全 文 ：第 7卷 第 3期
2 0 0 0 年 1 0 月
中 国 水 产 科 学
JOU R NA L OF FI SHE RY SCIE N CE S OF CH I N A
V o l
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7 N o
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3
O e t
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2 0 0 0
文章编号 : 100 5 一 8 7 3 7 ( 2 0 0 0 ) 0 3 一0 0 8 0 一 0 5
角叉菜凝集素的分离纯化及其性质
李丹彤 , 崔铁军 , 马国庆 , 汤 霞 , 李熙宜
(大连水产学院 养殖系 , 辽宁 大连 1 1 6 0 2 3)
摘 要 : 角又莱 ( hC on d ur : oce l lat u : )经磷酸盐缓冲液抽提 , 20 % 一 75 %硫酸按分级沉淀 , 牛甲状腺球蛋白一
se p ha osr
e
4B 亲和层析 , 可以从红藻角叉菜中纯化出角叉莱凝集素 ( CO )L , 在 PA GE 上显示单一蛋白染色带 , 在等电聚焦电泳上显示单一蛋白染色带 , 其 IP 为 8 . 30 。 纯化后的 C O L 的最大紫外吸收峰在 28 5 n m , 用
eS p ha de
x G一 20 0 分子筛层析刚得其分子量为 4 25 2 。 该凝集素可以凝集人的 A 、 B 、 BA 、 0 型红细胞 , 且凝集
活性相同 , 在对人 、 兔 、 鲤 、 铆的红细胞的凝集作用中 , 对兔红细胞的凝集作用最强 , 且不被 己浏试的 D 一半乳
糖 、 D 一果糖 、 D 一甘露糖 、 葡萄糖 、 蔗糖 、 甘露聚糖 、 y 一球蛋白 、 卵清蛋白所抑制 , 仅被牛甲状腺球蛋白抑制 , 最小
抑制质量浓度为 3 . 10 m g / m lo
关键词 : 角叉菜 ;凝集素 ; 纯化 ;理化性质
中图分类号 : Q 946 . 1 文献标识码 : A
凝集素是非免疫起源 的蛋白质或糖蛋白 , 具有
凝集细胞 、 抑制肿瘤细胞增殖 、 激活淋巴细胞 、 抑制
血小板凝集等多种功能的生物活性 。
凝集素被发现已有百余年 , 但直到 20 世纪 40
年代才开始为人们所关注 。 自 70 年代后期 , 海洋生
物 (海藻 、 无脊椎动物 、 鱼类 )凝集素不断被提取 、 纯
化 。 对其性质也逐步有所了解 , 并发现海洋生物凝
集素的生物活性不逊于植物凝集素 。 目前 , 已证实
多种海藻中存在凝集素 , 但成功地进行分离纯化的
却不多 , 据掘 贯治川报道仅有 10 种绿藻和 13 种
红藻的凝集素被分离纯化 , 且从其中 5 种红藻中得
到的只是部分纯化制品 。 与其它生物凝集素相 比 ,
有关海藻凝集素的信息很少 , 其 比较生物化学研究
尚属 空 白。 主要是研究条 件 、 提纯方 法困 难所
限 [` 〕。
经对大连地区一些藻类凝集素进行筛选 , 发现
角叉菜 ( hC on d ur : co el at u : )生物量较大 , 且凝集活
性较高 , 而目前在国内外尚未见到有关角叉菜凝集
素 ( C O L )的研究报道 , 本研文首次成功地采用牛 甲
状腺球蛋 白一eS p ha ~ 4 B 亲和层析方法对其纯化 , 并研究其性质 , 以期为海洋药物开发及海产经济
动物病害防治开拓一条新途径 。
收稿日期 : 2 0 0 0 一0 1一 2 6
基金项目 :农业部八五一青年基金资助项 目 (渔 85 一 93 一青 0 5)
作者简介 :李丹彤 ( 1 9 65 一 ) , 女 , 大连水产学院硕士 , 讲师 , 从事生物
化学专业研究 .
1 材料与方法
1
.
1 材料
角叉菜于 1 997 年 5 月采 自大连小平岛耗子洞
海岸 , 兔购于大连医科大学实验动物中心 , 人的 A 、
B
、
A B
、
O 型血液由健康学生 、 教师提供 。
牛 甲状腺球蛋白 , 酵母甘露聚糖 ( s i g m a ) ; c N -
s e p h a or
s e 4 B
,
eS ph
a d e x G
一
2 0 0
, 蓝 色葡聚糖 ( B l u e
D e x t r a n 2 0 0 0 )
, 核糖核酸酶 ( P h a r m a e ia ) ; 下一球蛋 白
( h u m a n
,
S e r v a ) ; A m p h o l i n e p H 3
.
5 一 9 . 5 等其它在
等电聚焦 电泳上均采用 L K B 产品 ; 牛血清 白蛋白
(上海浦江应用生物化学研究所 ) ;卵清蛋白 (上海生
化所东风技术公司 ) ;生理盐水 (辽 宁阜新制药厂 ) ,
其它试剂均为国产分析纯或生化试剂。
1
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2 方法
1
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2
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1 牛甲状腺球蛋白一 s eP ho 、 e 4 B 的制备
3 期 李丹彤等 : 角叉菜凝集素的分离纯化及其性质
冰醋酸 : 甘油 :双蒸馏水 =3 : 1: 1: ) 5, 然后制成干板
保存 。
1
.
2
.
6 分子 t 与紫外 吸收光谱 测定 采用
s e p h a d e x G
一
2 0 0 分子筛凝胶过滤法 [ 4〕测定分子量 。
用 7 51 G 型分光光度计测定 240 一 320 n m 的光
吸收值 。
1
.
2
.
7 等电聚焦电泳测定等电点 等电聚焦 电泳
按瑞典 L K B 公司多用 电泳仪操作手册进行 。 A m -
p h o l in e 的 p H 范围为 3 . 5 一 9 . 5 , 胶质量分数 4 . 8 % ,
胶厚度 0 . 5 m m , 采用表面电极测胶板 p H 。
1
.
2
.
8 摘抑制试验 在 % 孔 V 型血凝板中 , 加人
糖或糖蛋白溶液 40 闪 , 用生理盐水进行倍 比稀释 ,
然后加人能凝集兔红细胞的最小浓度凝集素 , 静置
15 m in (室温 )再加人 1 % 兔红细胞振匀 , 静置 Z h,
观察糖抑制兔红细胞凝集的最小浓度。
2 结果
2
.
1 角叉菜凝集素的分离纯化
CO L硫酸按分级抽提液 , 经牛甲状腺球蛋白一
se p ha or
s 。 4 B 亲和层析 , 得到 1 个对称蛋 白峰 (图
l)
, 经检测活力峰与蛋白峰一致 , C O L 的亲和样品 ,
在 P A G E 上为 1 条蛋白染色带 (图 2 ) 。 纯化结果有
关数据见表 1。
身形卜蹄
,`
2se上v
0
.
4
0
.
3
Hemag吐utinivyt
…“11竹二M我践浦
按赵永芳等 2[] 的方法 。
1
.
2
.
2 角叉菜凝集素的分离纯化
( 1) 磷酸盐缓冲液抽提 。 角叉菜采回后立即用
过滤海水洗净 , 用纱布及滤纸吸去水份 。 称取 10 9
鲜品放人冰箱中冷冻 , 然后再置于冷冻干燥机中冻
干 , 将干藻于捣碎机中捣成粉末 ( 27 9 ) , 加人 0 . 巧
m o l / L N a C I P B S ( 0
,
0 15 m o l / L
,
N 处 H PO4 -
N a H Z p O4
,
p H 7
.
2 ) 5 4 0 m l 浸泡 16 h , 5 0 0 0 : /m in ,
离心 ( 4℃ ) 5 5 m i n 取上清液即为粗提液。
( 2) 硫酸铁分级 。 在冰水浴条件下 ( 0℃ ) , 向粗
提液加人固体 ( N氏 ) 2 5氏 达 20 % 饱和度 , 过夜
( 4℃ ) , 离心 (同上 ) , 取上清 。 冰水浴中向上清液加
人固体 ( N氏 ) 2 5 0 4 至 75 % 饱和度 , 过夜 (4 ℃ ) , 再离
心 (同上 ) , 收集沉淀溶于蒸馏水中 , 于蒸馏水中透析
至无 s q Z一 , 冻千 s ml , 留做电泳用 , 其余部分再对
P B S 充分透析 。
( 3) 牛甲状腺球蛋白一 s即 ha or s e 4 B 亲和层析 。
取透析后样品 3 m l( 含蛋白 70 m g ) , 上亲 和层析柱
后 , 流速为 10 m l/ h , 待样品全部进人层析柱后 , 静
置 3 0 m i n , 待其充分反应 。 用 1 5 0 m l 0 . 15 m o l / L
N aC I BP S 洗脱至 戊 8。 < 0 . 02 , 然后换用 1 mo l/ L
N a CI BP S 解吸附 , 洗脱与解吸附过程皆分步收集 ,
流速为 1 5 m l / h , 3 m l /管 , 经 2 8 0 n m 紫外测定 , 并检
测各管的凝集活性 , 将有活性的凝集素溶液合并 , 透
析 , 冻干得 C O L 亲和样品 。
1
.
2
.
3 蛋 白含量测定 31[ 用 戊 8。 n m表示 , 以牛血
清白蛋白做对照 。
1
.
2
.
4 血凝活性测定 离心管用含抗凝剂的生理
盐水溶液润洗后 , 放人新鲜血液 , 用生理盐水离心洗
涤 4 次 ( 4 0 0 0 r / m i n , 1 0 m i n ) , 最后用生理盐水配制
成 1 % 的红细胞悬液 。
在 % 孔 V 型血凝板上用 40 讨凝集素溶液与
等量生理盐水系列倍 比稀释后 , 加人 1% 红细胞悬
液 40 川 , 室温放置 Z h 后 , 肉眼观察 , 无凝集现象时
红细胞沉积在 V 型孔底部呈大红点状 , 有凝集现象
时呈网状不下沉 , 血凝活力以产生凝集现象时的最
小凝集素的量或凝集素最大稀释倍数表示 。
1
.
2
.
5 聚丙烯酞胺凝胶电泳 《P A G E )检测 参照
P AGE 一 2 0 0 1 / 2 o 0 2 a , b 上海华泳公司使用说明 , 浓
缩胶质量分数为 5% , 分离胶质量分数为 巧 % , 浓缩
胶缓冲液 p H 6 . 8 , 分离胶缓冲液 p H 8 . 8 , 电流 17
m A
, 电泳 s h , 10 % 三氯乙酸固定后用考马斯亮兰
R 25 0 染色 , 冰醋酸一乙醇脱色 , 放人保存液 (乙醇 :
住百 .0 2
炭
_
2 80n m 光吸收值
A b s o r b a n c e
-一 血凝活力
H e m ag g l u t i n a t in g
ac t iv iyt
4 0
管数
6 0 80 10 0 】2 0
F r a c t io n n u m b e r
图 1 c 0 L 在牛甲状腺球蛋白一 se p h a、 e 4B 的亲和层析图
F i g
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1 A if n i t y e h
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a to g r a p h y P a t t e rn o f C O L on b o
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e 4B e o lum
n
柱 : l . o x 10 。 m , co lu mn
. 流速 : 1 5 m l/ h , 3 m l /管 。
1
.
0
.
1 5 m o l/ L N a C I
,
0
.
o l s om l/ L N即 H P O ;
一
N a H Z PO 4
,
p H 7
.
2
2
.
1
`
0 m o l/ L N aC I
,
0
.
0 15 m o l/ L N处卜任1氏 一N a H Z P氏 , p H 7 . 2
2
.
2 角叉菜凝集素的理化性质
2
.
2
.
1 C O L 的分子最 C O L 的 20 % 一 75 % 硫酸
馁分级抽提液经过 s eP h a d e x -G 2 0 分子筛层析 , 得

3期 李丹彤等 : 角叉菜凝集素的分离纯化及其性质
T a b k 3
表 3 精和箱蛋白对 C O L血凝活性的抑制
I汕 i址 t正on o fh em 码笼l ui t n a ti ng a c tl vi t yo fC O Lb y sg u田限 叨d l g yc 0 P ro t ein s
糖和搪蛋白
s uag
ran d l g yco p ot r
ein
起始浓度
Ini tial co n c n e
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最小抑制浓度
Min im um in h ib i to ry
con n e
t a rtlon
D 一 甘礴搪 n Man ~
D 一半乳糖 狂G a la ct o s e
D 一 果糖 D F u r eto s e
葡萄搪 Gl uco s e
蔗糖 S c u~酵母甘露聚糖 Man n an
牛甲状腺球蛋白 B o vln et掩拍 glo b u如
卵清蛋白 E g g al bm uin
7 一 球蛋白 G
anm- r
g肠 ulin
“一 ” 表示无抑制作用 。 I n d i a eti呢 a bn s e e eo fin h ib i tio n
.
5 0 0 m m o 】/ L
50 0 m m o l/ L
10 m m o l/ L
10 m m o l/ L
10 m m o 以 L
4 6
.
5 m g/耐
24
.
m s召/时
4 3
.
0 m g/ U Y r
8 0 m g/ m l
3
.
0 1
n艰/ nil
3 讨论
( ) 1糖抑制实验发现 , C O L 不被所测试的单糖 、
寡糖 、 聚糖及 2 种糖蛋白所抑制 , 仅被牛甲状腺球蛋
白抑制。 利用牛甲状腺球蛋白一 s即ha osr e 4 B 亲和层
析进行纯化 , 得到的 C O L 亲和样品经 P A G E 显示为
单一的蛋白染色带 , 经 P A G E 等电聚焦电泳显示单
一蛋白染色带 , 测得其 IP 为 8 . 30 , 实验结果表明
CO L 经上述步骤纯化 , 可 以获得 C ( ) L 的单一样品 。
采用亲和层析法进行纯化 , 其分辨率比凝胶过滤层
析法高 , 并且操作步骤少 , 活力不易丧失 , 该法的难
点是要分离纯化一种物质必须找到适宜的配基 , 并
将其制成固相载体 。 因此用亲和层析进行纯化虽然
难度大 , 但纯化效果好 。 在研究角叉菜凝集素的同
时又对绿藻孔石药进行了研究 (待发表 ) , 发现其凝
集素也可以用牛甲状腺球蛋白一eS p ha ~ 4 B 进行纯化 , 推测牛甲状腺球蛋白一eS p ha osr e 4 B 层析可能
成为纯化海藻凝集素的通用方法 。
(2 )co L 分子量的测定用 eS p h ad ex G Zo 分子
筛层析测得其分子量为 4 2 5 2 。 该凝集素的分子量
低 。 这与已报道的来 自于 B , tha m , ion ase fo r t ih ￡和 B . t r i q u e t ur m 分子量分别为 4 5 0 0 和 3 5 0 0 [5 1比
较相似 。 掘 贯治 6[] 经过系统研究后 , 认为海藻凝
集素是一种低分子量凝集素 。
( 3) CO L 对人的 A 、 B 、 A B 、 O 型红细胞都具有凝
集活力且凝集活力相同 , 该凝集素对己测试的兔 、
鲤 、 卿及人红细胞的凝集活力中以兔红细 胞的凝集
活力最高 , 所以在提纯和性质研究中一般用兔红细
胞来检测凝集活力 。
( 4) 经糖抑制实验证明 , C O L 血凝活力只被牛 甲
状腺球蛋 白抑制 , 最小抑制质量浓度为 3 . 10 m g /
m l
。 该凝集素不被所测试的其它糖及糖蛋白等所抑
制 , 推测可能该凝集素所识别的特定糖昔键为 M an 。
( 1
一
4) M an
。 此推测尚需进一步试验证明 。
致谢 : 本文承 日本广岛大学崛 贯治教授、 本校刘焕亮
教授指导 ,许庆陵 、 宋良国老师给予很 大帮助 , 在此表示衷心
感谢 !
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84中 国 水 产 科 学 7 卷
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