全 文 ：收稿日期:2003-06-19
尼泊尔酸模根中活性蛋白———凝集素特性初探
王　莉1 ,旺　姆2 ,桑　姆1
(西藏农牧学院 1.林学系;2.农学系 , 西藏 林芝 860000)
摘　要　经实验得知尼泊酸模根中除含有其传统有效成分大黄素外 , 还具有活性蛋白———凝集素 ,能使 3%兔红血
球发生凝集反应;该活性蛋白在 pH 8.0 , 0.05 mol/ L Tris-HCl(1M NaCl)的缓冲液中血凝活性最强;经 80%饱和度
硫酸铵分级沉淀 ,沉淀中凝集素含量最高。
关键词　尼泊尔酸模;凝集素;血凝活性;凝集效价
　　尼泊尔酸模(Rumex nepalensis)为蓼科酸模属植
物。通常有效成分为羟基蒽醌 ———大黄素 ,具抗菌 、
抗病毒 、利胆和泻下等药用功效 ,但在其他成分方面
未见专题报道。尼泊尔酸模适应性强 ,根繁能力极
强 ,在西藏自治区藏东南部有大量分布 ,天然产量极
高 ,但多作为杂草。本试验针对该种主要药用部位
根中活性蛋白 ———凝集素进行了部分特性研究 ,其
目的在于提高认识 、多样性开发该物种 。
凝集素 lectin是一种具非免疫原的 ,与糖专一
性结合的 ,能凝集细胞或沉淀含糖大分子的蛋白质
或糖蛋白。它在植物体内广泛存在 ,以种子中含量
最丰富 ,根 、茎 、叶较低。具有与细胞结合 、细胞凝集
作用 、促进细胞分裂作用 ,免疫作用 、致毒作用 、酶等
生理效应 。它运用广泛 ,如分离细胞 、分离纯化糖蛋
白 ,鉴定某些成分中是否有糖分子 、研究细胞表面特
征 、鉴定血型 、诊断T 抗原 、防止病原体入侵植物 ,延
缓植株衰老等方面[ 1 ,2] 。
1　材料与方法
1.1　材料
选长势较强的健康植株主根 ,洗净 ,擦干 ,切成
薄片 。用不同缓冲液浸泡过夜 ,离心 ,取上清液。
1.2　方法
(1)配制不同 pH值缓冲液[ 3]
pH 7.2 ,0.05 mol/L PBS(盐—磷酸缓冲液);pH
8.0 ,0.05mol/L Tris-HCl;pH 5.0 ,0.05 mol/L NaAc-
etate(乙酸钠);pH 3.0 ,0.05 mol/L Glycin。
(2)配制不同NaCl浓度Tris-HCL 缓冲液
0.05 mol/L Tris-HCl(1 mol/L NaCl);0.05 Tris-
HCl(0.75 mol/L NaCl);0.05 mol/L Tris -HCl(0.50
mol/L NaCl);0.05 mol/L Tris-HCl(0.25mol/L NaCl)。
(3)硫酸铵分级沉淀
于浸提液中加入不同饱和度固体硫酸铵 ,使材
料中的蛋白质分级沉淀 ,离心收集 ,重新溶解。
(4)亲和层析分离纯化
选用Chitin(几丁质)作为亲和吸附剂 ,进行吸附层
析 ,用硼酸作为解吸剂缓冲液洗脱 ,测流出液OD值。
2　结果与讨论
2.1　不同 pH 值浸泡液的血凝活性对比
选用不同 pH 值缓冲液浸泡材料 ,对其上清液
进行3%的兔红血球凝集活性测定。结果见表 1。
表 1　不同 pH 值浸提液血凝活性对比
浸提液种类
0.05 mol/ L
Tris-HCl
pH 8.0
0.05 mol/ L
PBS
pH 7.2
0.05 mol/L
NaAcetate
pH 5.0
0.05mol/L
Glycin
pH 3.02
凝集效价 24 23 24 22
凝集反应强度 ++ + + +
　注:+表示有凝集反应
由表 1可知 ,用不同 pH缓冲液浸泡该材料 ,均能
使兔红血球凝集 ,但经镜检 , 以pH 8.0 , 0.05 mol/L
Tris-HCl缓冲液作为浸提液的凝集效价最高 ,且凝
集反应最强 ,为该物种的最适 pH值浸提液。
2.2　不同盐浓度下 ,各浸提液血凝活性对比
在确定的最适 pH 值缓冲液基础上调节其中
NaCl的浓度 ,设 1 、0.75 、0.50 、0.25 mol/L 四个 NaCl
浓度梯度 ,取浸提液用 3%兔红血球进行凝集活性
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第 23 卷第 4期
2004 年 8月 　　　　　　　　　　　　　中 国 野 生 植 物 资 源Chinese Wild Plant Resources　　　　　　　　　　　　Vol.23 No.4Aug.2004
测定 ,结果见表 2。
表 2　不同盐浓度下血凝活性对比
NaCl浓度(mol/ L) 1.00 0.75 0.50 0.25
最强凝集反应时效价 25 23 22 23
由表 2得知 ,对 3%的兔红血球凝集效价最高
达25 ,当最适 pH 8.0 0.05 mol/L Tris-HCl中 NaCl
浓度调至 1 mol/L时 ,材料中凝集素活性最高 ,且凝
集反应最强时的效价最高为 25。由此 ,可判断该物
种根中凝集素的最适 NaCl浓度为 1 mol/L。
2.3　不同饱和度沉淀后血凝活性对比
经硫酸铵分级沉淀后 ,离心 ,所得沉淀溶解 ,用
3%兔红血球进行血凝活性测定 ,对比结果见表 3。
表 3　硫酸铵分级沉淀血凝活性对比
(NH4)SO4
饱和度 20% 40% 60% 80% 100%
100%沉淀
后上清液
沉淀析出情况 — ++ +++ ++ + —
最强凝集效价 24 23 24 26 23 21
　注:“ —”表示无沉淀析出 ,“ +”表示有沉淀析出
从表 3得知 ,在不同饱和度硫酸铵条件下 ,沉淀
析出的量不等 , 但凝集效价却以 80%饱和度为最
高 ,且对 3%兔红血球的凝集反应最强 。
2.4　糖专一性抑制筛选
因药品局限 ,本次试验共选择了 5 种 、浓度为
0.3 mol/L 的糖溶液进行糖专一性抑制筛选 ,其结果
见表 4。
表 4　凝集素 5种糖专一性抑制试验
滴度 岩藻糖
葡萄
糖
半乳
糖
甘露
糖
N-乙酰
葡萄糖胺
活性
对照
空白
对照
20 + + + + + + —
21 + + + + + + —
22 + + + + + + —
23 + + + + + + —
2
4 + + + + + + —
25 + + + + — + —
2
6 + + + — — + —
　注:“ +”表示有凝集反应 ,“ —”表示无凝集反应
由表 4可知 ,该凝集素滴度达 25 时 ,与对N-乙
酰葡萄糖胺有一定量的专性结合 ,致使部分兔红血
球沉淀 。由此可见 ,尼泊尔酸模根中凝集素上有部
分 N-乙酰葡萄糖胺的结合位点 。
2.5　装柱层析 ,测 OD 值 ,对比血凝活性
由 2.4结果选择几丁质作为亲和吸附剂 ,测流
出液 OD 值(直到 OD =0)及血凝活性 ,以洗脱杂蛋
白的干扰。经血凝活性检测 ,得知各管流出的洗脱液
部分有活性。说明有大部分凝集素随杂蛋白流失。
图 1　硼酸洗脱流出液光密度情况
再以pH 8.0 ,0.05mol/L Na2B4O7 作为解吸附剂
的缓冲液洗脱 ,测流出液 OD 值(直到 OD =0),对比
各管血凝活性 ,得 OD 值有两个峰值(见图 1),但在
第一峰时 ,有血凝活性 ,凝集效价仅为 20 。由此说
明 ,几丁质不是该凝集素的最佳亲和吸附剂 ,对该凝
集素的最佳专性结合糖有待进一步研究。
以上结果表明 ,在尼泊尔酸模的根中除含有蒽
醌类大黄素外 ,还有能与 3%兔红血球发生凝集反
应的活性蛋白 ———凝集素 ,且该凝集素在 pH 8.0
0.05 mol/L Tris-HCl(1 mol/L NaCl)缓冲液中血凝
活性最强 ,经 80%饱和度硫酸铵沉淀后 ,凝集素含
量最高 ,血凝活性最强 。
综上所述 ,尼泊尔酸模药用部位不仅表现在大
黄素单方面有利用价值 ,同时 ,根中所含活性蛋白
———凝集素也有待研究其药用价值。
参考文献:
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报 , 1995 ,25(1):94-96.
[ 2] 　施承梁 ,刘士庄.92种中草药的血凝活性测定[ J] .上海师范大
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[ 3] 　西北农业大学.基础生物化学实验指导[ M] .西安:陕西科学技
术出版社 , 1998.
[ 4] 　张康健 ,王　蓝.药用植物资源开发利用学[M] .北京:中国林
业出版社 , 1997.
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第 4 期　　　　　　　　　　　　 　王　莉等:尼泊尔酸模根中活性蛋白———凝集素特性初探