全 文 ：　第 28卷第 6期　　　　　佳 木 斯 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )　　 Vol.28 No.6　2010　年 11月　　　JournalofJiamusiUniversity(NaturalScienceEdition)　 Nov.　 2010
文章编号:1008-1402(2010)06-0962-04
林茜草愈伤组织诱导与组培苗的快速繁殖研究①
张跃华 , 　施中凯 , 　杨国坤 , 　谷风丽 , 　秋梦颖
(佳木斯大学生命科学学院 ,黑龙江佳木斯 154007)
摘　要:　研究林茜草的茎段培养分化技术 ,探索林茜草快速繁殖适合培养条件;摸索出诱导林
茜草愈伤组织的最佳培养方法 ,为林茜草人工栽培用以提取其所含代谢药用成分的工业化生产
提供原材料.根据植物组织培养方法 ,将林茜草茎段用不同浓度的生长调节剂培养基配方培养 ,
使其诱导林茜草的茎 、叶 、进行愈伤组织诱导.结果表明 , MS+2.4-D2mg· L-1 +KT0.1mg·
L-1培养基适于诱导愈伤组织发生;MS+6-BA1.5mg· L-1培养基可诱导林茜草茎段能迅速分
化为幼苗;MS+2.4-D2mg· L-1 +KT0.1mg·L-1培养基与 MS+6-BA1.5mg· L-1培养基先
后使用 ,可诱导林茜草生根形成完整植株.
关键词:　林茜草;愈伤组织;植物组织培养;增殖
中图分类号:　Q949.781.1　　　　文献标识码:　A
　　林茜草 (Rubiasylvatica)系茜草科茜草属植
物 ,主要分布在我国东北地区 ,其分布区域狭小且
分散.关于该属植物林茜草的化学成分 ,国内学者
侯柏玲 、王素贤对东北产的林茜草进行了化学成分
的研究 [ 1] .从该植物根的醇提取物中分离得到 11
种化合物 ,分别为 5-羟基 -萘并 [ 1, 2-b]呋喃 -
4-羧酸甲酯(Ⅰ ),大叶茜草素(Ⅱ)、1-羟基 -2
-甲基蒽醌 (Ⅲ)、 β -谷甾醇 (Ⅳ)、胡萝卜甙
(Ⅴ)、1 , 3, 6-三羟基 -2-甲基蒽醌 -3-O-(6
-乙酰基)新橙皮糖甙(Ⅵ )、1 , 3, 6-三羟基 -2-
甲基蒽醌 -3 -O新橙皮糖甙(Ⅶ )、萘酸双糖苷
(Ⅷ)、1 , 3, 6-三羟基 -2-甲基蒽醌 -3-O-(3 ,
6 -O-二乙酰基)-α-鼠李糖 -β -D-葡萄糖
苷(Ⅸ )、1, 3, 6 -三羟基 -2-甲基蒽醌 -3-O-
(4 , 6 -O-二乙酰基)-α-鼠李糖 -β -D-葡萄
糖苷(Ⅹ )、1, 3, 6-三羟基 -2-甲基蒽醌 -3-O
-β -D-葡萄糖苷(Ⅺ).林茜草根的乙醇提取物
在北方民间验方中对老年性某些疾病有较好的临
床应用疗效.由于林茜草属多年生草本 ,自然状态
下生长生物量稀少 ,生长缓慢 ,野生资源趋于枯竭.
为保护林茜草野生资源 ,实现林茜草的保护地栽
培 ,进行林茜草的愈伤组织诱导及快繁的研究 ,就
显得更为迫切和重要.而有关林茜草的组织培养研
究鲜见报道.
1 　材料与方法
1.1　材　料
林茜草采自黑龙江省汤原县境内大亮子河国
家原始森林公园 ,并移栽部分植株于黑龙江省佳木
斯大学四区植物园内.研究材料经鉴定 ,为茜草科
林茜草(Rubiastylaratory).
1.2　实验方法
培养基按不同用途编号如下:
A.MS+2.4-D1.5mg·L-1 1+KT0.1mg·L-1;
B.MS+2.4-D2 mg· L-1 +KT0.1mg· L-1;
C.MS+6-BA1mg·L-1;
D.MS+6-BAI0.5mg·L-1;
E.MS+6-BA1.0mL-1 +NAA0.5mg· L-1;
F.MS+6-BA2.0mg· L-1 +NAA2.0mg· L-1;
G.MS+6-BA2.0mg·L-1 +NAA0.1mg· L-1;
H.MS+6-BA0.5mg·L-1 +NAA0.01mg· L-1;
I.MS+NAA0.2mg·L-1;
J.1/2 MS+NAA0.2mg· L-1;
K.MS+6-BA2.0mg·L-1 +NAA0.5mg· L-1;
① 收稿日期:2010-09-07
基金项目:黑龙江省卫生厅科研课题(2007-511).
作者简介:张跃华(1962-),男 ,黑龙江佳木斯人 ,佳木斯大学生命科学学院高级实验师 ,在读博士.
第 6期 张跃华 ,等:林茜草愈伤组织诱导与组培苗的快速繁殖研究
L.MS+6-BA3.0mg· L-1 +NAA0.01mg·L-1;
M.MS+NAA0.5mg· L-1;
N.MS基本培养基.
以上培养基均含 1.5%蔗糖 、0.8%琼脂 , pH
值为 6.5 ～ 7.5.其中 A号 、B号为愈伤组织诱导培
养基 , C～ H号为幼苗增殖培养基 , I～ N号为生根
培养基.将林茜草茎段和根茎先用流水冲洗干净 ,
然后置于超净工作台上对其进行消毒处理.先于
70%酒精中浸泡 10s,再用 0.1%HgCl2浸泡 2min,
最后取无菌水冲洗 5次.将消毒后的林茜草茎段 、
叶片和根 ,接种到愈伤诱导培养基中;将部分茎段
接种到增殖培养基中;取 3cm长的增殖幼苗 ,接种
到生根培养基中.培养温度为 25±1℃,光照 8h·d
-1,光照强度 800 ～ 1 000lx.
2　结果与分析
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佳 木 斯 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 2010年
2.1　愈伤组织的诱导
茎段和叶片在 A号培养基中 7d开始形成愈
伤化组织.B培养基接种第 10天后开始形成愈伤
组织 ,且都发生在剪切部位和分裂旺盛部位.根茎
在 A号 、B号培养基中均未观察到愈伤化组织.愈
伤组织颜色褐黄 ,质地致密.4w后 ,在 B号培养基
中愈伤组织的产生的生物量明显高于 A号培养
基.此时愈伤组织有褐化现象 ,颜色转变为棕褐色 ,
分裂速度减慢.将褐化的愈伤组织块切除 ,其余组
织切成小块后转入暗培养 8d后 褐化减轻 ,分裂速
度加快 ,愈伤组织生成量亦增大.E号 、F号培养基
中茎段的基部亦可观察到愈伤组织形成(见图 1).
长期观察结果可知 ,褐化现象同其他处理比较少 ,
但是组织仍然致密 ,分裂速度慢于愈伤诱导培养基
的诱导 ,染色为淡黄色.I号 、J号培养基中茎段基
部愈伤化程度较慢 ,长期培养后褐化现象比 E号
培养基明显.N号培养基中 ,茎段基部的愈伤组织
颜色较深 ,生长较快.
2.2　组培苗的增殖培养
继代培养时 ,使用 C～ H号培养基 ,幼苗苗在
各培养基中生长状况参差不齐.由表 1统计数据表
明 ,诱导苗的增殖配方采用 D组培养基较为理想.
取长度约 2cm长的幼苗移入 I号 、J号培养
基 ,经 30d后 ,可观察到基部发生愈伤化 ,但未见根
分化 ,且愈伤组织增殖速度同直接愈伤诱导更加缓
慢.愈伤组织呈淡黄色 ,致密.苗健壮 ,颜色墨绿 ,仍
在生长.转入 K号 、L号 、M号培养基中 , M号培养
基中愈伤组织体积加大 ,但未发现有根分化.K号 、
L号培养基中苗基部褐化现象严重 ,同样未观察到
有生根现象.在诱导愈伤组织的 B号培养基中培
养 20d的林茜草茎段 ,转入 D号培养基中培养 ,
30d后发现有根生长 ,根出于茎段基部 ,非愈伤组织
诱导生出根(见图 4).同样在 N号培养基中也未见
有根生成.当根长至 2cm以上时 ,打开瓶口炼苗 3d,
并移栽于消毒的 3:l混合的砂石和珍珠岩基质中 ,
并覆盖塑料薄膜 , 8d后即可去掉塑料薄膜 , 10d后定
植于消毒的土壤中 ,成活率达 75%以上(见图 6).
3　讨　论
1)不同外植体对激素的反应与材料本身的生
理状态 、以及内源激素的合成和代谢上的差异有密
切关系 [ 2] .在实验结果表明 , 林茜草茎尖 、叶腋培
养后优先形成愈伤组织 ,随后在茎段剪切端 、叶片
破损处形成愈伤化组织 ,根茎经 30d后可见形成愈
伤化组织 ,表明组织分裂旺盛的部位更易于产生愈
伤化组织 ,剪切受损的部位易于愈伤化 ,地上部分
比地下易于愈伤化.造成这种差异的原因与不同外
植体中所含的内源细胞分裂素与生长素的绝对含
量和相对比值不同有一定的相关性 [ 3] ,所以 ,在进
行林茜草愈伤组织诱导时 ,选材应优先选用茎尖 、
叶腋等组织分裂旺盛的部位.
表 1　NAA和 6-BA不同组合对林茜草
　　　　诱导愈伤组织的影响
组别 生长调节物质组合NAA 6-BA
接种
个数
诱导
苗数
诱导发
生率% 备注
C 0 1.0 40 27 75 +
D 0 1.0 36 30 83.3 ++
E 0.5 1.0 40 30 75 +
F 2.0 2.0 38 27 71 -
G 0.1 2.0 39 21 53.8 -
H 0.01 0.5 37 18 48.6 --
2)光照条件对林茜草愈伤组织的影响.在 3 ～ 4w
的光照培养下 ,愈伤组织发生褐化 ,分裂停滞 ,而转
入暗培养 ,褐化减缓 ,继续分裂.说明光照对愈伤组
织生长具有抑制作用 ,其细胞在生长分裂时分泌某
些蒽醌类生物活性物质被空气氧化有关.因而林茜
草愈伤组织的培养应以暗培养为宜.
3)几种植物生长激素对林茜草愈伤组织形成
的影响有显著不同.在实验中 ,培养材料在 A号 、B
号培养基培养条件下同 I号 、J号培养基条件下相
比愈伤组织增殖速度快且数量亦多 ,表明 2.4-D
诱导林茜草形成愈伤化组织的效果优于 NAA.对
能够诱导形成愈伤组织的几组培养基的配方比较
可知 ,在含有 6-BA的 E号 、F号培养基中 ,愈伤
组织可长期继代培养 ,并且褐化现象较轻.其原因
与 6-BA可能延缓愈伤组织的衰老有关 [ 4] ,因而
亦减缓或抑制了愈伤组织的褐化现象.由表 1可看
出 , 6-BA在 1.0 ～ 2.0mg·L-1浓度时 ,其分化幼
苗的生长随 6-BA浓度的提高而生长速度加快;
NAA则对幼苗生长的速度呈现抑制作用.当浓度
达 0.5mg· L-1时现象更为明显.同时 ,由表 1还可
得出如下结论:6-BA浓度在 1.0 ～ 1.5mg·L-1时
对侧芽诱导分化作用较小 ,增加 NAA后其亦变化
不大.侧芽分化可能与更多的激素在林茜草组织内
的合成 、运输 、分泌以及分布有关联 [ 5] .
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第 6期 张跃华 ,等:林茜草愈伤组织诱导与组培苗的快速繁殖研究
4)几种植物生物调节剂对根的诱导的影响.
第 I号 ～ N号培养基配方均可诱导愈伤组织分化 ,
其中 I号 、M号培养基均可以用以培养愈伤分化幼
苗;效果较为理想 ,但其配方均不适于诱导根的分
化形成;说明该浓度下 NAA不适合于林茜草幼苗
根的分化形成.在愈伤诱导培养基 B号内培养的
林茜草茎段 , 10d后转入 D号培养基中培养.1个
月后即可生出健壮的根.MS+2.4-D2.0mg· L-1
+KT0.1mg· L-1培养基 ,适宜林茜草愈伤组织的
诱导 ,而 MS+6-BA0.5mg· L-1培养基适于林茜
草幼苗增殖培养 ,两种培养基先后使用可诱导幼苗
生根 ,移栽后成活较高.而对于林茜草叶片 、茎段诱
导的愈伤组织形成的幼苗发育成的植株 ,同自然界
中生长的植株相比 ,其有效药用成分的含量和变
化 ,有待进一步深入研究.
参考文献:
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-241.
StudyonTissueCultureandRapidPropagationofRubiasylvatica
ZHANGYue-hua, 　SHIZhong-kai, 　 YANGGuo-kun, 　GUFeng-li, 　QIUMeng-ying
(ColegeofLifeScience, JiamusiUniversity, Jiamusi154007, China)
Abstract:　ThebiotechnologyofculturingRubiasylvaticastemsanditsbestconditionwerestudied.The
bestwaytoinducecalusofRubiasylvaticawasresearch.Thebiotechnologyofplanttissueculturewasusedto
culturestemsofRubiasylvaticaondiferentmedium, whichwasinducedtoformthewholeplants.Thestems
andleaveswereputintoinductionmediatoinducecalus.TheinductionofcaluswasbestonMSmediumwith
theadditionofMS+2.4-D2mg· L-1 +KT0.1mg·L-1.ThemultiplicationofthemwasbestonMSmedium
withtheadditionof6-BA1.5mg·L-1.ThegrowthofrootswasbeterfromMSmediumwiththeadditionof2.
4-D2mg·L-1 +KT0.1mg· L-1 toMSmediumwiththeadditionof6-BA1.5mg· L-.
Keywords:　Rubiasylvatica;calus;cultureofplanttissue;propagation
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