全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2015，27:763-767
文章编号:1001-6880(2015)5-0763-05
收稿日期:2014-10-08 接受日期:2014-12-05
基金项目:国家自然科学基金(30901779) ;山东省高等学校科技
计划(J11LC52)
* 通讯作者 Tel:86-536-8462053;E-mail:zhaochunlingbj@ 163． com
重组海蚯蚓纤溶酶的克隆、表达及活性鉴定
鞠吉雨1，于文静2，初金鑫2，张金宝1，连 波2，赵春玲2*
1潍坊医学院基础医学院;2 潍坊医学院药学与生物科学学院，潍坊 261053
摘 要:纤溶酶在溶栓治疗中起重要作用，能够溶解血凝块的主要成分纤维蛋白。采用 ＲACE方法从海蚯蚓消
化道组织中扩增出海蚯蚓纤溶酶编码序列，构建该基因原核表达载体，并进一步构建工程菌表达融合蛋白，经
Ni2 +树脂柱纯化后通过平板法检测该融合蛋白纤维蛋白酶原激活活性。结果获得海蚯蚓纤溶酶的 cDNA 序列
和氨基酸序列，并成功构建重组表达载体 pET-21a-AFE，表达纯化出融合蛋白，该融合蛋白能够激活纤维蛋白酶
原而溶解纤维蛋白。总之，本研究获得了海蚯蚓纤溶酶的 cDNA序列和氨基酸序列，并初步证明其具有纤维蛋
白酶原激活活性，为临床新型溶栓药物的开发提供实验基础。
关键词:海蚯蚓;纤溶酶;ＲACE;基因序列
中图分类号:Q503 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2015． 05． 003
Gene Cloning，Expression and Activity Identification of the Ｒecombinant
Fibrinolytic Enzyme from Arenicola cristata
JU Ji-Yu1，YU Wen-Jing2，CHU Jin-Xin2，ZHANG Jin-Bao1，LIAN Bo2，ZHAO Chun-Ling2*
1College of Basic Medicine;2College of Pharmacy and Biological Science，Weifang Medical University，Weifang 261053，China
Abstract:Fibrinolytic enzyme plays an important role in thrombolytic therapy，and they can dissolve fibrin which is the
main components of blood clots． The encoding sequence of fibrinolytic enzyme from Arenicola cristata were amplified by
ＲACE from digestive tract tissues of A． cristata． The prokaryotic expression vector of the gene was constructed and fusion
protein was then induced to express in E． coli． Plasminogen activator activity of the fusion protein purified by the Ni2 +
resin column was detected by fibrin plate method． Thus，the cDNA sequence and amino acid sequence of fibrinolytic en-
zyme from A． cristata were obtained． The recombinant expression vector pET-21a-AFE was successfully constructed． The
purified fusion protein can dissolve fibrin by activating plasminogen． In short，the cDNA sequence and amino acid se-
quence of fibrinolytic enzyme from A． cristata were obtained． This enzyme was preliminarily proved to have plasminogen
activation activity，and might act as a thrombolytic agent for use in thrombosis．
Key words:Arenicola cristata;fibrinolytic enzyme;ＲACE;gene sequence
血栓性疾病严重威胁着人类健康，其主要治疗
手段之一是溶栓。溶栓剂迄今已发展了三代，但出
血、发热、过敏反应、低血压等副作用的出现使现有
药物并不理想。临床上迫切需要寻找和开发安全高
效的新型溶栓剂。研究发现，纤溶酶(fibrinolytic en-
zyme)在溶栓治疗中起重要作用，能够溶解血凝块
的主要成分纤维蛋白［1，2］。
海蚯蚓(Arenicola cristata) ，属于环节动物门海
洋生物，始载于《中国药用动物志》，用于痈疮肿毒，
有清热解毒之功效。但有关海蚯蚓的研究只有少量
报道［3-5］。1975 年血红蛋白从海蚯蚓中被分离且结
构被特征化;Parker 等从海蚯蚓中分离到 4 种能够
激活环 AMP磷酸二酯酶;Wang 等从海蚯蚓中分离
到一种具有抗肿瘤活性的新的烯醇式磺化甾醇—
Arenicolsterol A。本研究利用 cDNA 末端快速扩增
(rapid amplification of cDNA ends，ＲACE)法，从海蚯
蚓消化道组织中获得海蚯蚓纤溶酶的 cDNA 序列、
氨基酸序列，构建原核表达载体并表达纯化融合蛋
白，并进一步对其功能进行初步研究。本研究为探
讨海蚯蚓纤溶酶的生物学活性和可能的开发应用提
供实验基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
海蚯蚓采自烟台市近海。Trizol 试剂、3ＲACE
试剂盒、5ＲACE试剂盒购自北京吉百特公司;反转
录试剂盒购自 fermentas 公司;T-A Easy 试剂盒、高
保真 Taq酶、内切酶 BamHI和 XhoI购自大连宝生物
公司;IPTG、镍柱填料和超滤管购自北京东胜泰博
公司;牛血纤维蛋白溶酶原和尿激酶购自中国食品
药品检定研究院。表达载体 pET-21a、E． coli BL21
为本室保存。
1． 2 海蚯蚓纤溶酶基因 cDNA 3及 5 端序列扩增
及测序
设计引物序列:3Ｒ为含接头引物序列的反转录
引物;3Ｒ1 为 3端接头引物;3F1 是根据丝氨酸蛋白
酶家族催化活性中心 Ser附近所含的高度保守序列
GDSGGP设计的引物。5Ｒ 为 oligodT 反转录引物;
5Ｒ1、5Ｒ2 是根据 3ＲACE获得的 3端序列设计的特
异性引物;5F1 为含 5端接头引物序列的引物;5F2
为 5端接头引物。引物具体序列见 Table 1。
表 1 本研究中 ＲACE所用的引物序列
Table 1 Primer sequences used in this study for ＲACE
Primer
引物
Sequence
序列
3Ｒ 5-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3
3F1 5-GCAATGGTGACAGTGGTGGTCC-3
3Ｒ1 5-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3
5Ｒ 5-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3
5F1 5-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGG-3
5Ｒ1 5-CCTGAACACTGAGAGTTGGAC-3
5F2 5-CCACGCGTCGACTAGTACG-3
5Ｒ2 5-GGACCACCACGTCACCATTGC-3
利用 Trizol试剂从鲜活海蚯蚓肠道组织中提取
总 ＲNA，以 3Ｒ作为反转录引物使用 fermentas 公司
反转录试剂盒合成 cDNA，以 cDNA 为模板，3F1 和
3Ｒ1 为上下游引物，利用 3ＲACE 试剂盒扩增 3末
端序列。以 5Ｒ-oligodT作为反转录引物合成 cDNA，
使用 dCTP和 TdT 对纯化的 cDNA 加尾，以过柱纯
化后的加尾产物为模板，5F1、5Ｒ1 和 5F2、5Ｒ2 分别
为引物，利用 5ＲACE 试剂盒扩增 5末端序列。将
扩增出来 3和 5末端序列电泳胶回收纯化后，分别
连接 TA 克隆载体，转化细菌 E． coli DH5α，测序。
应用 Contigexpress软件对海蚯蚓纤溶酶基因 cDNA
5端和 3端序列进行拼接。
1． 3 生物信息学分析
将得到的海蚯蚓纤溶酶基因 DNA(mＲNA)序
列，使用 DNAMAN 软件，获得该海蚯蚓纤溶酶 cD-
NA 编码的氨基酸序列。登陆 NCBI 利用 Blast 在
GenBank数据库和蛋白质数据库进行同源性比较分
析。Signal P 3． 0 软件分析海蚯蚓纤溶酶的信号肽
序列。
1． 4 海蚯蚓纤溶酶基因重组表达载体的构建
根据发现的海蚯蚓纤溶酶基因 cDNA 序列，设
计一对引物，F:5-TTCGAGCTCATTATTGGTGGT-
TCTGATGCA-3，Ｒ:5-GTGCTCGAGGACTCCAGTA-
ACACTCTGGAT-3，上下游引物中分别引入 Sac1 和
XhoI酶切位点(下划线部分) ;以海蚯蚓纤溶酶 cD-
NA为模板，利用 pfu DNA聚合酶扩增活性肽的 cD-
NA片段，PCＲ产物利用酶切、连接的方法构建至原
核表达载体 pET-21a中，并转化至 E． coli DH5α 中，
以双酶切和测序进行阳性克隆的筛选与鉴定。
1． 5 重组海蚯蚓纤溶酶的诱导表达与纯化鉴定
提取经鉴定确认的阳性重组质粒，转化至 E．
coli BL21(DE3) ，构建工程菌。工程菌单菌落在 1． 0
mM IPTG 中 30 ℃诱导培养 4 h(对照组未加入
IPTG) ;收集菌体后超声破碎，4 ℃ 12000 × g 离心
30 min，上清和沉淀各取 10 μL 进行 SDS-PAGE 分
析。将收集的菌体超声破碎后，取上清液过 Ni2 +树
脂柱，50 mL 洗涤液洗涤(20mM Tris-CL，pH7． 4，10
mM 咪唑，0． 5 M NaCl) ;用洗脱液(20 mM Tris-CL，
pH7． 4，500 mM 咪唑，0． 5M NaCl)洗脱结合蛋白，每
次加入 1 mL，共洗 5 次。
1． 6 重组海蚯蚓纤溶酶的纤维蛋白酶原激活活性
测定
在 50 mL TBS-HCL(50 mmol /L Tris-CL，pH
8. 0，150 mmol /L NaCl)缓冲液中加入 0． 5 g琼脂糖，
微波炉煮沸;加入 0． 5 g脱脂奶粉，混匀。冷却至 40
℃后加入 10 U牛血纤维蛋白溶酶原，混匀。铺 2 个
平皿，待凝固后打孔，加入 0． 5、1 μg /μL 重组蛋白，
以尿激酶(1 μg /μL)为阳性对照，以 PBS 为阴性对
照，37 ℃孵育 16 h 后，观察小孔周围有无透明圈的
形成。
2 实验结果
2． 1 海蚯蚓纤溶酶基因 cDNA 3端及 5端序列扩
增
以海蚯蚓消化组织 ＲNA 为模板，利用 3ＲACE
467 天然产物研究与开发 Vol. 27
和 5ＲACE 技术分别扩增出 3端及 5端序列，琼脂
糖凝胶电泳结果显示，3端和 5端扩增产物长度分
别约为 250bp 及 740bp(图 1，图 2)。测序后，应用
Contigexpress软件对海蚯蚓纤溶酶基因 cDNA 5端
和 3端序列进行拼接，获得海蚯蚓纤溶酶编码基因
的 DNA(mＲNA)序列。使用 DNAMAN软件，获得该
海蚯蚓纤溶酶 cDNA编码的氨基酸序列。该蛋白酶
由信号肽、前肽及成熟肽组成，成熟肽以 IIGG起始;
含丝氨酸蛋白酶家族高度保守序列 GDSGGP 及保
守的催化三联体(H79，D126，S213) (图 3)。
1% 2bp
2000
1000
750
500
250
图 1 3 ＲACE扩增产物
Fig. 1 Amplification product of 3 ＲACE
注:1:DNA分子量标准 DL2000;2:3 ＲACE产物
Note:1:DNA marker DL2000;2:product of 3 ＲACE
1% 2
bp
2000
1000
750
500
250
图 2 5 ＲACE 扩增产物
Fig. 2 Amplification product of 5 ＲACE
注:1:5 ＲACE 产物;2:DNA分子量标准 DL2000
Note:1:product of 5 ＲACE;2:DNA marker DL2000
2． 2 海蚯蚓纤溶酶 cDNA 编码的氨基酸序列的同
源性分析
登陆 NCBI，利用 Blast 在 GenBank 数据库和蛋
白质数据库进行同源性比较分析。结果显示尚无与
该基因具有明显相似性的序列，提示其可能为一新
图 3 海蚯蚓纤溶酶基因序列和氨基酸序列
Fig. 3 Gene sequence encoding fibrinolytic enzyme of A．
cristata and deduced amino acid sequence
注:信号肽以下划线表示;保守结构域以粗体表示;保守的催化三
联体(组氨酸、精氨酸、丝氨酸)以粗体和下划线表示;终止密码
以星号表示
Note:The putative signal peptide was underlined;the conservative do-
main was indicated by boldface;the conservative catalytic triad (histi-
dine，aspartic acid and serine)were indicated by boldface and under-
lined;a termination codon was indicated with asterisk．
基因。该海蚯蚓纤溶酶与蚯蚓蛋白酶比较，氨基酸
序列同源性为 ＜ 40%;海蚯蚓蛋白酶除与其他环节
动物的蛋白酶都具有 GDSGGP 高度保守序列外，在
一级结构上没有同源性。
2． 3 重组表达克隆的鉴定
筛选的阳性克隆经 Sac1 和 XhoI 双酶切，出现
705bp目的基因片断(图 4) ，经测序，序列与 ＲACE
克隆结果一致。
2． 4 重组蛋白的表达纯化
将重组表达载体转化至 E． coli BL21(DE3) ，诱
导表达后，结果如图 5 所示，在 27kDa处可见有重组
海蚯蚓纤溶酶融合蛋白，主要以包涵体形式存在，上
清中含量较少。上清液经 Ni2 +树脂柱纯化后获得
均质的融合蛋白(图 6)。
2． 5 重组海蚯蚓纤溶酶的纤维蛋白酶原激活活性
经平板法检测纯化的重组海蚯蚓纤溶酶的活
性。在加入纤维蛋白酶原的平板上，加重组蛋白和
尿激酶的小孔周围形成明显的透明圈(图 7) ;而不
567Vol. 27 鞠吉雨等:重组海蚯蚓纤溶酶的克隆、表达及活性鉴定
1% 2
bp
2000
1000
500
250
4000
7000
10000
图 4 重组表达克隆的酶切鉴定
Fig. 4 Identification of the recombinant clone by restriction
enzymes
注:1:DNA分子量标准 DL10000;2:Sac1-XhoI双酶切消化产物
Note:1:DNA marker DL10000;2:Sac1-XhoI double digestion of re-
combinant plasmid
1% 2% 3% 4% 5
kDa
116
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
图 5 重组原核表达载体的诱导表达
Fig. 5 Induced expression of the recombinant plasmid from
A． cristata protease
注:1、2:IPTG诱导后的菌体沉淀和上清;3:诱导的菌体蛋白;4:
未诱导的菌体蛋白;5:蛋白分子量标准
Note:1，2:supernatant and precipitate from induced E． coli by IPTG;
3:protein from induced E． coli;4:protein from uninduced E． coli;5:
protein marker
加纤维蛋白酶原的平板上，加重组蛋白和尿激酶的
小孔周围都没有透明圈形成。这说明该重组海蚯蚓
纤溶酶具有纤维蛋白酶原激活活性。
3 讨论
纤溶酶作为新型溶栓剂，主要来源于天然动植
物、微生物［6-9］。但由于分离提取存在操作繁琐、提
取纯度低、所需原材料多等缺点，因此，应用基因工
程技术获得有功能性的蛋白药物已成为该领域的研
究热点。纤溶酶大多属于丝氨酸蛋白酶家族，该家
1% 2
kDa
116
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
图 6 重组表达蛋白的纯化
Fig. 6 Purification of the recombinant protein
注:1:纯化的重组蛋白;2:蛋白分子量标准
Note:1:purified recombinant protein;2:protein marker
图 7 重组表达蛋白的体外活性测定
Fig. 7 In vitro fibrinolytic activity of the purified recombi-
nant protein
注:1:PBS;2:尿激酶(1 μg /μL) ;3、4:纯化的重组蛋白(0． 5 μg /
μL、1 μg /μL)
Note:1:PBS as a negative control;2:Urokinase (1μg /μL)as a posi-
tive control;3，4:the purified recombinant protein (0． 5 μg /μL、1
μg /μL)
族的蛋白酶催化活性中心 Ser 附近含高度保守序列
GDSGGP［10］，这为寻找已知功能蛋白的编码基因提
供了入手点。
本研究根据丝氨酸蛋白酶家族高度保守序列
GDSGGP设计引物，采用 3ＲACE和 5ＲACE技术从
海蚯蚓消化道上皮细胞中扩增出长度为 777bp的蛋
白质编码序列。该基因序列与 GenBank 数据库中
的其他基因序列没有明显的相似性;其氨基酸序列
在蛋白质数据库进行同源性搜索分析证明该基因为
一新发现的基因，且其蛋白序列中含有与其他丝氨
酸蛋白酶家族高度保守序列 GDSGGP，这提示我们
克隆到的海蚯蚓纤溶酶为丝氨酸蛋白酶家族的一个
新成员。海蚯蚓纤溶酶中还含有保守的催化三联体
(H83、D129、S225) ，由信号肽、前肽及成熟肽组成，
且其成熟肽即蛋白质的活性形式中含有保守的
667 天然产物研究与开发 Vol. 27
IVGG(第 36 ～ 39 位)序列［11］。进一步将海蚯蚓成
熟肽成功构建至原核表达载体 pET-21a 中，转化工
程菌，融合蛋白主要为包涵体，其上清经 Ni2 +树脂
柱纯化后，通过平板法证明该融合蛋白具有纤维蛋
白酶原激活活性，显示了间接的纤溶活性。丝氨酸
蛋白酶家族主要裂解纤维蛋白和纤维蛋白原中 Lys
或 Arg羧基端的肽键使其被降解成许多具有抗凝作
用的可溶性小肽［12］;有的纤溶酶还作为纤溶酶原激
活剂，间接发挥溶栓作用，如葡激酶［13］、普佑克(注
射用重组人尿激酶原，即 Pro-UK)［14］。
另外，就形态而言，海蚯蚓形似蚯蚓，故名海蚯
蚓;就种属而言，海蚯蚓与蚯蚓都属于环节动物门，
海蚯蚓属于多毛纲，蚯蚓属于寡毛纲。从蚯蚓中提
取的蚓激酶，具有良好的溶栓抗凝作用，使其在治疗
多种血栓性疾病方面取得很好的应用［15］。蚓激酶
(lumbrokinase，LK)就是从蚯蚓体内分离出的一组
20 ～ 40 kDa丝氨酸蛋白酶，也称蚯蚓纤溶酶(earth-
worm fibrinolytic enzyme，EFE) ，具有直接溶解纤维
蛋白及纤溶酶原激活作用［16-18］。
因此，我们推测:海洋生物海蚯蚓中也可能含有
一组具有溶栓作用的纤溶酶。我们期望能继续进行
海蚯蚓纤溶酶的克隆工作，并对克隆到的海蚯蚓纤
溶酶的溶栓活性进行比较，为进一步发现高效低毒
的具有溶栓作用的海洋创新药物提供科学依据。
总之，本研究从海洋环节生物海蚯蚓中克隆到
海蚯蚓纤溶酶的 cDNA 序列和氨基酸序列，并初步
证明其具有纤维蛋白酶原激活活性。这为海蚯蚓功
能基因组学和蛋白质组学研究奠定理论基础，也为
开发海洋生物新型溶栓药物提供新的思路和资源。
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