layer cultu re.The regenerated colonies were visible after 48 hou rs.The regeneration rates w ere in
the range of 3% t o 67.7% and dependent on the condit ions for i solat ion of the p rotoplast s.The regenerated colonies appeared w ith one
day delay if the protoplast s cultured at 15℃.Formation and regeneration of the protoplasts w ere influenced by the time for culture of the
mycelia , concent ration of the digesting enzyme , time and tem peratu re for digest ion , ident ity of the osmotic stabilizers and shaking in di-
gest ion.If the protoplast w ere isolated wi th calcium dichloride as the osmoticum , the regeneration rate w as as high as 45.7%-67.7%,
2-6 folds of that of the p rotoplast s isolated w ith other osmotic stabi lizers , even digested for 8-24 hours.
Key words:R ussula virescens;spore;protoplast;regeneration;osmotic stabilizer;CaCl2
　　绿菇 (Russula v irescens)属红菇科 、 红菇属 ,
子实体大 , 食味鲜美 , 营养丰富 , 是常见菌类中最
受人们欢迎的食用菌之一 。该菌提取物对肉瘤 S-
180和艾氏瘤的抑制率都为 70%。绿菇也是一种菌
根真菌 , 其营养方式为腐生和工共生[ 1] , 但我们
把它接种在以纤维素和木质素为主要成分的食用菌
培养基上不能生长 , 因此它不能直接利用纤维素或
木质素。其子实体于夏秋雨后生长于松栎等真叶
林 、阔叶林或针阔叶混交林地上 , 分布于江苏 、浙
江 、广西 、 四川 、 西藏 、 云南 、 贵州等省[ 1] 。近
几年来 , 通过原生质体的培养 、 诱变 、原生质体融
合或转化改良真菌虽有不少报道 , 但未见绿菇原生
质体的分离和再生的报道。为了使用这些方法改良
绿菇 , 我们首先建立了绿菇原生质体的分离和再生
的方法 。本文是这一方法的报道 。
91
2001年 14卷 1期
Vol.14　　No.1 　　　　　　　　　　　　　　
西　南　农　业　学　报
S outhwest China Jou rnal of Agricultu ral Sciences
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2001.01.023
1　材料与方法
1.1　菌种
从采集的子实体的菌柄上部分离。由于尚未见
有绿菇在人工制造的培养基上形成子实体的报道 ,
因此把从菌盖分离得到的菌种进行多次形态比较和
在显微镜下观察 , 未见明显的差异 , 两者均能在固
体培养基上产生分生孢子 , 我们以此初步命名其为
绿菇的菌种 , 其真实地位有待进一步确证。保存于
4 ～ 5℃下 。
1.2　固体培养基 (mg/ L)
NH4Cl 407 , KH2PO4 462 , MgSO4·7H2O 492 ,
1%的 FeCl3 1ml , 葡萄糖 5000 , 烟酸 0.5 , 维生素
B6 0.1 , 维生素 B1 0.1 , 琼脂 15000 , pH6.0。
1.3　液体再生培养基
去掉菌体培养基中的琼脂 , 加甘露醇 0.6M ,
pH6.0。
1.4　高渗缓冲液
葡萄糖高渗缓冲液:Mes 0.1M , 葡萄糖
0.6M ;蔗糖高渗缓冲液:Mes 0.1M , 蔗糖 0.6M ;
甘露醇高渗缓冲液:Mes 0.1M , 甘露醇 0.6M;山
梨糖醇高渗缓冲液:Mes 0.1M , 山梨糖醇 0.6M ;
KCl高渗缓冲液:Mes 0.1M , KCl 0.3M ;MgSO4
高渗缓冲液:Mes 0.1M , MgSO40.3M ;CaCl2 高
渗缓冲液:Mes 0.1M , CaCl2 0.2M 。pH 值均为
6.0。
1.5　酶液
蜗牛酶从华美生物工程公司购进 , 北京生物化
工厂 、上海生物化工厂生产。蜗牛酶溶解于高渗缓
冲液中 , 以 0.22μm 的微孔滤膜过滤。
1.6　方法
1.6.1　菌体培养及收集　将保存的菌种接种在直
径10cm 的培养皿的固体培养基 (15ml)上 , 在
30℃下暗培养 1周 , 取菌落边缘的菌体接种在同样
的培养基上 , 在 30℃下培养 72hr , 使菌体生长最
快。取快速生长的菌落边缘的菌体接种在同样的培
养皿中 , 每皿接 4块菌体 (每块大小约 5mm), 在
同样的条件下培养 36 ～ 48hr。以接种环收集菌体 ,
放入已知重量的培养皿中 , 称量收集的菌体 。
1.6.2　原生质体的分离　把已收集的菌体放入已
盛3ml酶液 、 直径 60mm 的培养皿中 (每 ml酶液
约 0.03g 菌丝), 使其充分分散 , 以 parafilm 封口 ,
置于震荡器或温箱中 , 使其在震荡或静止条件下酶
解。每隔半小时在倒置显微镜下观察一次 , 当
95%的分生孢子成为原生质体时 , 以灭菌的双层镜
头纸过滤 , 以除去菌丝 、 残渣 。把收集的滤液离心
(200g , 8min), 弃去上清液 , 以液体再生培养基
反复悬浮 、 离心沉淀 3次。定容后 , 以血球计数板
计原生质体数。
1.6.3　原生质体的培养　原生质体计数后 , 以再
生液体培养基稀释为 5×105 个/ml , 转移至直径为
60mm的培养皿中 (每皿 3m l), 以 parafilm 封口 ,
在 30℃下静止暗培养 。在培养过程中定时观察统
计原生质体的再生情况 。
2　结　果
2.1　分生孢子的形成
旺盛生长的菌体接种在固体培养基上 24hr 时
观察 , 在菌体周围贴着培养基表面长出匍匐状的菌
丝 。37hr时观察 , 不仅可见菌落进一步扩大 , 而
且在葡匐菌丝之上有很多菌丝长在空气中 , 在显微
镜下观察 , 可见分生孢子梗顶端着生 1 ～ 5个梨型
的分生孢子 。
2.2　原生质体的形成过程及来源
把菌体充分分散在酶液之后 , 此时在倒置显微
镜下观察 , 大部分的分生孢子已散落在酶液中 (图
2-1)。酶解 10min 后 , 可见圆形的 、 大小与分生
孢子相近的原生质体。随着酶解时间的延长 , 原生
质体数量逐渐增加 , 孢子数量逐渐减少 , 有些孢子
变成椭圆型 。酶解结束时 , 很难见到梨型的分生孢
子 (图 2-2)。所以可以确信 , 原生质体由分生孢
子酶解脱壁而来 , 萌发的孢子不能形成原生质体。
2.3　影响原生质体形成和再生的因素
2.3.1　菌体培养时间长短对原生质体形成的影响
　以培养 36hr的菌体酶解分离原生质体 , 由于此
时菌体形成的孢子较少 , 原生质体的产量不高 。以
培养62hr的菌体酶解分离原生质体 , 3hr后 , 70%
～ 80%的孢子萌发形成菌丝 , 萌发的孢子不能脱
壁 , 原生质体的形成率在 20%左右。以培养 48hr
的菌体酶解分离原生质体 , 原生质体形成率在
95%以上 , 经过滤 、离心洗涤 , 每克菌体 (鲜重)
的原生质体产量在 0.1×106 ～ 1.75×107 个 , 所以
以下的实验所用的菌体都是培养 48hr的菌体。
2.3.2　酶解时间对原生质体形成和再生的影响
　在所使用的条件下 , 酶解 10min左右 , 就有原生
质体出现 , 原生质体的释放随酶解时间的增加而增
多 , 但达到最大形成率的时间因实验条件的不同而
异 。
除使用 CaCl2 作渗透压稳定剂外 ,酶解时间超
过 4hr ,出现很多大原生质体(其大小是孢子大小的
2 ～ 10倍),部分原生质体在离心分离时不能沉淀 ,
原生质体的获得率降低 。此种原生质体的再生率低
92 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　14卷
(不超过 10%),酶解 4hr和酶解 3hr所得到的原生
质体的再生率可相差 1 ～ 5 倍 。若酶浓度达到每
10mg/ml ,酶解 8hr ,原生质体就会破裂消失。
2.3.3　酶浓度对原生质体的形成和再生的影响
　以甘露醇高渗缓冲酶液在 30℃下酶解分离原生
质体 , 蜗牛酶浓度分别为 0 , 1 , 2 , 3 , 5 , 10 ,
20mg/ml。酶解 4hr 观察 , 在无蜗牛酶的高渗缓冲
液中无原生质体出现 , 以每 ml含 1 、 2mg 蜗牛酶
的酶液酶解只见个别的原生质体释放出来 , 70%～
80%的孢子萌发形成菌丝 , 延长酶解时间也未见原
生质体明显增加 。以每 ml含 3 , 5 , 10 和 20mg 蜗
牛酶的酶液酶解 , 原生质体的释放如图 1所示 , 每
ml含 10mg 或 20mg 蜗牛酶的酶液酶解 , 酶解 2hr
原生质体的形成率就达到 95%以上 (图 1), 但以
每ml含 20mg 蜗牛酶的酶液所得到的原生质体的
再生率只有以每 ml含 10mg 蜗牛酶酶解所得到的
原生质体的三分之一 (9.81%)。所以 , 以下的实
验使用的酶浓度均为每 10mg/ml。
2.3.4　酶解温度对原生质体形成的影响　以甘露
醇高渗缓冲酶液在 20°C 、 25°C 、 30°C和 35°C分离
原生质体 , 经过 4hr 的酶解 , 30°C和 35°C的处理
原生质体的形成率分别为 95.4%和 97.4%, 20°C
的处理为 85.7%, 25°C最适合孢子的萌发 , 80%
以上的孢子萌发 , 原生质体的形成率不到 20%。
所以 , 以下的实验中原生质体的分离都在 30 ～ 35
°C下酶解。
2.3.5　震荡对原生质体形成的影响　每分钟 40 ～
60转的震荡不仅可以加快原生质体的释放 , 使达
到最大的原生质体形成率的时间缩短 1hr (酶解 2
～ 3hr即可离心纯化), 有利于提高再生率 , 而且
可以抑制孢子的萌发 , 有利于原生质体的形成。在
震荡的条件下 , 萌发的孢子不到 2%, 原生质体的
形成率可达 98%以上 。
图 1　酶浓度对原生质体形成的影响
Fig.1　Effect of enzyme concentration on the rate of proto-
plasts formed
2.3.6　渗透压稳定剂的种类对原生质体的形成和
再生的影响　7种渗透压稳定剂对原生质体的形成
和再生的影响的比较如表 1。
　　实验中还观察到:以 KCl作渗透压稳定剂 ,
酶解 1hr就出现大原生质体 (为孢子体积的 2 ～ 10
倍), 2hr后 , 这种大原生质体也在以甘露醇 、 Mg-
SO4作渗透压稳定剂的酶解液中出现 , 到酶解结束
时 , 大原生质体的比例可达 40%～ 50%。这种大
原生质体在培养中不会萌发而再生。而以 CaCl2 为
渗透压稳定剂分离原生质体 , 尽管酶解时间延长 ,
却很难见到大原生质体出现 , 而且还出现比孢子体
积还小的原生质体 。即使酶解 24hr , 也只有个别
大原生质体出现 , 原生质体的再生率仍很高 , 为
45.7%。以 MgSO4作渗透压稳定剂 , 孢子在酶解
中萌发早 , 萌发的比例高 , 静止酶解时 , 萌发率可
达 40%(其他渗透压稳定剂为 2.4%～ 24%;在震
荡酶解中 , 起萌发率为 2.6%, 而使用其他渗透压
稳定剂则几法几乎不萌发。
以上的结果表明 , 以无机盐 KCl、 MgSO4 、
CaCl2 做渗透压稳定剂分离的原生质体的再生率比
以甘露醇为渗透压稳定剂分离的原生质体的高;以
葡萄糖 、蔗糖为渗透压稳定剂分离的原生质体的再
生率比以山梨糖醇 、甘露醇为渗透压稳定剂分离的
原生质体的高;MgSO4 促进萌发;CaCl2 对稳定原
生质体 、提高其再生率的作用非常显著。
2.4　原生质体的再生
在显微镜下对培养的原生质体观察 , 培养中的
表 1　7 种渗透压稳定剂对原生质体的形成和再生的影响的
比较
Table 1　Comparison of the effects of 7 osmotic stabilizers on forma-
tion and regeneration of the protoplasts
达到 95%以上的形
成率的时间(hr)
Time for 95%
of spores forming
protoplast s
原生质体产量
(个/ g ,鲜重)
Protoplast
yield(n/ g , fw)
再生率(%)
Regenera-
tion rate
葡萄糖
Glucos
4～ 5 0.9×106 ～ 1.06×107 6.81～ 22.8
蔗糖
Sucrose
4～ 5 1.8×106 ～ 1.28×107 4.36～ 29.8
山梨糖醇
S orbitol
3～ 4 1.2×106 ～ 0.63×107 3.25～ 9.48
甘露醇
Mannitol
3～ 4 1×106 ～ 1.75×107 2.97～ 7.80
甘露醇
Mannitol
3～ 4 0.14×106 ～ 5.14×106 2.49～ 10.2
KCl 3～ 4 0.1×106 ～ 4.85×106 24.9～ 32.43
MgSO 4 3～ 4 0.13×106 ～ 4.62×106 29.5～ 35.12
CaCl2 3～ 4 0.12×106 ～ 4.49×106 45.7～ 67.74
931期　　　　　　　　　　　　　　黄　萍等:绿菇子实体菌株的原生质分离及再生菌株的获得
图 2　原生质体的形成过程
Fig.2　Formation of protoplast of Russula virescens (Schaef)
　　 　　1.散落在酶液中的分生孢子 , 酶解 15min拍摄 , 放大 209倍。 T he conidia dispersed in the enzyme solution and
photographed af ter being digested for 15 min.209×.2.在甘露醇高渗缓冲液酶液中酶解 3.5hr 形成的原生质体 ,
有些原生质体已扩大, 放大 209倍。 The protoplasts formed af ter 3.5 hrs of digestion in a mannitol osomo-stabilizer
buf fer , a part of the protoplasts enlarged.209×.3.开始萌发 、 形成的萌发管的原生质体 , 培养 2hr 拍摄 , 放大
209倍。 Formation of the germinat ion tubes by the germinat ing protoplasts cultured for 2 h rs.209×.4.萌发管已长
成分枝的菌丝 , 培养 21h r 拍摄, 放大 209 倍。 The branched mycelium formed f rom a germination tube , pho-
tographed after the protoplast s cultured for 21 hrs.209×.
绿菇原生质体产生 3 种形态变化 。1.原生质体随
培养时间的增加而扩大 , 最后丧失内涵物但原生质
膜仍保持圆形形成空的圆形体 。2.随着原生质体
的扩大 , 原生质体像酵母出芽那样 , 形成成串的细
胞。在实验中已观察到 7个细胞连接在一起 。这两
种形态变化都不能形成菌丝而导致再生 。3.原生
质体的体积不扩大 , 以形成萌发管 (图 2-3), 进
而长成分枝菌丝 (图 2-4)而形成菌落的方式再
生。一般一个再生原生质体只形成一个萌发管 , 只
有个别再生原生质体形成两个萌发管 。在 15 ～ 30
°C下培养都能长出萌发管 。在 30°C下培养 2hr , 原
生质体开始萌发 , 7hr 后不再出现新的萌发 , 48hr
长成肉眼可见的菌落。在 15°C下培养 , 72hr 才能
长成肉眼可见的菌落 。
3　讨　论
据报道 , 在食用菌中通过原生质体克隆 (Pro-
toclone)的选择 , 获得了子实体产量提高 40%的
香菇菌株[ 6] ;在多孔菌属中获得了分解木质素的
活性提高一倍的原生质体克隆[ 14] ;在丝核菌中 ,
通过原生质体的再生 , 可以迅速获得致病性低的单
核体[ 10 , 16] 。通过亚硝基胍或紫外光诱变盾形鸡宗
的原生质体 , 可以获得多种营养缺陷型菌株[ 9] 。
对原生质体进行转化 , 获得了抗湿霉素的菌根真菌
漆色乳菇 (Lactarius laccta)镰刀菌和雪根霉
(Rhizopus niveus)[ 2 ,3 ,7] 。由于原生质体没有细胞
壁 , 有利于酶的渗出 , 青霉的原生质体渗出的果胶
酶是菌丝渗出的两倍多[ 13] , 固定化的木霉原生质
体的胞外纤维素酶与胞内纤维素酶之比为 5.9 , 而
菌丝的胞外纤维素酶与胞内纤维素酶之比为
0.32[ 8] 。因此 , 原生质体的固定化技术有利于酶
的制取 。而以上所述 , 均以原生质体的分离 、 培
养 、再生为基础。我们建立了绿菇原生质体的分
离 、培养 、 再生的方法 , 为使用上述方法利用绿菇
原生质体 、 改良绿菇奠定了基础 。
制备真菌原生质体时 , 一般使用的渗透压稳定
剂为有机渗透压稳定剂葡萄糖 、蔗糖 、山梨糖醇 、
甘露醇和无机渗透压稳定剂氯化钾 、 氯化钠 、 硫酸
镁 , 也有使用硫酸氨 、 氯化铵的报道[ 3 , 4 ,11 , 12 ,15] ,
使用氯化钙作渗透压稳定剂鲜有报道 。分离交链孢
94 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　14卷
菌的原生质体使用无机盐作渗透压稳定剂有利于原
生质体的释放 , 使用蔗糖或糖醇有利于再生[ 4] ,
在木霉原生质体分离中 , 不同的渗透压稳定剂的效
果是:氯化钾>硫酸氨 >氯化钠>甘露醇>硫酸
镁[ 12] 。我们的实验结果与上述结果有同有异 。相
同的是硫酸镁不利于分离原生质体 , 原因是促进胞
子萌发;不同的是使用无机盐作渗透压稳定剂分离
的原生质体的再生率高 。在有机渗透压稳定剂中 ,
以代谢性的葡萄糖 、 蔗糖作渗透压稳定剂分离的原
生质体的再生率比以非代谢性的甘露醇 、山梨糖醇
作渗透压稳定剂分离的原生质体的再生率高 。二价
的钙 、 镁离子对原生质膜有稳定作用已得到公认 ,
在我们的实验中镁离子并没有表现出这种作用 , 但
对孢子的萌发有显著的促进作用 , 是否可把这种促
进孢子萌发的作用应用于原生质体的再生培养值得
实验 。而氯化钙作渗透压稳定剂分离的原生质体显
得很稳定 , 再生率高 , 其原因及其实用范围值得研
究。
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(责任编辑　高红卫)
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