全 文 ：中国生物制品学杂志 2015年 5月第 28卷第 5期 Chin J Biologicals May 2015，Vol. 28 No. 5
海洋生物海蚯蚓（Arenicola cristata）属于环节动 物门多毛纲小头虫目沙蠾科，主要分布于我国渤海、
黄海沿岸，其繁殖力强，资源丰富。海蚯蚓始载于
《中国药用动物志》，用于痈疮肿毒治疗，有清热解毒
之功效。目前，对海蚯蚓的研究主要集中在其形态
结构、生理代谢、营养成分分析等方面。
基金项目：国家自然科学基金项目（30901779）；山东省自然科学基
金项目（ZR2009CM019）；山东省高等学校科技计划项目
（J11LC52）资助.
通讯作者：赵春玲，E-mail：zhaochunlingbj@163.com
海蚯蚓蛋白酶基因的原核表达及其抗肿瘤活性
于文静 1，鞠吉雨 2，初金鑫 1，张金宝 2，连波 1，杜长青 1，赵春玲 1
1. 潍坊医学院药学与生物科学学院，山东 潍坊 261053；2. 潍坊医学院基础医学院，山东 潍坊 261053
摘要：目的 原核表达海蚯蚓蛋白酶基因，探讨其对肿瘤细胞增殖的抑制作用。方法 根据环节动物门蚯蚓和单环
刺螠丝氨酸蛋白酶 cDNA序列多重比对获得的保守序列设计引物，从海蚯蚓肠道组织提取总 RNA，经 3′RACE和 5′
RACE技术分别克隆海蚯蚓蛋白酶 cDNA序列的 3′端和 5′端，并进行拼接，对其编码的蛋白质作生物信息学分析；将
海蚯蚓蛋白酶成熟肽的编码序列亚克隆至原核表达载体 pET-21a（+），转化大肠埃希菌 BL21（DE3）进行诱导表达，采
用组氨酸亲和层析柱纯化；MTT法检测重组蛋白的抗肿瘤活性。结果 经 3′端 RACE技术获得约 250 bp的海蚯蚓蛋白
酶基因 cDNA 3′端序列，再经 5′RACE技术扩增获得约 770 bp的 cDNA 5′端序列，拼接可得海蚯蚓蛋白酶 cDNA序列
全长为 880 bp，其编码蛋白含 270个氨基酸，具有高度保守的 GDSGGP序列；重组蛋白相对分子质量为 27 000，主要以
包涵体形式表达，约占菌体总蛋白的 30%，上清纯化后纯度可达 95%；重组蛋白酶对人肿瘤细胞增殖具有明显的抑制作
用。结论 原核表达了海蚯蚓蛋白酶，可明显抑制人肿瘤细胞的增殖，为抗肿瘤基因工程药物的研发提供了实验依据。
关键词：海蚯蚓；丝氨酸蛋白酶；原核细胞；基因表达；抗肿瘤活性
中图分类号：R730. 54 文献标识码：A 文章编号：1004-5503（2015）05-0488-05
Prokaryotic expression and anti-tumor activity of protease
from Arenicola cristata
YU Wen-jing*, JU Ji-yu, CHU Jin-xin, ZHANG Jin-bao, LIAN Bo, DU Chang-qing, ZHAO Chun-ling
*College of Pharmacy and Biological Science, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, China
Corresponding author: ZHAO Chun-ling, E-mail: zhaochunlingbj@163.com
Abstract：Objective To express the protease of Arenicola cristata in prokaryotic cells and investigate its inhibitory ef－
fect on proliferation of tumor cells. Methods Primers were designed based on the highly conserved sequence obtained by
the alignment of protease cDNAs from annelid animals such as Eisenia fetida and Urechis unicinctus. Total RNA was ex－
tracted from the intestine tissue of A. cristata, and the 3′-and 5′-terminuses of cDNA sequences were cloned by 3′ RACE
and 5′ RACE respectively and spliced, by which the encoded protein was analyzed for bioinformatics. The gene sequence
encoding the mature peptide of A. cristata protease was subcloned to prokaryotic expression vector pET-21a（+）, and the
constructed recombinant plasmid was transformed to E. coli BL21（DE3）and induced with IPTG. The expressed protein
was purified by His Band chromatography, and determined for anti-tumor activity by MTT assay. Results The 3′-termi－
nus of cDNA from A. cristata, at a length of about 250 bp, was obtained by 3′ RACE, then the 5′-terminus at a length of
about 770 bp by 5′ RACE, with which the cDNA sequence at a full-length of 880 bp was obtained by splicing. The cDNA
encoded a protein consisting of 270 amino acid residues and contained highly conserved GDSGGP sequence, which might
belonged to serine protease family. The recombinant protein, with a relative molecular mass of 27 000, existed in a form of
inclusion body, and contained about 30% of total somatic protein, of which the supernatant reached a purity of 95% after
purification. The recombinant protease showed significantly inhibitory effect on the proliferation of human tumor cells.
Conclusion The protease from A. cristata was expressed in prokaryotic cells, which inhibited the proliferation of human
tumor cells significantly, and provided an experimental basis for development of gene engineering drugs for tumor.
Key words：Arenicola cristata; Serine protease; Prokaryotic cells; Gene expression; Antitumor activity
·基础研究·
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DOI:10.13200/j.cnki.cjb.000905
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丝氨酸蛋白酶家族是以丝氨酸为活性中心的一
类酶，在生物体内发挥着重要的生理作用，如纤溶、
免疫、调节细胞分化与胚胎发育等［1-3］。本研究对已
报道的环节动物门蚯蚓和单环刺螠丝氨酸蛋白酶
cDNA序列进行多重比对，采用同源序列克隆法，通
过 3′RACE（rapid amplification of cDNA ends）、5′RACE
技术，获得了一种新的海蚯蚓蛋白酶的 cDNA序列，
其所编码的蛋白质属于丝氨酸蛋白酶家族的新成
员，并构建其原核表达载体进行诱导表达，分析重组
蛋白的抗肿瘤活性，为利用其进行抗肿瘤基因工程
药物的研发提供实验依据。
1 材料与方法
1. 1 海蚯蚓 采自烟台市近海。
1. 2 菌株、质粒及细胞 E. coli DH5α、表达载体 pET-
21a（+）和 E. coli BL21（DE3）均为潍坊医学院生物
技术专业实验室保存；人宫颈癌细胞 HeLa、食管癌
细胞 Eca-109 和大肠癌细胞 SW480 均购自中国科
学院细胞库。
1. 3 主要试剂及仪器 Trizol试剂、3′RACE试剂盒
和 5′RACE试剂盒均购自北京吉百特生物公司；反
转录试剂盒购自立陶宛 Fermentas 公司；Wizard 纯
化 DNA试剂盒、DNase和 RNaseH购自美国Promega
公司；T-AEasy试剂盒、高保真 Taq酶、内切酶BamHⅠ、
XhoⅠ购自宝生物工程（大连）有限公司；组氨酸亲和
层析柱（His Bind column）购自美国 Novagen 公司；
IPTG、MTT 和胰蛋白酶购自美国 Amresco 公司；
RPMI Medium 1640购自美国 Gibco BRL公司；胎牛
血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。
1. 4 引物设计及合成 从 NCBI的 GenBank（http：／／
www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库获得已报道的环节动
物门蚯蚓和单环刺螠蛋白酶 cDNA序列，利用 DNA-
MAN5. 2. 2软件进行多重比对，根据这些同源性基
因序列的保守区域，设计并合成引物 3F1：5′-GCAA-
TGGTGACAGTGGTGGCCCC-3′。3R 为含接头引物
序列的反转录引物；3R1：5′-GGCCACGCGTCGACT-
AGTAC-3′，为 3′端接头引物；5R：5′-TTTTTTTTTTTT-
TTTTTT-3′，为 oligodT 反转录引物。5R1、5R2是根
据3′RACE 获得的 3′端序列设计的特异性引物，
5R1：5′-CACCTCTCTGATCCAGTCACGGAAG-3′，5R2：
5′-GGAGTAGGCAGATGGGTAGGAGGTC-3′；5F1：5′-G-
GCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGG-3′，
为含 5′端接头引物序列的引物；5F2：5′-GGCCACG-
CGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGG-3′，为 5′端接
头引物。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。
1. 5 海蚯蚓肠道组织总RNA的提取取鲜活海蚯
蚓肠道组织，采用 Trizol 试剂提取总 RNA，溶解于
15 μl DEPC水中备用。
1. 6 目的基因的获得及测序
1. 6. 1 3′RACE技术克隆海蚯蚓蛋白酶基因 cDNA
3′端序列 以 3R作为反转录引物，反转录试剂盒合
成 cDNA，以其为模板进行 PCR扩增。反应体系为：
LA TAQ DNA Polymerase（5 U ／ μl）1 μl，10 × PCR
Buffer 5 μl，dNTP Mixture（各 2. 5 mmol ／ L）4 μl，
反转录产物 1 μl，引物 3F1（10 pmol ／ L）与 3R1
（10 pmol ／ L）各 2 μl，以灭菌蒸馏水补足体系，共
50 μl。PCR反应条件为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变
性 40 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共 35个循
环；72 ℃再延伸 10 min。PCR产物胶回收后连 TA克
隆载体，CaCl2法转化 E. coli DH5α，筛选阳性克隆，
提取质粒，送北京吉百特生物公司测序。
1. 6. 2 5′RACE技术克隆海蚯蚓蛋白酶基因 cDNA
5′端序列 以 5R-oligodT 作为反转录引物，经反转
录试剂盒合成 cDNA，过柱纯化反转录产物。使用
dCTP和 TdT对纯化的 cDNA加尾，过柱纯化加尾产
物，进行 2轮 PCR反应：第 1 轮 PCR 反应体系为：
LA TAQ DNA Polymerase（5 U ／ μl）1 μl，10 × PCR
Buffer 5 μl，dNTP Mixture（各 2. 5 mmol ／ L）4 μl，加
尾产物 1 μl，引物 5F1（10 pmol ／ L）与 5R1（10 pmol ／ L）
各 2 μl，以灭菌蒸馏水补足体系，共 50 μl。PCR反
应条件为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 40 s，60 ℃
退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共 35个循环；72 ℃再延
伸 10 min。第 2轮 PCR反应体系为：LA TAQ DNA
Polymerase（5 U ／ μl） 1 μl，10 × PCR Buffer 5 μl，
dNTP Mixture（各 2. 5 mmol ／ L）4 μl，第 1轮 PCR产
物 1 μl，引物 5F2（10 pmol ／ L）与 5R2（10 pmol ／ L），
各 2 μl，以灭菌蒸馏水补足体系，共 50 μl。PCR反应
条件同第 1轮。取第 2轮 PCR产物，电泳胶回收纯
化，连接 TA克隆载体，CaCl2法转化 E. coli DH5α，筛
选阳性克隆，提取质粒，送北京吉百特生物公司测序。
1. 6. 3 序列拼接 应用 Contigexpress 软件对海蚯
蚓蛋白酶基因 cDNA5′端和 3′端序列进行拼接，获得
海蚯蚓蛋白酶编码基因的 DNA（mRNA）序列。
1. 7 序列分析 在 NCBI 上运行 Blast、ORF Finder
（open reading frame finder）、Signal P软件对克隆到的
cDNA 序列及其编码蛋白质进行生物信息学分析。
1. 8 原核表达质粒的构建 根据获得的 cDNA 序
列，针对编码海蚯蚓蛋白酶活性肽的区域设计 1对
引物，引物序列为：F：5′-TCGCGGATCCATTGTTGGT-
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GGCGATGAGGC-3′（下划线部分为 BamHⅠ酶切位
点）；R：5′-GTGCTCGAGGATGTCAGACACCTCTCTG-
AT-3′（下划线部分为 XhoⅠ酶切位点）。以海蚯蚓蛋
白酶的 cDNA为模板，利用 pfu DNA聚合酶扩增活
性肽的 cDNA片段。将该 PCR产物经酶切，与原核
表达载体 pET-21a（+）连接，CaCl2法转化 E. coli DH5α，
筛选阳性克隆，提取质粒，经 BamHⅠ／ XhoⅠ双酶切
鉴定，并送北京吉百特生物有限公司测序。
1. 9 重组蛋白的诱导表达及纯化 将测序正确的阳性转
化子提取重组质粒，CaCl2法转化至E. coli BL21（DE3），
构建工程菌，挑取单菌落，接种至 5 ml含 100 μg ／ ml
氨苄西林的 LB培养基中，37℃振荡培养过夜；取 50 μl
转接至 5 ml同样培养基中，继续培养 4 h；加入 IPTG至
终浓度为 1. 0 mmol ／ L，30 ℃培养 4 h；8 000 × g离
心 5 min，收集菌体。按 1 ml菌液加 50 μl Tris-CL缓
冲液（20 mmol ／ L，pH 7. 4；10 mmol ／ L咪唑，0. 5 mol ／ L
NaCl），冰浴超声破碎细胞。4℃，12 000 × g离心 30min，
分别取上清和沉淀，沉淀用缓冲液按每 1 ml菌液加
50 μl缓冲液重悬沉淀，分别取菌体裂解物、上清和
沉淀各 10 μl，进行 10% SDS-PAGE分析。将裂解物
上清液经组氨酸亲和层析柱（Ni2+树脂柱）纯化，用
50 ml洗涤液（20 mmol ／ L Tris-CL，pH 7. 4；10 mmol ／ L
咪唑，0. 5 mol ／ L NaCl）洗涤，再用洗脱液（20 mmol ／ L
Tris-CL，pH 7. 4；500 mmol ／ L咪唑，0. 5 mol ／ L NaCl）
洗脱，洗脱蛋白经 10% SDS-PAGE分析。
1. 10 重组蛋白酶对人肿瘤细胞增殖抑制作用的检
测 采用 MTT法。将人宫颈癌细胞 HeLa、食管癌细
胞 Eca-109、大肠癌细胞 SW480 分别接种至 96 孔
培养板，2 × 103个 ／ 孔，培养 24 h；弃上清，分别加
入含不同浓度重组蛋白（2、4、8、16、32、48 μg ／ ml）的
RPMI1640培养基，200 μl ／ 孔，同时设对照组（加入
等体积的 RPMI1640培养基），每组设 4个复孔。继
续培养 48 h后，弃上清，用培养液洗涤 3次，每孔加
入100 μl含 0. 2 mg ／ ml MTT的无血清培养基，37 ℃
培养 4 h；弃上清，加入 150 μl DMSO溶解 MTT甲臜
沉淀，振荡混匀，上酶标仪检测 A490值。试验重复 3
次。按下式计算细胞增殖抑制率，并求出重组海蚯
蚓蛋白酶的半数抑制浓度（IC50）。
细胞增殖抑制率（%）=（1 - 加药细胞平均 A490值 ／ 对
照细胞平均A490值）× 100%
2 结 果
2. 1 海蚯蚓蛋白酶基因cDNA序列的鉴定经 3′
端 RACE技术获得约 250 bp的海蚯蚓蛋白酶基因
cDNA 3′端序列，再经 5′RACE技术扩增获得约 770 bp
的 cDNA 5′端序列，见图 1和图 2；序列拼接后，获得
880 bp的海蚯蚓蛋白酶 cDNA全长序列，其 ORF长
度为 813 bp，见图 3。
M：DNA marker DL2000；1：海蚯蚓蛋白酶基因 cDNA 3′端的
PCR产物。
图 1 海蚯蚓蛋白酶基因 cDNA 3′端的 PCR产物电泳图
Fig 1. Electrophoretic profile of 3′RACE product
M：DNA marker DL2000；1：海蚯蚓蛋白酶基因 cDNA 5′端的PCR
产物。
图 2 海蚯蚓蛋白酶基因 cDNA 5′端的 PCR产物电泳图
Fig 2. Electrophoretic profile of 5′RACE product
2. 2 cDNA序列推导的蛋白质序列及其同源性分析
序列分析表明，海蚯蚓蛋白酶含 270个氨基酸，由信
号肽、前肽和活性肽（包括 I33VGG以后的所有序列）
组成；含丝氨酸蛋白酶家族高度保守序列 GDSGGP，
属于丝氨酸蛋白酶家族中的 TRYPSIN家族（trypsin-
like serine protease）；含催化三联体 H82、D128、S225，
见图 3。经 Blast比对分析，海蚯蚓蛋白酶与其他丝
氨酸蛋白酶家族的蛋白（包括蚯蚓和单环刺螠蛋白
酶）除具有 GDSGGP的高度保守序列外，无明显相
似性。表明海蚯蚓蛋白酶可能为丝氨酸蛋白酶家族
的一个新成员。
bp M 1
2 000
1 000
750
500
250
100
M 1 bp
2 000
1 000
750
500
250
100
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bp M1 1 M2 bp
7 000
4 000
10 000
2 000
1 000
500
250
1 000
700
400
200
Mr M 1 2 3 4
116 000
66 200
45 000
35 000
25 000
18 400
14 400
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 2 4 8 3216 64
HeLa细胞
Eca-109细胞
SW480细胞
重组蛋白浓度（μg ／ ml）
细
胞
增
殖
抑
制
率
（
%）
1 M Mr
116 000
66 200
35 000
25 000
18 400
14 400
45 000
注：信号肽以粗体表示；保守的催化三联体（组氨酸、精氨酸和丝
氨酸）以粗体和双下划线表示；保守的结构域以粗体和下划线表示；
*表示终止密码子。
图 3 海蚯蚓蛋白酶 cDNA序列及其推导氨基酸的序列
分析
Fig 3. Analysis of cDNA and deduced amino acid sequences
of A. cristata protease
2. 3 重组原核表达质粒的鉴定 将重组原核表达
质粒的双酶切（BamHⅠ／ XhoⅠ）产物经 1%琼脂糖
凝胶电泳分析，出现 714 bp的目的基因片段，见图 4。
测序结果与 RACE一致。
M1：DNA marker DL10000；1：质粒的双酶切产物；M2：DNA marker
DL1000。
图 4 重组原核表达质粒的双酶切（BamHⅠ／ XhoⅠ）鉴定
Fig 4. Restriction map of recombinant prokaryotic expression
vector（BamHⅠ／ XhoⅠ）
2. 4 重组蛋白的表达与纯化产物的鉴定 重组蛋白经
10% SDS-PAGE分析，可见相对分子质量约 27 000
处出现特异蛋白条带，大小与预期相符，见图 5；重
组蛋白约占菌体总蛋白的 30%，主要以包涵体形式
存在，上清中含量较少。重组蛋白经纯化后可获得
相对分子质量约 27 000的单一均质蛋白，纯度可达
95%以上，见图 6。
M：蛋白质 marker；1：未诱导的菌体蛋白；2：诱导的菌体蛋白；
3：诱导的菌体上清 4：诱导的菌体沉淀。
图 5 重组表达产物的 SDS-PAGE分析
Fig 5. SDS-PAGE profile of expressed recombinant protein
1：纯化后的重组蛋白；M：蛋白质 marker。
图 6 重组蛋白纯化产物的 SDS-PAGE分析
Fig 6. SDS-PAGE profile of purified recombinant protein
2. 5 重组蛋白酶对人肿瘤细胞增殖的抑制作用 重
组蛋白酶对人宫颈癌细胞 HeLa、食管癌细胞 Eca-109
和大肠癌细胞 SW480增殖均具有明显的抑制作用，
见图 7；重组海蚯蚓蛋白酶 IC50分别为 14. 5、21. 2和
10. 7 μg ／ ml。
图 7 重组海蚯蚓蛋白酶对人肿瘤细胞增殖的抑制作用
Fig 7. Inhibitory effect of recombinant protease from A. cristata
of proliferation of human tumor cells
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3 讨 论
丝氨酸蛋白酶家族包括似糜蛋白酶亚家族、似
枯草溶菌酶亚家族和似 α ／ β水解酶亚家族，这 3个
亚家族的成员在其催化活性中心 Ser、His和 Asp附
近具有高度保守的氨基酸序列［4］。这些保守氨基酸
序列为寻找各亚家族中新的基因及编码蛋白提供了
有效手段，而同源序列克隆法是在序列相似性较高
的物种之间进行基因克隆的重要方法。
本实验将环节动物门蚯蚓和单环刺螠丝氨酸蛋
白酶 cDNA序列进行多重比对，获得其保守序列，合
成引物，采用 RACE 技术克隆至海蚯蚓蛋白酶的
cDNA 全长序列。序列分析发现，该基因所编码的蛋
白质中含有丝氨酸蛋白酶家族的高度保守氨基酸
序列 GDSGGP［ 5-6 ］，属于丝氨酸蛋白酶家族中的
TRYPSIN 家族（trypsin-like serine protease），且含保
守催化三联体 H82、D128、S225，经 BLAST 比对分
析，海蚯蚓蛋白酶与其他丝氨酸蛋白酶家族的蛋白
除具有 GDSGGP的高度保守序列外，无明显相似性，
可推断海蚯蚓蛋白酶可能为丝氨酸蛋白酶家族的
一个新成员。海蚯蚓蛋白酶由信号肽、前肽及成熟
肽组成，且其成熟肽即蛋白质的活性形式中含有保
守的 IVGG序列［7］。
将海蚯蚓成熟肽的编码序列成功克隆至原核表
达载体 pET-21a（+）中，转化 E. coli BL21（DE3），融
合蛋白主要以包涵体形式存在，其上清经 Ni2+树脂柱
纯化后，MTT检测发现重组海蚯蚓蛋白酶对人肿瘤
细胞的增殖具有明显的抑制作用。
目前，对海蚯蚓的研究报道较少［8-10］。海洋生物
海蚯蚓形似蚯蚓，与蚯蚓同属于环节动物门，但海蚯
蚓为多毛纲，蚯蚓为寡毛纲。作为中国传统药物的
蚯蚓具有活血化瘀、清热解毒、提高机体免疫功能的
作用。近年，从蚯蚓中提取到抗肿瘤活性物质多为
丝氨酸蛋白酶组分，可抑制肿瘤细胞体内外增殖及
诱导瘤细胞凋亡［11-13］，且可作为生物反应调节剂，在
治疗肿瘤方面具有辐射增效和化学增效作用［14-15］。
蚯蚓蛋白酶有望成为新型抗肿瘤药物，而海蚯蚓蛋
白酶具有更良好的抗肿瘤活性，尚需进一步研究。
本研究对海蚯蚓蛋白酶新基因进行了 cDNA克
隆及表达，并初步证实其可明显抑制人肿瘤增殖，为
海蚯蚓的功能基因组学与蛋白组学的研究奠定了理
论基础，也为利用其进行抗肿瘤基因工程药物的研
发提供了实验依据。
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收稿日期：2014-10-07 编辑：李靓
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