全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（１）： ５５ － ６１ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６􀆰 ０１􀆰 ００８
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（２０１３０３０１９⁃０２），国家科技支撑计划（２０１２ＢＡＤ１９Ｂ０６）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｗａｎｇｈａｉｈｏｎｇ２０２０＠ ｓｉｎａ． ｃｏｍ
收稿日期： ２０１５ － ０７ － ３０
参与烟粉虱免疫反应的 ｃｌｉｐ丝氨酸蛋白酶基因分析
于　 洁　 王登杰　 张林雅　 雷仲仁　 王海鸿∗
（中国农业科学院植物保护研究所， 植物病虫害生物学国家重点实验室， 北京 １００１９３）
摘要： 为了解参与烟粉虱免疫反应的 ｃｌｉｐ 丝氨酸蛋白酶（ ｃｌｉｐ⁃ｄｏｍａｉｎ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ Ｂｅｍｉｓｉａ
ｔａｂａｃｉ，ＢｔＣＬＩＰｓ）基因，对已鉴定的 ８ 个 ＢｔＣＬＩＰｓ 基因编码的蛋白进行序列分析，与冈比亚按蚊、家
蚕、黑腹果蝇、烟草天蛾 ４ 种模式昆虫的同源蛋白进行系统进化分析，并通过 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ检测球孢白
僵菌侵染烟粉虱 ４ 龄若虫后 ＢｔＣＬＩＰｓ 的时间表达模式。 结果显示，８ 个 ＢｔＣＬＩＰｓ 基因均为含有
ＣＬＩＰｓ结构域的丝氨酸蛋白酶基因；ＢｔＣＬＩＰ１９、ＢｔＣＬＩＰ２０ 和 ＢｔＣＬＩＰ２１ 独自聚在进化树的一支上；其
它 ＢｔＣＬＩＰｓ均与 ４ 种模式昆虫中的 １ 种或多种同源蛋白聚在一起；与对照相比，８ 个 ＢｔＣＬＩＰｓ 基因
受球孢白僵菌侵染后在不同时间的相对表达量均上调，但诱导程度不同，４８ ｈ 的相对表达量达最
高，其中 ＢｔＣＬＩＰ１９ 上调表达最明显，为对照组的 ７１ 倍。 研究表明，８ 个 ＢｔＣＬＩＰｓ 可能参与烟粉虱对
真菌侵染的免疫反应，并成为烟粉虱生物防治的新靶标。
关键词： 烟粉虱； 丝氨酸蛋白酶； ｃｌｉｐ结构域； 免疫反应
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｃｌｉｐ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ
ｏｆ Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ （Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ： Ａｌｅｙｒｏｄｉｄａｅ）
Ｙｕ Ｊｉｅ　 Ｗａｎｇ Ｄｅｎｇｊｉｅ　 Ｚｈａｎｇ Ｌｉｎｙａ　 Ｌｅｉ Ｚｈｏｎｇｒｅｎ　 Ｗａｎｇ Ｈａｉｈｏｎｇ∗
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｅｓｔｓ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｃｌｉｐ⁃ｄｏｍａｉｎ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｗｈｉｔｅｆｌｙ Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ， ｅｉｇｈｔ ＣＬＩＰ ｓｅｒｉｎｅ
ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ Ｂ． ｔａｂａｃｉ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ＣＬＩＰｓ ｉｎ Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ， Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ， Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｄｕｃａ
ｓｅｘｔａ． Ｔｈｅ ４ｔｈ ｉｎｓｔａｒ Ｂ． ｔａｂａｃｉ ｎｙｍｐｈｓ ｗｅｒｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｐｓ
ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｑＲＴ⁃ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｉｇｈｔ ＢｔＣＬＩＰｓ
ｇｅｎｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ＣＬＩＰ ｄｏｍａｉｎ； ＢｔＣＬＩＰ１９， ＢｔＣＬＩＰ２０ ａｎｄ ＢｔＣＬＩＰ２１ ｆｏｒｍｅｄ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌａｄｅ． Ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ
ＢｔＣＬＩＰｓ ｗｅｒｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ ｃｌｏｓｅ ｔｏ ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｍｏｄｅｌ ｉｎｓｅｃｔｓ．
Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｉｇｈｔ ＢｔＣＬＩＰｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｂ． ｔａｂａｃｉ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｂ． ｂａｓｓｉａｎａ ｗｅｒｅ ｕｐ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｎｄ
ｐｅａｋｅｄ ａｔ ４８ ｈ． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ＢｔＣＬＩＰ１９ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｍｏｎｇ ａｌｌ ＢｔＣＬＩＰｓ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ７１
ｆｏｌｄｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｔｈｅ ｅｉｇｈｔ ＢｔＣＬＩＰｓ ｇｅｎｅｓ ｐｒｏｂａｂｌｙ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｎｇｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａ ｎｅｗ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｂ． ｔａｂａｃｉ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ； ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ； ｃｌｉｐ ｄｏｍａｉｎ； ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ
　 　 丝氨酸蛋白酶（ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ＳＰｓ）是一类以丝
氨酸为活性中心的蛋白水解酶，在昆虫中主要参与消
化、发育和先天免疫反应等重要生理过程（Ｒａｗｌｉｎｇｓ
＆ Ｂａｒｒｅｔｔ，１９９３；Ｋｒｅｍ ＆ Ｃｅｒａ，２００２；Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ． ，２００６）。
典型的 ＳＰｓ包含 １个催化三联，该催化三联含有 ３ 个
氨基酸残基：组氨酸（Ｈｉｓ）、天冬氨酸（Ａｓｐ）和丝氨酸
（Ｓｅｒ），并且分别被嵌入在 ＴＡＡＨＣ、ＤＩＡＬ 和 ＧＤＳＧＧ
三个高度保守的序列基序中（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ． ，２００６；Ｚｈａｏ ｅｔ
ａｌ． ，２０１０）。 含有 ｃｌｉｐ 结构的丝氨酸蛋白酶（ｃｌｉｐ⁃ｄｏ⁃
ｍａｉｎ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ＣＬＩＰｓ）在先天免疫反应中发挥
着重要作用，ＣＬＩＰｓ在其 Ｎ端至少有 １ 个起调控作用
的 ｃｌｉｐ结构域，Ｃ端含有 １个起催化作用的丝氨酸蛋
白酶结构域，每个 ｃｌｉｐ结构域含有 ６ 个保守的半胱氨
酸残基，形成 ３ 对二硫键，可能介导丝氨酸蛋白酶级
联通路中的蛋白相互作用（Ｊｉａｎｇ ＆ Ｋａｎｏｓｔ，２０００）。
ＣＬＩＰｓ在昆虫先天免疫反应中参与到血淋巴黑化和
抗菌肽合成的 ２个重要过程（Ｋａｎｏｓｔ ｅｔ ａｌ． ，２００４；Ｚｈａｏ
ｅｔ ａｌ． ，２００７，Ａｎ ｅｔ ａｌ． ，２００９）。
研究发现，聚集到相同进化分支中的不同昆虫
的丝氨酸蛋白酶执行类似的功能，如朱洋铿等
（２０１１）发现烟草天蛾 Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ （Ｌｉｎｎａｅｕｓ）的
ＨＰ８、黑腹果蝇 Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ｍｅｉｇｅｎ 的
Ｅａｓｔｅｒ和 ＳＰＥ 以及黄粉虫 Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ Ｌｉｎｎａｅｕｓ
的 ＳＰＥ的进化关系较近；Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ􀆰 （２００８）建立
了 １４ 种褐新西兰肋翅鳃金龟甲 Ｃｏｓｔｅｌｙｔｒａ ｚｅａｌａｎｄｉｃａ
（Ｗｈｉｔｅ）的丝氨酸蛋白酶系统进化树，发现第 １ 与第
４ 进化支具有类胰蛋白酶活性，第 ２ 与第 ３ 进化支
具有类胰凝乳蛋白酶活性；黑腹果蝇、烟草天蛾等模
式昆虫的 ＣＬＩＰｓ在免疫反应中的作用已有深入研究
（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ． ，２００３；Ａｎ ｅｔ ａｌ． ，２００９）。 因此，通过将
靶标昆虫与模式昆虫的 ＣＬＩＰｓ 蛋白建立系统发育
树，可在一定程度上推测其在免疫反应中的具体
功能。
昆虫受到病原物侵染不同时间后，丝氨酸蛋白
酶基因的 ｍＲＮＡ 表达量会发生不同变化。 朱洋铿
等（２０１１）报道，菜粉蝶 Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ （Ｌｉｎｎａｅｕｓ）注射
大肠杆菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 和巴斯德毕赤酵母 Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ能明显提高 Ｐｒ⁃ＳＰ１ 转录水平；桔小实蝇 Ｂａｃ⁃
ｔｒｏｃｅｒａ ｄｏｒｓａｌｉｓ （Ｈｅｎｄｅｌ）的丝氨酸蛋白酶基因 ｍＲ⁃
ＮＡ 的表达量随蛹的发育逐渐降低 （胡黎明等，
２０１２）；家蚕 Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＢｍＳＰＩ３７ 在大肠杆菌诱导
后 ３ ～ １２ ｈ 缓慢上调表达；在黑胸败血菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｏｍｂｙｓｅｐｔｉｅｕｓ诱导 ３、６、１２ ｈ 后表达量均强烈上调；
在球孢白僵菌 Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ （Ｂａｌｓ． ） Ｖｕｉｌｌ诱导
后前 １２ ｈ 表达量变化不大，２４ ｈ 上调表达量达 ７􀆰 １
倍（李游山等，２０１２）。 不同的物种在受到病原物侵
染不同时间后，其丝氨酸蛋白酶基因表达量发生着
不同的动态变化。
烟粉虱 Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ （Ｇｅｎｎａｄｉｕｓ）是蔬菜、花卉
和棉花等经济作物上的重要害虫 （ Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ． ，
１９９５）。 应用球孢白僵菌防治烟粉虱已成为一种有
效的生物防治途径（Ｆａｒｉａ ＆ Ｗｒａｉｇｈｔ，２００１；王登杰
等，２０１４；２０１５）。 目前国内外对昆虫 ＣＬＩＰｓ 的研究
主要以家蚕、黑腹果蝇、烟草天蛾等为对象（Ｒｏｓｓ ｅｔ
ａｌ． ，２００３；Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ． ，２００６；Ａｎ ｅｔ ａｌ． ，２００９），而针对
重要农业害虫的相关研究甚少。 因此，为了解烟粉
虱 ＣＬＩＰｓ基因家族，本试验分析了烟粉虱 ８ 个 ＣＬＩＰｓ
基因编码的氨基酸序列，并与冈比亚按蚊 Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ
ｇａｍｂｉａｅ （Ｇｉｌｅｓ）、家蚕、黑腹果蝇、烟草天蛾 ４ 种模
式昆虫的 ＣＬＩＰｓ氨基酸序列进行系统进化分析，运
用 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ 技术研究烟粉虱被球孢白僵菌侵染后
ＣＬＩＰｓ基因的 ｍＲＮＡ 转录水平，旨在明确 ＣＬＩＰｓ 基
因在烟粉虱先天免疫反应中的作用，以期为更有效
地防治烟粉虱提供理论依据。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试昆虫及真菌：烟粉虱 Ｑ 生物型采集自中国
农业科学院植物保护研究所河北廊坊实验基地番茄
Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌｌ．上，根据线粒体 ＤＮＡ 上
的 ＣＯＩ基因序列鉴定生物型（罗晨等，２００２），用株
高 ２５ ｃｍ健康番茄幼苗饲养于养虫室内，饲养条件
为温度 ２６℃、光周期 Ｌ １２ ｈ ∶ Ｄ １２ ｈ。 供试真菌为球
孢白僵菌菌株 ＧＺＧＹ⁃１⁃３，保藏于中国普通微生物菌
种保藏中心，该菌株对烟粉虱具有高致病性（王登
杰等，２０１４；２０１５）。
试剂及培养基：总 ＲＮＡ 提取试剂盒 Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａ⁃
ｇｅｎｔ 试剂，美国 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司；Ｒｎａｓｅ⁃Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ，
日本 ＴａＫａＲａ 公司； ＧｏＴａｑ® ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 试剂
盒，美国 Ｐｒｏｍｅｇａ 公司。 培养基参照王登杰等
（２０１４）的方法配置，玉米粉 ２％ 、麦麸 １％ 、蛋白胨
０􀆰 ５％ 、ＫＨ２ＰＯ４ ０􀆰 ３％ 、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 １％ 、ＮＨ４ＮＯ３
０􀆰 １％ 、琼脂 ２％ 、无菌水 ９６％ 。
仪器：ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ 型分光光度计，美国 Ｔｈｅｒ⁃
ｍｏ 公司； ＴＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ，德国 Ｂｉｏｍｅｔｒａ
公司；Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，美国 Ｐｒｏｍｅｇａ 公
司； ７５００ Ｒｅａｌ⁃Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ 系统，美国 Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ ＢｔＣＬＩＰｓ的氨基酸序列分析
ＢｔＣＬＩＰｓ基因来自于本实验室第 ２ 代高通量测
序结果（王登杰等，２０１５）。 将初步筛选得到的基因
６５ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
在 ＮＣＢＩ的 ＮＲ核酸数据库中通过 ＢＬＡＳＴＸ 算法进
行搜索，当 Ｅ 值小于 １０ － ５时进一步确定为 ＢｔＣＬＩＰｓ
基因。 利用 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ 预测 ＢｔＣＬＩＰｓ 的开放阅读
框，并获得氨基酸序列；利用 Ｐｆａｍ （ ｈｔｔｐ： ／ ／ ｐｆａｍ．
ｘｆａｍ􀆰 ｏｒｇ ／ ｓｅａｒｃｈ）和 ＳＭＡＲＴ（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｓｍａｒｔ􀆰 ｅｍｂｌ􀆰 ｄｅ ／ ）
预测 ＢｔＣＬＩＰｓ的蛋白质结构域；利用 ＭＥＧＡ ６􀆰 ０ 软
件进行 ＢｔＣＬＩＰｓ的氨基酸多序列比对。
１􀆰 ２􀆰 ２ ＣＬＩＰｓ的系统进化分析
利用 ＭＥＧＡ ６􀆰 ０ 软件，对 ＢｔＣＬＩＰｓ 编码的蛋白
与冈比亚按蚊、家蚕、黑腹果蝇、烟草天蛾 ４ 种模式
昆虫的 １２ 个同源蛋白进行系统进化分析，１２ 个同
源蛋白分别为 ＡｇＣＬＩＰＢ１（ＡＡＤ３８３３５􀆰 １）、ＡｇＣＬＩＰＢ４
（ ＡＡＢ６２９２９􀆰 １ ）、 ＡｇＣＬＩＰＢ８ （ ＣＡＤ３０８３９􀆰 １ ）、 Ｂｍ⁃
ＣＬＩＰ１（ＢＡＡ７６３０８􀆰 １）、ＢｍＨＰ１４（ＡＦＫ９３５３４􀆰 １）、Ｂｍ⁃
ＨＰ２１ （ ＪＦ４３１０７３ ）、 ＤｍＥａｓｔｅｒ （ ＮＰ ＿ ５２４３６２􀆰 ２ ）、
ＤｍＭＰ１ （ ＡＡＮ１３３００􀆰 ２ ）、 ＤｍＳＰＺ （ ＮＰ ＿ ６５１１６８􀆰 １ ）、
ＭｓＨＰ１ （ ＡＡＢ９４５５７􀆰 １ ）、 ＭｓＨＰ６ （ ＡＡＶ９１００４􀆰 １ ）、
ＭｓＨＰ８（ＡＡＶ９１００６􀆰 １）。 采用邻接法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃ｊｏｉｎ⁃
ｉｎｇ，ＮＪ）构建系统进化树，并用 １ ０００ 次重复进行自
举检验。
１􀆰 ２􀆰 ３ ＢｔＣＬＩＰｓ基因的 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ检测
在室内用培养基培养菌株 ＧＺＧＹ⁃１⁃３ 获得分生
孢子粉，培养条件为温度 ２６℃、光周期 Ｌ １２ ｈ ∶ Ｄ １２
ｈ。 用灭菌的 ０􀆰 ０５％吐温 － ８０ 溶液配置 １􀆰 ０ × １０８
个 ／ ｍＬ的球孢白僵菌孢子悬浮液备用。 选取 １０ 株
高 ２５ ｃｍ且未被烟粉虱定殖的番茄幼苗置于养虫笼
（３５ ｃｍ ×４２ ｃｍ ×４５ ｃｍ）中，２４ ｈ后将幼苗取出并去
除叶片上的成虫，然后放到另 １ 个无烟粉虱的养虫
笼中饲养。 １５ ｄ 后将带有 ４ 龄若虫的整个叶片剪
下，浸泡于 １􀆰 ０ × １０８ 个 ／ ｍＬ的球孢白僵菌孢子悬浮
液中 １０ ｓ，自然晾干后放在含有 １％的琼脂培养皿
　 　 　
中，置于 ２６℃、Ｌ １２ ｈ︰Ｄ １２ ｈ条件下培养。 在处理
１２、２４、３６ 和 ４８ ｈ后，分别收集 １００ 头存活的烟粉虱
４ 龄若虫，收集后立即放入液氮中冻存备用，以未经
球孢白僵菌孢子悬浮液处理的作对照。
用 １ ｍＬ Ｔｒｉｚｏｌ重悬 １００ 头烟粉虱样品，按 Ｔｒｉｚｏｌ
Ｒｅａｇｅｎｔ说明提取总 ＲＮＡ，ＲＮＡ 纯度及定量则采用
紫外分光光度计进行测定，ＯＤ２６０ ／ ２８０处于 １􀆰 ９ ～ ２􀆰 １
之间及 ＯＤ２６０ ／ ２３０为 ２􀆰 １ 的 ＲＮＡ 备用。 随后依据 Ｒｅ⁃
ｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ 以 ２ μｇ ／ μＬ 总 ＲＮＡ 为模
板制备 ｃＤＮＡ 第一链，加入总 ＲＮＡ １􀆰 ０ μＬ、Ｏｌｉｇｏ
（ｄＴ） １５ Ｐｒｉｍｅｒ １􀆰 ０ μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ⁃Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ８􀆰 ０ μＬ，
混匀后 ７０℃变性 ５ ｍｉｎ，完成后置于冰上。
向 ２００ μＬ样品管中加入 ＲＴ⁃Ｍｉｘ １０ μＬ（Ｎｕｃｌｅ⁃
ａｓｅ⁃Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ １􀆰 ６ μＬ、Ｇｏｓｃｒｉｐｔ ５ × Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ
４􀆰 ０ μＬ、２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＣｌ２ ２􀆰 ０ μＬ、ＰＣＲ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｍｉｘ １􀆰 ０ μＬ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＲＮａｓｉｎ® Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎ⁃
ｈｉｂｉｔｏｒ ０􀆰 ４ μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １􀆰 ０ μＬ）。 反转
录程序：２５℃退火 ５ ｍｉｎ，４２℃延伸 ６０ ｍｉｎ，７０℃逆转
录酶失活 １５ ｍｉｎ，４℃终止反应。 将所得 ｃＤＮＡ稀释
１０ 倍后用于 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ反应。
根据烟粉虱转录组测序的结果 （王登杰等，
２０１５），利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５􀆰 ０软件设计引物用于 Ｂｔ⁃
ＣＬＩＰｓ基因的荧光检测（表 １）。 依据 ＧｏＴａｑ® ｑＰＣＲ
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ试剂盒进行 ＰＣＲ反应，反应体系为２０ μＬ：
Ｎｕｃｌｅａｓｅ⁃Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ７ μＬ、ＧｏＴａｑ® ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
１０ μＬ、上下游引物各 ０􀆰 ５ μＬ、ｃＤＮＡ２ μＬ。 反应程序
为 ９５℃预变性 ２ ｍｉｎ，９５℃变性 １５ ｓ，６０℃退火和延伸
共 １ ｍｉｎ，进行 ４０个循环；最后以 ０􀆰 ０１℃ ／ ｓ的速度从
６５ ～９５℃记录熔解曲线。 采用相对定量法，依据各样
品和其相对应的 １８Ｓ 的 Ｃｔ 值，参照 ２ － ΔΔＣｔ （Ｌｉｖａｋ ＆
Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１）方法进行分析。
表 １ 烟粉虱 ｃｌｉｐ丝氨酸蛋白酶基因 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｑＲＴ⁃ＰＣＲ ｏｆ ｃｌｉｐ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ
基因名称
Ｇｅｎｅ ｎａｍｅ
正向引物（５′ － ３′）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ
反向引物（５′ － ３′）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ
ＢｔＣＬＩＰ８ ＡＴＣＡＣＣＣＴＴＧＣＣＣＴＣＧＴＡ ＡＡＧＴＣＡＧＣＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴ
ＢｔＣＬＩＰ１６ ＧＧＧＴＧＣＣＡＣＡＴＣＴＴＴＣＧＧ ＡＧＣＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＴＣ
ＢｔＣＬＩＰ１８ ＣＣＡＧＧＡＡＡＣＧＴＡＧＴＣＧＴＡＡＡＣＣ ＣＡＧＧＡＣＧＧＣＴＣＧＡＡＧＡＡＧ
ＢｔＣＬＩＰ１９ ＡＡＧＣＣＴＣＡＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣ ＴＧＣＣＣＡＧＴＡＧＡＴＧＴＣＴＣＣＡＡ
ＢｔＣＬＩＰ２０ ＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＧＣＴＣＴ ＣＧＧＧＴＴＣＧＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴ
ＢｔＣＬＩＰ２１ ＴＧＣＴＣＧＴＣＧＣＣＧＡＴＧＡＡＧ ＧＧＧＡＣＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＧＡＡ
ＢｔＣＬＩＰ２４ ＴＴＴＣＴＣＣＣＴＣＧＧＧＴＡＴＣＣＴＧ ＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣ
ＢｔＣＬＩＰ２８ ＡＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣ ＴＣＣＣＧＡＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＴＧ
Ａｃｔｉｎ ＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＡＴＣＣＴＴＣＴＴＧ ＣＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＴ
７５１ 期 于　 洁等： 参与烟粉虱免疫反应的 ｃｌｉｐ丝氨酸蛋白酶基因分析
１􀆰 ３ 数据分析
利用 ＳＡＳ ９􀆰 ２ 软件进行统计分析，采用 Ｄｕｎｃａｎ
氏新复极差法进行差异显著性检验。
２ 结果与分析
２􀆰 １ ＢｔＣＬＩＰｓ的氨基酸序列分析
通过蛋白质结构域预测发现，烟粉虱有 ８ 个丝
氨酸蛋白酶基因含有 ｃｌｉｐ 结构域，分别是 ＢｔＣＬＩＰ８、
ＢｔＣＬＩＰ１６、ＢｔＣＬＩＰ１８、ＢｔＣＬＩＰ１９、ＢｔＣＬＩＰ２０、ＢｔＣＬＩＰ２１、
ＢｔＣＬＩＰ２４、ＢｔＣＬＩＰ２８。 对 ８ 个 ＢｔＣＬＩＰｓ的结构进行分
析，发现其 ｃｌｉｐ结构域在烟粉虱中是相对保守的，它
们包含 ６ 个半胱氨酸残基，可以形成 ３ 个二硫键（图
１）；对丝氨酸蛋白酶催化活性比较重要的 Ｈｉｓ、Ａｓｐ
和 Ｓｅｒ这 ３ 个氨基酸残基也存在于 ＣＬＩＰｓ 的 Ｃ 端丝
氨酸蛋白酶结构域，并且其 Ｃ 端结构域中有 ６ 个保
守的半胱氨酸残基也有可能形成 ３ 个稳定的二硫
键；在 ＣＬＩＰｓ的 Ｎ端和 Ｃ端交界处还发现了 １ 个可
能的剪切位点，预示水解可能发生在 ｃｌｉｐ⁃ｄｏｍａｉｎ 和
ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ 之间（图 ２）。
图 １ 烟粉虱 ８ 个 ＣＬＩＰｓ蛋白 Ｎ端 ｃｌｉｐ结构域序列比对
Ｆｉｇ． １ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ⁃ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃｌｉｐ⁃ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ ｃｌｉｐ⁃ｄｏｍａｉｎ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ
红色字体表示保守的半胱氨酸； 连线表示烟粉虱 ＣＬＩＰｓ中保守的二硫键； “·”代表序列比对的空位。 Ｒｅｄ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉ⁃
ｃａｔｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅ； ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ ｌｉｎｅｓ ｄｅｎｏｔｅ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｉｎ ｃｌｉｐ⁃ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ Ｂ． ｔａｂａｃｉ； “·” ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｖａｃａｎｃｉｅｓ．
　
２􀆰 ２ ＣＬＩＰｓ的系统进化分析
将 ８ 个 ＢｔＣＬＩＰｓ的氨基酸序列与 ４ 种模式昆虫
的 １２ 个不同 ＣＬＩＰｓ的氨基酸序列进行比对，然后用
邻接法构建系统进化树，结果发现 ＢｔＣＬＩＰ１９、Ｂｔ⁃
ＣＬＩＰ２０、ＢｔＣＬＩＰ２１ 独自聚在进化树的一支上，表现
出较近的亲缘关系（图 ３），而在 ４ 种模式昆虫中没
有发现同源蛋白；其余 ＢｔＣＬＩＰｓ 均与模式昆虫的 １
个或多个同源蛋白聚在一起，其中 ＢｔＣＬＩＰ８ 与烟草
天蛾 ＭｓＨＰ１、ＢｔＣＬＩＰ８ 与家蚕 ＢｍＨＰ２１、ＢｔＣＬＩＰ２８ 与
烟草天蛾 ＭｓＨＰ６ 分别位于同一进化支上。
２􀆰 ３ ＢｔＣＬＩＰｓ基因的诱导表达分析
烟粉虱受球孢白僵菌侵染后，８ 个 ＢｔＣＬＩＰｓ基因
的相对变化量均有显著变化，感染 ４８ ｈ 后的相对表
达量到最高，其中，ＢｔＣＬＩＰ１９ 的相对表达量最高，其
次为 ＢｔＣＬＩＰ２１ 和 ＢｔＣＬＩＰ２４。 ＢｔＣＬＩＰ８、ＢｔＣＬＩＰ１９、Ｂｔ⁃
ＣＬＩＰ２１、ＢｔＣＬＩＰ２８、ＢｔＣＬＩＰ２４ 的相对表达量均为先
上调表达，后下调表达，在 ４８ ｈ 时急剧升高至最大
值，分别为对照组的 ２７、７１、６０、２１ 和 ５１ 倍； Ｂｔ⁃
ＣＬＩＰ１６ 的相对表达量一直处于高水平，在 ４８ ｈ时最
高，为对照组的 ３５ 倍；ＢｔＣＬＩＰ１８ 的相对表达量一直
处于上调表达，在 ４８ ｈ 时相对表达量最高，为对照
组的 ３２ 倍；ＢｔＣＬＩＰ２０ 在 ２４ ｈ 前相对表达量相对较
稳定，但在 ３６ ｈ 后开始呈上调表达，４８ ｈ 时达对照
组的 ４７ 倍（图 ４）。
３ 讨论
本试验鉴定的 ８ 个 ＢｔＣＬＩＰｓ 基因的氨基酸序列
均具有 ＣＬＩＰｓ 的典型特征，Ｎ 端包含 ６ 个半胱氨酸
残基形成的 ３ 个二硫键，由 ４４ ～ ５５ 个氨基酸组成
ｃｌｉｐ结构域；Ｃ 端也包含 ３ 个氨基酸残基的催化三
联体，被嵌入在保守的序列基序中，此结果与已知昆
虫的 ＣＬＩＰｓ 蛋白质特征相一致（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ． ，２００３；
Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ． ，２００６；Ａｎ ｅｔ ａｌ． ，２００９）。 在黑腹果蝇、欧
洲蜜蜂和烟草天蛾中分别发现了 ３７、１８ 和 １４ 个基
因编码 ＣＬＩＰｓ（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ． ，２００３；Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ． ，２００６；Ａｎ
ｅｔ ａｌ． ，２００９），因此，还需要进一步探究可能存在的
其它烟粉虱 ＢｔＣＬＩＰｓ基因。
鉴定的 ８ 个 ＢｔＣＬＩＰｓ与模式昆虫免疫功能不同
的 ＣＬＩＰｓ在进化关系上相近。 其中，ＢｔＣＬＩＰ８ 与烟草
天蛾 ＭｓＨＰ１、ＢｔＣＬＩＰ８ 与家蚕 ＢｍＨＰ２１、ＢｔＣＬＩＰ２８ 与
烟草天蛾 ＭｓＨＰ６ 分别位于同一进化支上，说明可能
来源于共同的祖先，且在先天免疫反应中执行类似
８５ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
图 ２ ＢｔＣＬＩＰｓ蛋白 Ｃ端丝氨酸蛋白酶结构域的序列比对
Ｆｉｇ． ２ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ⁃ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ ｃｌｉｐ⁃ｄｏｍａｉｎ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ
蓝色字体表示预测剪切位点； 红色字体表示保守的半胱氨酸； 连线表示烟粉虱 ＣＬＩＰｓ 中保守的二硫键； Ｈ、Ｓ、Ｄ 蓝色
阴影分别代表组氨酸、天冬氨酸、代表丝氨酸； 黑点代表序列比对的空位。 Ｂｌｕｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ； ｒｅｄ
ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅ； ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ ｌｉｎｅｓ ｄｅｎｏｔｅ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｉｎ ｃｌｉｐ⁃ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ Ｂ． ｔａｂａｃｉ； Ｈ， Ｄ， Ｓ ｉｎ
ｂｌｕｅ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ， ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｓｅｒｉｎｅ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ｂｌａｃｋｓｐｏｔ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｖａｃａｎｃｉｅｓ．
　
的功能。 ＭｓＨＰ１ 在酚氧化酶原级联反应中发挥作
用，促使酚氧化酶催化产生黑色素，形成黑化反应
（Ｊｉａｎｇ，２００８）；ＢｍＨＰ２１ 在家蚕黑化反应中起着激活
酚氧化酶原前体激酶的作用，参与黑化反应，但还可
能有其它的生理功能（刘碧朗等，２０１１），ＢｔＣＬＩＰｓ 基
因在烟粉虱免疫反应中的功能还需进一步研究。
ＢｔＣＬＩＰ１９、ＢｔＣＬＩＰ２０、ＢｔＣＬＩＰ２１ 独自聚在进化树的一
支上，推测它们可能参与烟粉虱特有的级联路径，且
与 ＢｔＣＬＩＰ１８ 和烟草天蛾 ＭｓＨＰ８ 聚为一类，表明可
能具有类似的功能，其中 ＭｓＨＰ８ 在先天免疫反应中
会被病原物激活继而剪切 ｐｒｏｓｐäｔｚｌｅ 产生活性因子
Ｃ１０８，诱导抗菌肽的合成（Ａｎ ｅｔ ａｌ． ，２００９）。 基于以
上结果推测 ＢｔＣＬＩＰｓ基因可能在烟粉虱先天免疫反
应的血淋巴黑化及抗菌肽形成过程中发挥作用。
王钰等（２０１３）报道，与对照相比，家蚕中肠内
丝氨酸蛋白酶基因 ｓｐ１、ｓｐ３、ｓｐ５ 和 ｓｐ１２ 在接种家蚕
微孢子虫 ２４ ｈ 与 ４８ ｈ 后相对表达量均上调，其中
ｓｐ５ 上调最明显；ｓｐ８ 和 ｓｐ１１ 在受微孢子虫感染 ２４ ｈ
后表达上调，而 ４８ ｈ后表达量下调。 本研究也有类
似现象，烟粉虱在受到球孢白僵菌侵染后，８ 个
ＣＬＩＰｓ基因均发生不同程度的诱导，而且不同 Ｂｔ⁃
ＣＬＩＰｓ上调倍数不同，表明其参与烟粉虱免疫反应
的程度或途径不尽相同，说明本研究鉴定的 ８ 个 Ｂｔ⁃
ＣＬＩＰｓ可能参与了烟粉虱对于真菌侵染的免疫应答
反应，ＢｔＣＬＩＰｓ可能成为烟粉虱生防的新靶标。
李玉欣等（２０１２）发现 ＢｍＨＰ１４ 在家蚕 ５ 龄第 ３
天幼虫的脂肪体中表达水平最高，经不同病原物诱
导后，脂肪体中的 ＢｍＨＰ１４ 均呈现诱导表达上调，
９５１ 期 于　 洁等： 参与烟粉虱免疫反应的 ｃｌｉｐ丝氨酸蛋白酶基因分析
图 ３ 烟粉虱与 ４ 种模式昆虫 ＣＬＩＰｓ的系统进化关系
Ｆｉｇ． ３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｃｌｉｐ⁃ｄｏｍａｉｎ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ ａｎｄ ｆｏｕｒ ｍｏｄｅｌ ｉｎｓｅｃｔｓ
　
图 ４ 烟粉虱 ８ 个 ＣＬＩＰｓ在不同时间的相对表达量
Ｆｉｇ． ４ Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｉｇｈｔ ｃｌｉｐ⁃ｄｏｍａｉｎ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅｓ
图中数据为平均数 ±标准误。 不同小写字母表示经 Ｄｕｎｃａｎ 氏新复极差法检验在 Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ 水平差异显著。 Ｄａｔａ ａｒｅ
ｍｅａｎ ± ＳＥ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ ｂｙ Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｎｅｗ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ．
　
但表达强度和持续时间不相同；朱洋铿等（２０１１）利
用大肠杆菌分别对菜粉蝶不同虫态和虫龄进行免疫
诱导，ＰｒＳＰ１ 的转录水平差异较大，其转录水平随着
虫龄的增长而上升。 因此，关于烟粉虱 ＢｔＣＬＩＰｓ 基
因在不同虫态、不同部位以及应答模式等方面的相
对表达量还需要进一步研究。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
Ａｎ ＣＪ， Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ Ｊ， Ｒａｇａｎ ＥＪ， Ｊｉａｎｇ ＨＢ， Ｋａｎｏｓｔ Ｍ． ２００９． Ｆｕｎｃ⁃
ｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ＨＰ６ ａｎｄ ＨＰ８ ｉｎ
ｔｗｏ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｐａｔｈｗａｙｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
２８４（２９）： １９７１６ － １９７２６
Ｂｒｏｗｎ ＪＫ， Ｆｒｏｈｌｉｃｈ ＤＲ， Ｒｏｓｅｌｌ ＲＣ． １９９５． Ｔｈｅ ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ ｏｒ ｓｉｌｖｅｒ⁃
ｌｅａｆ ｗｈｉｔｅｆｌｉｅｓ： ｂｉｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ ｏｒ ａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｏｍｐｌｅｘ？
Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ， ４０（１）： ５１１ － ５３４
Ｆａｒｉａ Ｍ， Ｗｒａｉｇｈｔ ＳＰ． ２００１． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ
ｗｉｔｈ ｆｕｎｇｉ． Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０（９）： ７６７ － ７７８
Ｈｕ ＬＭ， Ｚｅｎｇ Ｌ， Ｓｈｅｎ ＪＭ， Ｂｉｎ ＳＹ， Ｌｉａｏ ＨＺ， Ｃｈｅｎ ＧＦ， Ｌｉｎ ＪＴ．
２０１２． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ ｉｎ
Ｂａｃｔｒｏｃｅｒａ ｄｏｒｓａｌｉｓ （Ｈｅｎｄｅｌ） （Ｄｉｐｔｅｒａ： Ｔｅｐｈｒｉｔｉｄａｅ）． Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ ＆ Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ４０（７）： ７０ － ７６ （ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［胡黎明， 曾玲， 申建梅， 宾淑英， 廖泓之， 陈高峰， 林进
添． ２０１２． 桔小实蝇丝氨酸蛋白酶基因（ＢｄｏｒＳｅｒ）的克隆与
表达分析． 西北农林科技大学学报， ４０（７）： ７０ － ７６］
Ｊｉａｎｇ ＨＢ． ２００８． Ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ
０６ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ． Ｉｎｓｅｃｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １５（１）： ５３ － ６６
Ｊｉａｎｇ ＨＢ， Ｋａｎｏｓｔ ＭＲ． ２０００． Ｔｈｅ ｃｌｉｐ⁃ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏ⁃
ｔｅｉｎａｓｅｓ ｉｎ ａｒｔｈｒｏｐｏｄｓ． Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ⁃
ｏｇｙ， ３０（２）： ９５ － １０５
Ｋａｎｏｓｔ ＭＲ， Ｊｉａｎｇ ＨＢ， Ｙｕ ＸＱ． ２００４． Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ａ
ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ ｉｎｓｅｃｔ， Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，
１９８（１）： ９７ － １０５
Ｋｒｅｍ ＭＭ， Ｃｅｒａ ＥＤ． ２００２． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｃａｓｃａｄｅｓ ｆｒｏｍ ｅｍ⁃
ｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｏ ｂｌｏｏｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ⁃
ｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２７（２）： ６７ － ７４
Ｌｉ ＹＳ， Ｚｈａｏ Ｐ， Ｄｏｎｇ ＺＭ， Ｚｏｕ Ｙ， Ｘｉａ ＱＹ， Ｘｉａｎｇ ＺＨ． ２０１２． Ｃｌｏ⁃
ｎｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ⁃ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ
ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＢｍＳＰＩ３７． Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ Ｓｉｎｉｃａ，
４５（２３）： ４８９８ － ４９０８ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［李游山，赵萍， 董照明，
邹勇， 夏庆友， 向仲怀． ２０１２． 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂
ＢｍＳＰＩ３７的克隆、表达及微生物诱导分析． 中国农业科学，
４５（２３）： ４８９８ － ４９０８］
Ｌｉ ＹＸ， Ｑｉ ＸＷ， Ｈａｎ Ｑ， Ｘｕ ＹＭ， Ｈｅ ＮＪ． ２０１２． Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ＢｍＨＰ１４ ｉｎ ｔｈｅ
ｓｉｌｋｗｏｒｍ， Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， ３８（５）： ８１４ －
８２１ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［李玉欣， 亓希武， 韩琦， 徐云敏， 何宁
佳． ２０１２． 家蚕丝氨酸蛋白酶 ＢｍＨＰ１４ 基因的克隆与表达
模式分析． 蚕业科学， ３８（５）： ８１４ － ８２１］
Ｌｉｕ ＢＬ， Ｌｉ ＹＸ， Ｑｉ ＸＷ， Ｘｉａｎｇ ＺＨ， Ｈｅ ＮＪ． ２０１１． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ⁃
ｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ ＢｍＨＰ２１ ｉｎ
ｓｉｌｋｗｏｒｍ， Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， ３７（３）： ４１９ －
４２４ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［刘碧朗， 李玉欣， 亓希武， 向仲怀， 何宁
佳． ２０１１． 家蚕丝氨酸蛋白酶基因 ＢｍＨＰ２１ 的克隆及表达
分析． 蚕业科学， ３７（３）： ４１９ － ４２４］
Ｌｉｖａｋ ＫＪ， Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ． ２００１． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓ⁃
ｓｉｏｎｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２ － ΔΔＣｔ ｍｅｔｈ⁃
ｏｄ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２５： ４０２ － ４０８
Ｌｕｏ Ｃ， Ｙａｏ Ｙ， Ｗａｎｇ ＲＪ， Ｙａｎ ＦＭ， Ｈｕ ＤＸ， Ｚｈａｎｇ ＺＬ． ２００２． Ｔｈｅ
ｕｓｅ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｏｘｉｄａｓｅ Ｉ （ｍｔ ＣＯＩ） ｇｅｎｅ ｓｅ⁃
ｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ
（Ｇｅｎｎａｄｉｕｓ） ｉｎ Ｃｈｉｎａ． Ａｃｔａ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ， ４５ （６ ）：
７５９ － ７６３ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［罗晨， 姚远， 王戎疆， 阎凤鸣， 胡
敦孝， 张芝利． ２００２． 利用 ｍｔＤＮＡ ＣＯＩ 基因序列鉴定我国
烟粉虱的生物型． 昆虫学报， ４５（６）： ７５９ － ７６３］
Ｍａｒｓｈａｌｌ ＳＤＧ， Ｇａｔｅｈｏｕｓｅ ＬＮ， Ｂｅｃｈｅｒ ＳＡ， Ｃｈｒｉｓｔｅｌｌｅｒ ＪＴ， Ｇａｔｅ⁃
ｈｏｕｓｅ ＨＳ， Ｈｕｒｓｔ ＭＲＨ， Ｂｏｕｃｉａｓ ＤＧ， Ｊａｃｋｓｏｎ ＴＡ． ２００８． Ｓｅｒ⁃
ｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ａ Ｃｏｓｔｅｌｙｔｒａ ｚｅａｌａｎｄｉｃａ （Ｗｈｉｔｅ）
（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ： Ｓｃａｒａｂａｅｉｄａｅ） ｍｉｄｇｕｔ ＥＳＴ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｘ⁃
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｓｅｃｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
１７（３）： ２４７ － ２５９
Ｒａｗｌｉｎｇｓ ＮＤ， Ｂａｒｒｅｔｔ ＡＪ． １９９３． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄａ⁃
ｓｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２９０： ２０５ － ２１８
Ｒｏｓｓ Ｊ， Ｊｉａｎｇ ＨＢ， Ｋａｎｏｓｔ ＭＲ， Ｗａｎｇ Ｙ． ２００３． Ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ
ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｈｏｍｏｌｏｇｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ｇｅｎｏｍｅ： ａｎ
ｉｎｉｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａ⁃
ｔｉｏｎｓｈｉｐｓ． Ｇｅｎｅ， ３０４： １１７ － １３１
Ｗａｎｇ ＤＪ， Ｗｕ ＳＹ， Ｌｅｉ ＺＲ， Ｗａｎｇ ＨＨ． ２０１５． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙ⁃
ｓｉｓ ｏｆ Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ ｎｙｍｐｈｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ．
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ， ５２（１）： ４７ － ５５ （ ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［王登杰， 吴圣勇， 雷仲仁， 王海鸿． ２０１５． 感染
球孢白僵菌的烟粉虱若虫免疫应答转录组分析． 应用昆虫
学报， ５２（１）： ４７ － ５５］
Ｗａｎｇ ＤＪ， Ｚａｎｇ ＬＳ， Ｚｈａｎｇ Ｙ， Ｗａｎｇ ＨＨ， Ｌｅｉ ＺＲ． ２０１４． Ｓｕｂｌｅｔｈａｌ
ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ Ｂａｌｓａｍｏ ｏｎ ｌｉｆｅ ｔａｂｌｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ
ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ Ｇｅｎｎａｄｉｕｓ． Ｓｃｉｅｎｔｉａ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ Ｓｉｎｉｃａ， ４７（１８）： ３５８８ － ３５９５ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［王登
杰， 臧连生， 张烨， 王海鸿， 雷仲仁． ２０１４． 球孢白僵菌对
烟粉虱后代生命表参数的亚致死影响． 中国农业科学， ４７
（１８）： ３５８８ － ３５９５］
Ｗａｎｇ Ｙ， Ｄａｎｇ ＸＱ， Ｌｉ Ｚ， Ｐａｎｇ Ｍ， Ｚｈｏｕ ＺＹ， Ｗａｎｇ ＬＬ． ２０１３． Ｒｅ⁃
ｓｐｏｎｓｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｍｉｄｇｕｔｓ
ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ４０（２）： １７５ － １７９ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［王钰， 党晓群，
李治， 庞敏， 周泽扬， 王林玲． ２０１３． 家蚕中肠丝氨酸蛋白
酶基因对家蚕微孢子虫入侵的响应模式． 安徽农业大学学
报， ４０（２）： １７５ － １７９］
Ｚｈａｏ Ｐ， Ｗａｎｇ ＧＨ， Ｄｏｎｇ ＺＭ， Ｄｕａｎ Ｊ， Ｘｕ ＰＺ， Ｃｈｅｎｇ ＴＣ， Ｘｉａｎｇ
ＺＨ， Ｘｉａ ＱＹ． ２０１０． Ｇｅｎｏｍｅ⁃ｗｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｌｋｗｏｒｍ Ｂｏｍ⁃
ｂｙｘ ｍｏｒｉ． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １１： ４０５
Ｚｈａｏ ＰＣ， Ｌｉ ＪＪ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｊｉａｎｇ ＨＢ． ２００７． Ｂｒｏａｄ⁃ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉｍｉ⁃
ｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ
Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ ｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ． Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕ⁃
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３７： ９５２ － ９５９
Ｚｈｕ ＹＫ， Ｆａｎｇ Ｑ， Ｈｕ Ｃ， Ｙｅ ＧＹ． ２０１１． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｃｈａｒａｃ⁃
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ
Ｐｒ⁃ＳＰ１ ｉｎ Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ （Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ： Ｐｉｅｒｉｄａｅ）． Ａｃｔａ Ｅｎｔｏｍｏ⁃
ｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ， ５４（８）： ８５９ － ８６８ （ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［朱洋铿， 方
琦， 胡萃， 叶恭银． ２０１１． 菜粉蝶丝氨酸蛋白酶基因 Ｐｒ⁃ＳＰ１
的克隆及其表达谱分析． 昆虫学报， ５４（８）： ８５９ － ８６８］
Ｚｏｕ Ｚ， Ｌｏｐｅｚ ＤＬ， Ｋａｎｏｓｔ ＭＲ， Ｅｖａｎｓ ＪＤ， Ｊｉａｎｇ ＨＢ． ２００６． Ｃｏｍｐａｒ⁃
ａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ⁃ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｏｎｅｙ ｂｅｅ
ｇｅｎｏｍｅ： ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｎ⁃
ｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １５（５）： ６０３ －６１４
（责任编辑：王　 璇）
１６１ 期 于　 洁等： 参与烟粉虱免疫反应的 ｃｌｉｐ丝氨酸蛋白酶基因分析