全 文 ：　第 29卷第 2期　　　　　佳 木 斯 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )　　 Vol.29 No.2
　2011　年 03月　　　JournalofJiamusiUniversity(NaturalScienceEdition)　 Mar.　 2011
文章编号:1008-1402(2011)02-0306-05
林茜草细胞悬浮培养体系的优化条件研究①
梁丽娜1 , 　张跃华1, 2
(1.哈尔滨师范大学生命与技术学院, 黑龙江 哈尔滨 150025;2.佳木斯大学生命科学学院 ,黑龙江佳木斯 154007)
摘　要:　设计了三因子正交设计方法对影响林茜草悬浮细胞生长的相关因素进行了优化培养
筛选 ,筛选到适合于林茜草悬浮细胞体系生长繁殖的最佳培养条件:在含有 0.02的 5mg/L2, 4
-D、0.5mg/L的 6-BA、40.0g/L蔗糖的 B5培养基同时在 120rmins的摇床转速 , ,在该条件下培
养 20天 ,悬浮物中可分裂细胞密度可达到 4.4×105个 /mL;经过 60天的培养 ,悬浮细胞的分化
率可达到 95%以上.通过分析林茜草细胞对残糖的消耗规律 ,探讨了蔗糖浓度影响活细胞密度
的原因.
关键词:　林茜草;愈伤组织:细胞悬浮培养;碳源残留
中图分类号:　Q813.1+2　　　　文献标识码:　A
　　林茜草(Rubiasylvatica)是茜草科茜草属植
物 [ 1] ,主要分布在我国东北地区.国内学者侯柏
玲 、王素贤从该植物根的乙醇提取物中可分离得到
多种蒽酮和蒽醌类化合物 [ 2] ,其中数种为有潜在
活性抗肿瘤化合物.前期野外调查工作表明 ,林茜
草繁殖率低下 ,以及不合理挖掘和采收 ,其野外数
量逐年减少.为林茜草合理的开发利用 ,保护林茜
草自然资源 ,为人工保护地栽培林茜草提供相关基
础依据 ,建立林茜草组培的悬浮细胞系 ,并以此检
测细胞系的全能性 ,为植物生物反应器快繁林茜草
植株和生产蒽酮和蒽醌类等有效成分做好基础研
究.为林茜草植物细胞悬浮培养体系的优化 ,避免
由于蒽酮和蒽醌类导致的褐化现象 [ 3] ,设计三因
子正交设计方法对影响林茜草悬浮细胞生长的相
关因素进行了优化培养.对林茜草细胞悬浮培养体
系的建立以及林茜草细胞培养体系全能性进行系
统的相关检测的研究国内外文献尚未见报道.
1　材料与方法
1.1　材　料
林茜草原始苗株采自黑龙江省汤原县境内大
亮子河国家原始森林公园 ,并移栽部分植株于黑龙
江省佳木斯大学四区植物园内.研究材料经沈阳药
科大 学 鉴 定 , 为 茜 草 科 林 茜 草 (Rubia
stylaratory).林茜草原始愈伤组织来源于幼嫩茎
经改良 White1 /2固体培养基上经过 3代培养形成
的生长相对旺盛 、疏松且较为易碎的三种颜色分别
白色 、黄色至橙黄以及淡红色 3种新鲜愈伤组织.
1.2　林茜草细胞悬浮体系的创建
在无菌条件下用消毒的枪状镊子取约 1.5 ～
2.0g愈伤组织接种到内部盛有约 40 mL液体培养
基的容量为 200 mL三角培养瓶中 ,用无菌枪状长
柄镊子温和地将接种物捣碎 ,接种后置于旋转摇床
弱光振荡培养 ,光强 500 ～ 800lux,摇床转速为 80
～ 120rmins,温度 25℃.8 ～ 10d后 ,将培养的悬浮
物物用无菌 、经过火焰钝化处理 80目的不锈钢镍
网过滤 ,滤液在过滤过程结束后稍置片刻 ,待林茜
草悬浮细胞以及细胞团微小颗粒团状物沉淀后 ,小
心撇去上部澄清培养液 ,然后再接入新鲜配制的
1/2浓度培养液持续培养.10 ～ 15d后 ,用 80目经
过同样处理的不锈钢镍筛网过滤培养体系 ,澄清的
滤液用上述的同样方法进行培养基更换 ,再继续进
行液体培养 ,重复 3次 ,即可获得颗粒分散一致的 、
培养时间一致的林茜草细胞悬浮体系.
① 收稿日期:2011-02-16
基金项目:黑龙江省卫生厅科学技术研究项目课题部分内容(2007-511).
作者简介:梁丽娜(1989-),女 ,黑龙江哈尔滨人 ,哈尔滨师范大学生命与技术学院生物科学系.
第 2期 梁丽娜 ,等:林茜草细胞悬浮培养体系的优化条件研究
1.3　林茜草细胞悬浮培养条件的正交实验设计
以林茜草悬浮体系培养 15d的活细胞在单位
体积内的数量为考察标准 ,选用 L16(45)的设计数
学模型对林茜草细胞培养悬浮体系的培养条件的
进行优化选择(见表 1).根据预备试验获得的数据
设计安排分组实验 ,每个试验组接种林茜草悬浮细
胞 2瓶 ,每个实验组均重复 2次 ,实验结果取算术
平均值.
表 1　林茜草细胞体系筛选各个相关 L16(45)因子水平表
水平 A培养基
B
蔗糖(g/L)
C
2, 4-D(mg/L)
D
6-BA(mg/L)
E
转速(r/min)
1 N6 20.0 0.010 0.10 80.0
2 B5 30.0 0.025 0.50 100
3 Ms 40.0 0.050 1.00 120
4 SH 50.0 0.100 2.00 140
1.4　林茜草活力细胞密度和活细胞率的测定
活力林茜草细胞密度测定采用上海医用光学
仪器二厂生产的医用血球计数板测定和计数.
林茜草(活力)细胞密度 cfu/mL:(个 /mL)=
25个方格(有活力)细胞总数 ×104 ,以上实验重复
5次 ,测定结果取算术平均值.
细胞活性测定参考文献 4采用亚甲基兰检验
方法:取 0.50%亚甲基兰的等渗 0.9%的生理盐水
溶液与林茜草细胞悬浮体系以 1:2混合 ,用无菌
的 4mm直径的玻璃棒轻轻搅拌 ,约 5min后 ,用无
菌玻璃棒蘸取适量混合液置于血球计数板的计数
台上计数 ,以林茜草悬浮体系内细胞个体内呈现出
淡淡的浅紫色染色轮廓的为有活力细胞 [ 4] .
林茜草细胞悬浮体系中活细胞率的计算公式
=(有活力细胞数量 /能观察到总细胞的数量)×
100%[ 4] .
1.5　林茜草悬浮细胞的分化
摇床培养的林茜草悬浮细胞每 20d继代一次 ,
培养继代细胞 3个循环后 ,用过 80 ～ 100目不锈钢
镍网过滤 ,将滤取物用无菌镊子取约 0.5g,体视显
微镜测计数愈伤组织个数 , 接入 MS分化培养基
中 ,培养基中附加 IAA,并将其浓度调整至 0.20mg/
L,培养 30d后 ,计算分化率 ,每次接 30个外分化体 ,
以上实验步骤重复 5次 ,结果取算术平均值.
1.6　培养液中残糖的测定
培养基中残留单糖和双糖(以总糖计算)依据
文献 [ 5]采用蒽酮法测定:在接种室无菌环境中 ,
用经过消毒的移液器在超净工作台取约 1.0mL上
清液测定.
2　结果与讨论
2.1 　愈伤组织的诱导和继代
取林茜草幼嫩茎 , 75%酒精表面灭菌 2mins,
0.l%HgCl2溶液浸泡 2.0min,然后用无菌蒸馏水
冲洗少量约 5次 ,弃去茎段两端 0.5cm左右的长
度 ,将其余部分小心用锋利的无菌剪刀切成 1.0 ～
1.5cm的茎段 ,接种于配方为 MS+0.10mg/L的
2, 4D+0.50mg/L的 6 -BA,培养约 30d后 ,当颜
色呈现浅黄至橙黄色的愈伤组织包覆整个林茜草
的培养茎段.再将愈伤组织转移到培养基配方为
MS+0.05 mg/L的 2, 4D+0.5 mg/L的 6 -BA上
继续继代培养 ,经过 3 ～ 5代继代 ,每代持续 25 ～
30d,可以观察到绵白色的 、黄色至橙黄色(图 1)以
及淡红色 3种特性的林茜草新鲜愈伤组织团.林茜
草的绵白色愈伤组织团结构较为松软 ,色泽淡白 ,
但是整个体系呈水渍形态 ,且后期培养进程中易于
褐化(见图 1);而黄色至橙黄愈伤组织以及淡红色
愈伤组织在培养进程中颜色和质地逐渐发生变化 ,
其结构趋于致密 ,而淡红色愈伤组织整个组织体系
质地逐渐坚硬 ,最后趋于褐化(见图 3).
2.2　林茜草细胞悬浮体系的建立及其相关影响因素
2.2.l　三种林茜草愈伤组织对林茜草悬浮细胞体
系建立的影响筛选
分别以林茜草的白色 、黄色至橙黄和淡红色三
种愈伤组织为接种材料 ,接入液体培养基配方为
MS+0.05 mg/L的 2, 4D+0.50 mg/L的 6-BA液
体培养基 ,在往复式摇床低速 80 ～ 140rmins的转
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佳 木 斯 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 2011年
速范围内 ,弱光关照下摇瓶培养.林茜草细胞悬浮
培养每个周期为 20d,然后转移至无菌接种室中无
菌手段取样 ,采用亚甲基蓝氏方法测定培养林茜草
悬浮细胞体系的密度以及活细胞率 ,结果见表 2.
表 2　不同林茜草愈伤组织对悬浮细胞体系
　　　　密度和活力细胞率的影响
愈伤组织形态 培养周期(d) 细胞密度(104cfu/mL)
活力细胞率
(%)
绵白色愈伤组织 20 52 43.0
黄色至橙黄愈伤组织 20 43 93.0
淡红色愈伤组织 20 38 90.0
　　在林茜草悬浮体系建立过程中可观察到 ,林茜
草分化得到的绵白色愈伤组织同其他两种颜色相
比较 ,黄色至橙黄色以及淡红色愈伤组织比较而
言 ,更易建立是林茜草悬浮细胞体系 , 但是 3 ～ 5
天 ,整体培养液体系即呈现浑浊现象 ,林茜草外植
体获得的绵白色愈伤组织的细胞在液体培养进程
中很容易发生褐化现象 ,在液体培养 10 ～ 15 d,林
茜草细胞液体培养体系的颜色即呈现灰褐色 ,培养
约 20d,林茜草细胞液体培养体系颜色呈现黑褐
色.从表 2观察到 ,培养 15d后 ,其悬浮系的细胞密
度是高达 5.1 ×105 ,远高于黄色至橙黄以及淡红
色其他两种林茜草悬浮体系的细胞密度 ,但是细胞
自溶率达 57%,远高于黄色至橙黄色以及淡红色
的其他两种林茜草细胞悬浮培养体系 7%和 10%
的自溶率.选用林茜草外植体获得的黄色至橙黄色
愈伤组织建立的林茜草细胞悬浮体系的细胞密度
较高 ,活力细胞率亦较为理想;而林茜草外植体获
得的淡红色愈伤组织转移到 1/2浓度分化培养基
上后 ,直接分化完整的林茜草植株的分化率可达到
80%,而黄色愈伤系分化率(15%)却远远低于红
色愈伤组织的液体细胞浓度.林茜草外植体获得淡
红色愈伤组织接种于 1/2液体培养基 , 3 ～ 5d,即可
获得质地分散均一 、细胞团粒完整一致 、生长速度
较为理想的林茜草液体细胞悬浮培养系.基于对各
种因素的综合权衡 ,认为选取林茜草外植体获得淡
红色愈伤组织作为建立悬浮系的较为理想的繁殖
样本.
2.2.2　林茜草细胞悬浮体系创建中几种不同影响
因子的影响
依据正交实验中的各种因素以及影响水平组
合进行计算 ,得到 16组林茜草细胞悬浮培养活性
细胞密度值的影响(见表 3),依据林茜草细胞悬浮
培养中获得实验数据分别对 16种处理的林茜草悬
浮细胞培养体系的细胞密度做极差分析 ,结果如表
4所示.
表 3　正交实验结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1.8 3.0 2.4 0.9 4.2 3.2 3.4 3.0 1.3 3.1 2.0 2.3 2.6 1.0 1.4 2.9
表 4　不同活细胞密度的极差分析
K0 A细胞密度 , 105 /mL
B
细胞密度 , 105 /mL
C
细胞密度 , 105 /mL
D
细胞密度 , 105 /mL
E
细胞密度 , 105 /m
K1 8.4×105 9.9×105 9.8×105 8.7×105 9.0×105
K2 13.8×105 10.4×105 10.7×105 10.6×105 10.5×105
K3 8.3×105 9.3×105 7.8×105 12.5×105 10.7×105
K4 7.9×105 9.1×105 10.0×105 6.8×105 7.8×105
K5 2.2×105 2.6×105 2.6×105 2.0×105 2.4×105
K
6 3.4×105 2.6×105 2.8×105 2.7×105 2.8×105
K7 2.0×105 2.4×105 1.8×105 3.2×105 2.8×105
K8 1.8×105 2.3×105 2.4×105 1.7×105 2.1×105
K9 1.7×105 0.4×105 0.9×105 1.5×105 0.8×105
　　根据表 4的数据计算得知 , A因于极差最高 ,
D因子次于 A,依次是 C因于和 E因子 ,而 B因子
为最低.以上推测结果反映出:2, 4-D对林茜草悬
浮活性细胞密度影响最大 ,依次为蔗糖 、培养基的
类型和摇床的回转转速 ,植物激素 6-BA浓度的
影响最低.从实验数据分析表明 ,各因子水平均值
x可发现 , A因子位于第 2水平 、B因子次于第 2级
水平 、C因子排位于第 2水平 、D因子位于第 3水
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第 2期 梁丽娜 ,等:林茜草细胞悬浮培养体系的优化条件研究
平 、E因子最大 ,位于第 3水平 ,属于绝对性因素;
因此 ,林茜草细胞悬浮培养体系最佳的条件依次
是:含有 0.025 mg/L的 2, 4D、0.50 mg/L的 6 -
BA、 40.0 g/L的蔗糖的 B5培养基和 120r/min的
转速相配合.依据以上相关因子构成 ,对林茜草细
胞悬浮培养体系的组合 ,细胞悬浮培养 15d后统计
经过计算统计 ,林茜草细胞悬浮培养体系中活力细
胞密度可达到 4.4×105cfus/mL.
2.3　悬浮细胞系的分化
在优化条件下(含有浓度为 0.025mg/L的 2,
4D、浓度为 0.50 mg/L的 6-BA、浓度为 40.0g/L
的蔗糖的 B5培养基和 120rmins的转速)经过 60d
的悬浮弱光培养 ,林茜草细胞悬浮培养体生长逐渐
加速 , 5h后即可形成肉眼可观察到较大的完整的
细胞团聚体.将分化获得的林茜草细胞团聚体计
数 ,在无菌条件下 ,用加样枪转入林茜草植株的固
体分化培养基中 ,在 800-100lux的全光谱光照培
养下 ,在其分化生长出出完整的林茜草微型植株 ,
林茜草细胞悬浮培养体系的的愈伤组织的植株分
化率达 95%以上.林茜草黄色至橙黄色愈伤组织
形成细胞悬浮体系系生长快 ,分力能力高 ,说明林
茜草黄色至橙黄色愈伤组织细胞悬浮培养体系的
优化是比较理想的(见图 3),可以用于中试和扩大
繁殖商业种苗(见图 3).
图版说明
图Ⅰ 　林茜草细胞培养的绵白色愈伤组织;图Ⅱ　林茜草细胞培养的黄色至橙黄色愈伤组织;
图Ⅲ　林茜草黄色至橙黄色愈伤组织细胞悬浮培养体系;
图Ⅳ　林茜草黄色至橙黄色愈伤组织细胞悬浮培养体系获得的用于中试和扩大繁殖商业种苗.
2.4　林茜草细胞悬浮培养体系中蔗糖不同浓度在
细胞培养液中残留
　　林茜草细胞悬浮培养体系中的碳源以蔗糖为
主要构成 ,蔗糖在被利用过程中首先在载体的作用
下 、修饰并转运通过植物细胞壁和细胞膜上的转化
酶进行磷酸化 ,然后运输至细胞膜内 ,植物细胞在
悬浮培养进程中 ,植物细胞优先选用葡萄糖作为其
代谢的能源 ,在葡萄糖降解殆尽 ,其浓度阈值低于
酶的极限值状况下 ,才开始利用果糖 [ 6] .20.0g/L
蔗糖难以保证林茜草悬浮细胞体系的正常繁殖生
长 ,其代谢过程中表现为对数生长期可资利用的单
糖浓度业已降低到其利用的阈值 ,在细胞繁殖的对
数生长期结束前碳源已经降低到阈值之下 ,根本无
法满足林茜草细胞悬浮体系的正常生长 [ 7] ;30.0g/
L基本上可以满足林茜草细胞繁殖体系的需求;
40.0g/L的蔗糖上不但可以满足林茜草细胞生长
的需求 ,而且可以有适量的储备 ,同时其浓度可以
辅助调控细胞体系的渗透压 ,保证悬浮体系中愈伤
组织颗粒的密度和硬度适中 [ 8] ;50.0g/L蔗糖已过
量 ,对于生长期的林茜草细胞繁殖体系而言 ,渗透
压过高 ,在植物细胞培养进程中对数生长期即将停
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佳 木 斯 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 2011年
滞时还有约 10%总糖残留 (包括蔗葡萄糖和果
糖),从而表现出植物细胞悬浮培养体系过程中基
质的抑制 ,使得林茜草细胞培养体系活细胞密度最
减小.
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OptimizationofCelSuspensiongCultureProtocolofRubiaSylvatica
LIANGLi-na1 , 　ZHANGYue-hua1, 2
(1.ColageoflifeandTechnology, DepartmentofBiology, HarbinNormalUniversity, Harbin150025, China;2.ColageofLife
ScienceandTechnology, JiamusiUniversity, Jiamusi154007, China)
Abstract:　Bytheorthogonaldesign, thefactorsinfluencingsuspensionscelsgrowthofRubiasylvatica
werestudied, andthebestculturesconditionswhichweremediasupplementedwith40.0g/Lsucrose, 0.025mg/
L2, 4-D, 0.50 mg/Lof6-BA, andtherotatingspeedsof120rminsweresifted.After20daysofculture, the
densityofsurvivingcelscouldreachashighas4.4×105 cfus, anddiferentiationrateofsuspensioncelscould
surpass95% after60 daysofsuspensionculture.Thecauseofefectsofsucroseconcentrationonthedensityof
survivingcelswasdiscussedthroughtheanalysisoftheconsumptionruleofsurplussucrose.
Keywords:　rubiasylvatica;calus;celsuspensionculture;carbonsourceresidue
(上接 305页)
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AMethodtoGenerateBézierSurfacefromtheBoundary
XIASong-yang
(SchoolofMathematics, HefeiUniversityofTechnology, Hefei230009, China)
Abstract:　Amethodtogeneratetensor-productBeziersurfacepatchesfromtheirboundaryconditions
andwithtangentconditionsalongboundarycurveswerepresented, basedontheTriharmonicequation:theexist-
enceanduniquenessofthesolutionofΔ3 x=0 withprescribedboundary, andarbitrarythreeadjacenttothe
boundarycontrolpointsofan×nBézierweregiven.Thus, althecontrolpointsoftheBéziersurfacewereob-
tain.
Keywords:　TriharmonicBéziersurface;Laplacianoperator;boundarycontrolpoint;Bernsteinbasis;
PDEfreeformsurface
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