全 文 ：第 37 卷 第 3 期 大 连 大 学 学 报 Vol.37 No.3
2016 年 06 月 JOURNAL OF DALIAN UNIVERSITY Jun. 2016

角叉菜丝氨酸乙酰转移酶的分子克隆及生物学特性分析
赵培哲，齐冬青，赵春晖*
（辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116081）

摘 要：丝氨酸乙酰转移酶（SAT, EC 2.3.1.30）是硫同化中非常重要的一个酶，是半胱氨酸合成的关键酶，催化丝氨
酸转化为氧乙酰丝氨酸的反应，后者再生成半胱氨酸。本研究从红藻门杉藻科角叉菜（Chondrus crispus）cDNA 文库
中克隆了角叉菜丝氨酸乙酰转移酶基因(cysE) 全长序列（GenBank 序列号 KT963952）。序列分析表明，其 ORF 区长
1143 bp，编码由 380 个氨基酸组成的蛋白，理论分子量为 40.60 kDa,理论等电点为 6.26。生物信息学分析表明角叉菜
SAT 与其他物种的 SAT 的氨基酸序列具有较高的同源性。本研究为探讨 SAT 在角叉菜硫代谢中的作用提供了实验基
础。
关键词：角叉菜；丝氨酸乙酰转移酶；分子克隆；硫同化
中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：1008-2395(2016)03-0056-06
收稿日期：2015-11-09
基金项目：国家自然科学基金项目(21102067)。
作者简介：赵培哲(1993-)，女，硕士研究生，研究方向：细胞生物学。
通讯作者：赵春晖(1974-)，女，副教授，研究方向：细胞生物学。


硫在全球的生态系统循环中是一种重要的化学
元素。在自然界中，硫以有机和无机两种形式存在。
现在地球环境中的硫元素主要以最高的氧化态+6 价
存在于硫酸根中。在植物和微生物体内，硫酸盐可以
被吸收、转化成-2 价态的含硫化合物，这是一个同化
过程，最终被同化成有机代谢物储存起来，为自己所
用[1]。这条合成半胱氨酸的途径仅存在于植物和微生
物体内，与人体中半胱氨酸的合成途径是完全不同的。
硫是细胞内的重要组成成分，是维持细胞稳态所必需
的元素之一，存在于半胱氨酸、蛋氨酸、维生素、生
物素、硫胺素、辅酶 A 和一些次生化合物中。而且
硫元素在蛋白质的结构、性质及催化功能中发挥着重
要作用。例如，许多含硫化合物的含硫基团直接参与
到化合物的催化反应中；蛋白质中半胱氨酸残基参与
二硫键的形成；蛋氨酸是蛋白合成的起始氨基酸；蛋
氨酸及其衍生物还参与多种细胞生理生化反应。因此，
硫代谢在所有生物体中都发挥着至关重要的作用[2]。
植物和微生物利用丝氨酸乙酰转移酶(SAT)和
O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶(OASS)把环境中的无机
硫还原成−2 价的硫，参入到半胱氨酸中。半胱氨酸
的合成是通过两步反应完成的：第一步是在丝氨酸乙
酰转移酶（SAT）催化下，由丝氨酸和乙酰辅酶 A 合
成 O-乙酰丝氨酸（O-acetylserine, OAS)（反应式 1），
第二步是在 O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶(OASS)的催
化下，由 OAS 和 S2-合成半胱氨酸（反应式 2）[3]。
SAT 与 OASS 能够形成复合物，即半胱氨酸合成酶复
合体。
L-Serine + acetyl CoA → O-acetyl-L-serine(OAS)
+ CoASH (1)
OAS+sulfide→L-cysteine+acetate (2)
迄今为止，在拟南芥、西瓜、小麦、水稻、菠菜
等植物和大肠杆菌、结核分枝杆菌、嗜酸氧化亚铁硫
杆菌等微生物中的 SAT 和 OASS 都有较为深入的研
究[4]。植物对土壤中硫酸盐的吸收运输和同化代谢以
及含硫代谢产物的合成不但与植物的生长发育、抗逆
和抗病虫害等密切相关，而且影响农作物产量与品质。
过量表达 SAT、OASS 和同时表达这 2 个基因的转基
因植株能提高 OAS、半胱氨酸和谷胱甘肽（GSH）
的含量，改变其他代谢和酶的活性，并发现转基因植
物能够提高植物的抗氧化应激和重金属等非生物胁
迫[5]。
然而到目前为止，国内外对藻类的硫代谢研究鲜
有报道，我们对藻类的硫代谢有很多未解之谜，比如
藻类中的硫营养是如何吸收转运和同化的？硫营养
在藻类清除重金属毒害和有机毒物清除及代谢产物
转运中的作用是什么？硫对藻类的生长、产量及品质
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有什么影响？角叉菜属于红藻门杉藻科，是一种重要
的经济海藻，因为角叉菜不仅是卡拉胶生产的重要原
藻，而且近年来越来越多地应用于医药领域，引起人
们的广泛关注[6]。本文首次克隆得到角叉菜丝氨酸乙
酰转移酶的基因（cysE），并对其进行生物信息特征
分析，为探讨该酶在角叉菜硫代谢中的作用提供了实
验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
实验材料：角叉菜采自大连黑石礁海域。
菌株与质粒：质粒 pMD18-T 购自宝生物工程
（大连）公司；大肠杆菌 DH5、JM109、BL21 菌
株及原核表达载体 pET-22b(+)均为本实验室保存。
主要试剂：琼脂糖凝胶 DNA 纯化试剂盒、质粒
小量提取试剂盒、TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent
Kit 及 DNA Marker 等均购于宝生物工程(大连)公司；
引物合成及重组质粒目的基因测序由生工生物工程
(上海)股份有限公司测定；Trizol 试剂购自 GIBCO
BRL。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取和反转录
取新鲜角叉菜叶片组织置于研钵中，用剪刀剪碎，
加入少量液氮在研钵中进行研磨直至成为粉末状。快
速加入 1 mL Trizol 覆盖粉末，用锡箔纸盖好研钵，
避免接触空气，静置 10~15 min。待成雪糕状继续研
磨，直至研磨成透明液体，分装于 1.5 mL EP 管中。
室温静置 5 min，离心 12,000g，5min。小心取上清
至新离心管中。向上清中加入 1/5 体积氯仿，剧烈震
荡 15 s，待充分乳化后室温下静置 5 min。离心
12,000g，15 min，轻柔取上清层转移至新离心管中。
继续向上清中加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，
静置 30 min。4C，离心 12,000g，10 min，小心弃
上清，缓缓加入 1 mL75%乙醇，洗涤沉淀。离心
12,000g，5 min，小心去上清，室温下干燥后，用适
量 TE 或无 RNase 水溶解备用。使用 TaKaRa
PrimeScript
TM
RT reagent Kit，以总 RNA 为模板，以
Oligo dT 为反转录引物反转录合成 cDNA，反转录反
应的条件为：42C 60 min，70C 15 min，5C 5 min。
1.2.2 角叉菜 cysE cDNA 的获得
从本实验室构建的角叉菜 cDNA 文库中调取
cysE 的 EST 片段，将获得的 cysE 序列与其它同源性
较高的物种进行序列比对，得到保守的序列，使用
primers5.0 软件设计引物如下：
CysE-Fw, ATGCCTCAACGCCGTC;
CysE-Rev, CTAAATTGAGCTCCCGCC。
使用上述制备的 cDNA 作为模板，基因扩增 PCR
反应条件：94C 3 min，35 个循环 94C 30 s，55C 30
s，72C 1 min，最后 72C 下延伸 10 min。将所得的
PCR 产物用 1.0% 琼脂糖凝胶检测，并且克隆到
pMD18-T 载体进行 DNA 测序。
1.2.3 氨基酸序列分析、二级结构预测和功能注释及
系统进化分析
开放阅读框(ORF)分析使用 NCBI 在线预测软件
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）。信号肽
预测使用 SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services
/SignalP/）。跨膜结构预测使用 TMHMM Server v.2.0
在线软件。用 Inter-ProScan[7]，PSIPRED[8]，和 NCBI
conserved Domains Database (NCBI-CDD)基于序列相
似性分析角叉菜 SAT 蛋白的保守结构域进行预测。
使用 ClustalX 2.0 软件进行多重序列比对，构建系统
发育树的用 Neighbor-joining(NJ)法和 MEGA6.0 软件。
2 结果
2.1 角叉菜 cysE 基因克隆
电泳结果显示，PCR 产物大小约为 1100 bp，与
角叉菜 cysE 基因 CDS 区序列大小相符，表明角叉菜
cysE 全长 CDS 区扩增成功（图 1）。
图 2 显示角叉菜 cysE CDS 区全长 1143 bp，编码
380 个氨基酸，蛋白质分子质量预测为 40.6 kDa。角
叉菜 SAT 没有检测到信号肽和跨膜结构，不是以膜
蛋白存在。序列已被提交到 NCBI 数据库(序列号
KT963952)。

M: DL2000 DNA Marker; 1: PCR 产物
图 1 角叉菜 CysE PCR 扩增产物
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图 2 角叉菜 cysE 基因及其编码的氨基酸序列

2.2 二级结构预测和功能注释
SAT 是六肽乙酰转移酶家族的成员，其特征是具
有一个左手螺旋（LH）的保守结构域。该结构域
具有酶的活性位点及乙酰基结合位点和底物结合位
点。InterProScan, PSIPRED 和 NCBI CDD 预测角叉
菜 SAT 蛋白有 LH 结构域，属于六肽乙酰转移酶家
族（图 3）。
2.3 角叉菜 SAT 氨基酸序列分析及进化树分析
从 NCBI Protein 数据库中选择了其他 14 个物种
SAT 一起进行进化分析，物种及相似度见表 1。使用
ClustalX 对角叉菜 SAT 及其他物种氨基酸序列进行
多重序列比对，结果见图 4。将所有物种序列使用
ClustalX 序列比对后转入 MAGA 5 软件进行邻接法
系统发育树的构建（图 5）。结果表明，角叉菜 SAT
序列在结构域部位具有较高的保守性，且角叉菜 SAT
蛋白的进化顺序同物种进化相一致，介于细菌和高等
植物之间，处于藻类分支。



图 3 角叉菜 SAT 二级结构预测和功能注释

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表 1 角叉菜 SAT 与其他物种氨基酸序列相似度
物种 通称 GenBank 序列号 序列相似度()
Medicago truncatula 苜蓿 XP 013453581.1 64%
Chlamydomonas reinhardtii 莱茵衣藻 XP 001700405.1 55%
Triticum turgidum subsp 小麦 AGI 97005.1 54%
Rhodopseudomonas 红假单胞菌 WP 022722145.1 54%
Parvibaculum lavamentivorans 印度洋细小杆菌 WP 012111544.1 53%
Ensifer sojae 菽剑菌 WP 034854673.1 52%
Escherichia coli 大肠杆菌 WP 025670685.1 50%
Vibrio ichthyoenteri 弧菌 WP 006714773.1 50%
Enterobacter cloacae subsp. 阴沟肠杆菌 CBK 84290.1 50%
Citrobacter sedlakii 柠檬酸杆菌 WP 042286927.1 50%
Shigella boydii 志贺氏杆菌 WP 001277570.1 50%
Kluyvera ascorbata 克吕沃尔菌 WP 035894708.1 49%
Theobroma cacao 可可 XP 007046535.1 49%
Gossypium arboreum 棉花 KHF 98689.1 47%

完全一致的氨基酸残基用―‖表示，同源性较高和较低的分别用―：‖―.‖表示；黑框表示相同的氨基酸序列。
图 4 SAT 同源多重序列比对
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图 5 邻接法构建 SAT 系统发育树
3 讨论
在植物和微生物体内，半胱氨酸的水平是受到严
格控制的，一方面，半胱氨酸能够通过反馈抑制调节
SAT 来调控氨基酸的产量；另一方面，SAT 和 OASS
形成半胱氨酸合成酶复合体来调节细胞内硫酸盐吸
收和半胱氨酸合成[9]。SAT 氨基酸序列多重比对结果
表明，不同物种的 SAT 的 C 端第一个氨基酸并不保
守，而据文献报道大肠杆菌 SAT 的 C 端第一个氨基
酸（273 I）是参与半胱氨酸合成酶复合体形成所必须
的氨基酸，如果缺失或被替换为其它的氨基酸，将导
致 SAT 与 OASS-A 之间不能形成复合体[10]。然而通
过序列比对发现，有一些物种 SAT 的 C 端第一个氨
基酸并不是异亮氨酸，说明不同物种的 SAT 和 OASS
之间是否能形成复合体形式，以及复合体形成的机制
可能是不同的，这方面还需要做进一步深入的研究。
此外，虽然莱茵衣藻与角叉菜的亲缘关系较近，
但二者序列长度却有很大差异，莱茵衣藻的 cysE 基
因为1443 bp，编码480个氨基酸，比角叉菜多300 bp，
100 个氨基酸。尽管不同物种的 SAT 长度不同，但是
氨基酸序列 249-GETA-252，264-VTLGGTGK-271，
275-DRHPK-279 在各物种间都没有改变（图 3）。莱
茵衣藻与角叉菜的 SAT 之间在结构和功能上有何异
同还有待于进一步深入研究。
硫虽然不是藻类细胞的结构性组成元素，但它却
发挥极其重要的功能。硫酸盐是海水中硫营养的主要
存在形式，海洋植物可以把从海水中吸收的硫酸盐同
化 、 还 原 成 有 机 态 硫 的 贮 存 形 式 DMSP
(dimethysulfoniopropionate, β- 二甲基巯基丙酸内
盐)[11]。藻类硫营养代谢及调控是怎样的？其在逆境
胁迫中的生物学功能起哪些作用？对于这些问题，目
前还都不清楚。本研究首次克隆出角叉菜的 cysE 基
因，为下一步的高效重组表达、活性分析及其在含硫
氨基酸的合成应用方面奠定了研究基础。





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Molecular Cloning and Characterization of Serine Acetyltransferase from
Chondrus Crispus
ZHAO Pei-zhe, QI Dong-qing, ZHAO Chun-hui
*

（College of Life Sciences, Liaoning Normal University, Dalian 116021, China)
Abstract: Serine acetyltransferase (SAT) (EC 2.3.1.30) is one of the important enzymes involved in the sulfate
assimilation. SAT catalyzes the first reaction in the two-step enzymatic pathway of the biosynthesis of L-cysteine
from L-serine, the formation of O-acetyl-L-serine (OAS), which converts to L-cysteine in the second reaction. In this
study, the SAT gene (cysE) were obtained by gene cloning from the cDNA library of Chondrus crispus (GenBank
accession no. KT963952).The sequence analysis showed that the open reading frame of cysE was 1143 bp, encoding
380 amino acids with a predicted molecular mass of 40.60 kDa and the theoretical isoelectric point was 6.26. Amino
acid sequence analysis and phylogenetic analysis were carried out via bioinformatics methods, whichrevealed that
Chondrus crispus SAT shares high sequence homology with SAT of other species. The results obtained in the present
study lay the groundwork for the further study to understand the roles of SAT in the sulfate assimilation in Chondrus
crispus.
Key words: Chondrus crispus; serine acetyltransferase; molecular cloning; sulfate assimilation