全 文 ：Science of Sericulture 蚕业科学
收稿日期:2014 － 05 － 21 接受日期:2014 － 06 － 20
资助项目:中央高校基本科研业务费专项(No． 2362014xk05) ，国家
自然科学基金青年基金项目(No． 31300228)。
第一作者信息:王裕鹏(1990 －) ，男，硕士研究生。
E-mail:wangyp_swu@ 163． com
通信作者信息:杨光伟，研究员。
E-mail:yanggw@ swu． edu． cn
何宁佳，教授，博士生导师。
E-mail:hejia@ swu． edu． cn
* Corresponding author． E-mail:yanggw@ swu． edu． cn
E-mail:hejia@ swu． edu． cn
2014，40(4) :0582 － 0591
ISSN 0257 － 4799;CN 32 － 1115 /S
E-mail:CYKE@ chinajournal． net． cn
川桑丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的鉴定与表达模式分析
王裕鹏 梁九波 丁光宇 李文生 杨光伟 何宁佳
(家蚕基因组生物学国家重点实验室，西南大学蚕学与系统生物学研究所，重庆 400716)
摘 要 丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)主要参与蛋白酶活性的调节，植物 SPI 具有抵御病原菌侵染和昆虫取食危害的功能。通
过比对 MEＲOPS数据库以及保守氨基酸基序的分析，在川桑(Morus notabilis)基因组中鉴定到 34 个 SPI 蛋白。这些 SPI 蛋白
可分为 Kunitz、Serpin和 PI-Ⅰ3 个家族，依据氨基酸序列中的半胱氨酸残基数目又将 Kunitz 家族成员分为 4 类。氨基酸多序
列比对表明 Serpin和 PI-Ⅰ家族成员在序列上相对保守。基于川桑根、皮、花、芽、叶的 ＲNAseq数据量化的 ＲPKM值分析发现
不同类型 SPI基因的组织表达模式存在差异，暗示川桑不同类型 SPI行使不同的生物学功能。以广东桑(Morus atropurpurea)
品种粤桑-69851 的幼叶作为创伤处理材料，检测 PI-Ⅰ家族的 6 个 SPI基因对创伤诱导响应的表达模式，其中有 4 个基因不同
程度地受到创伤诱导而上调表达，推测它们在桑树防御昆虫咬食危害中具有重要作用。
关键词 川桑;丝氨酸蛋白酶抑制剂;基因家族;表达模式
中图分类号 S888. 2;Q786 文献标识码 A 文章编号 0257 － 4799(2014)04 － 0582 － 10
Identification and Expression Pattern Analysis of the Serine Protease Inhibitor
Genes inMorus notabilis
WANG Yu-Peng LIANG Jiu-Bo DING Guang-Yu LI Wen-Sheng YANG Guang-Wei* HE Ning-Jia*
(State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology，Institute of Sericulture and Systems Biology，Southwest University，
Chongqing 400716，China)
Abstract Serine protease inhibitors (SPIs)are primarily involved in proteolytic regulation，which confer plants with de-
fense ability against microorganism infection and insect attack． Through sequence comparison in MEＲOPS database and
analysis of conserved amino acid motifs，34 SPIs were found to be encoded by the Morus notabilis genome． These SPIs
could be classified into three families，namely Kunitz，Serpin and PI-Ⅰ． The Kunitz family SPIs could be further divided
into four groups based on the number of cysteine residue． Multiple sequence alignment showed that Serpin and PI-Ⅰ
family SPIs had more conserved sequences． In addition，based on the ＲPKM data of ＲNAseq，different gene expression
patterns were observed in three families of SPI genes in the M． notabilis root，bark，flower，bud，and leaf，suggesting
that different SPIs play diverse biological roles in Morus notabilis． The mulberry cultivar of M． atropurpurea Yuesang-
69851 was used to detect the wound-induced expression
patterns of 6 PI-Ⅰ family genes． The results showed that
expressions of 4 PI-Ⅰ family genes were more or less up-
regulated by wounding treatment，suggesting their poten-
tial roles in the defense against insect attack．
Key words Morus notabilis;Serine protease inhibitor;
Gene family;Expression pattern
蛋白酶抑制剂(protease inhibitors，PI)是生物体内
一类调节蛋白酶活性的因子，通过与蛋白酶的
DOI:10.13441/j.cnki.cykx.2014.04.004
第 4 期 王裕鹏等:川桑丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的鉴定与表达模式分析 583
活性部位和变构部位结合，抑制蛋白酶的催化活性
或抑制蛋白酶原的活化。根据抑制蛋白酶的类型，
蛋白酶抑制剂可以分为丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱
氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂及金属
蛋白酶抑制剂［1］。其中丝氨酸蛋白酶抑制剂
(serine protease inhibitors，SPI)是数目最多，也是目
前研究最为深入的一类蛋白酶抑制剂。
丝氨酸蛋白酶抑制剂广泛存在于在动物、植物
以及微生物体内。2005 年，Christeller 等［2］依据 SPI
的氨基酸序列、活性位点、作用机制及在植物中的
分布情况，将植物 SPI 主要分为 8 个家族。Serpin
家族成员的分子质量为 39 ～ 43 kD，各成员具有相
似的氨基酸序列，主要抑制丝氨酸蛋白酶，也能够
抑制胱门蛋白酶及木瓜蛋白酶［3］。最典型的 Serpin
蛋白含 3个 β折叠片(A ～ C) ，8 ～ 9 个 α 螺旋(A ～
H)和 1 个反应活性环(ＲCL) ，其结合靶蛋白酶的特
异性主要依赖于反应活性环的 P1 位点氨基酸残
基［4 － 5］。部分植物 Serpin 蛋白具有一段保守基序
YXXGXDXＲXF，其主要作用是维持蛋白质空间结构
的稳定。Bowman-Birk家族成员根据其结构特点与
抑制活性可以分为 2 类:在双子叶植物中该家族成
员分子质量约 8 kD，属于双头抑制剂，并具有 2 个
抑制活性位点，能竞争性地抑制 2 个胰蛋白酶分
子［6］;而在单子叶植物中，该家族成员又可以分为 2
种类型，一种类型的分子质量为 8 kD，仅含有 1 个
反应活性位点，另一种类型的分子质量约 16 kD，含
有 2 个反应活性位点［7 － 8］。Kunitz 家族成员的分子
质量为 18 ～ 22 kD，含有 2 个二硫键及 1 个反应活性
位点，主要抑制丝氨酸蛋白酶［9］，也能抑制天冬氨
酸蛋白酶等。该家族蛋白的空间结构比较保守，且
二硫键在维持该类抑制剂空间结构稳定上有重要
的作用。然而，近年发现有些 Kunitz 抑制剂只有 1
对二硫键，有的甚至没有二硫键［10 － 11］，推测这类
Kunitz抑制剂的活性结构可能由氢键维持［12 － 13］。
Squash家族成员的分子质量介于 3. 0 ～ 3. 5 kD，具
有抑制哈格曼因子和人白细胞弹性蛋白酶等生物
分子的潜能［14 － 15］。Cereal trypsin /α-amylase 家族成
员的分子质量约 13 kD，由一条多肽链构成，多肽链
中含有 5 个二硫键［2］，具有抑制丝氨酸蛋白酶和 α-
淀粉酶的能力。MSI 家族成员的分子质量相对较
小，约 7 kD，由一条多肽链构成，具有抑制胰蛋白酶
的能力［16］。PI-Ⅰ和PI-Ⅱ家族成员是一类创伤诱导
表达的蛋白酶抑制剂［17 － 18］。其中 PI-Ⅰ家族成员只
有 1 个活性中心和 2 个保守区域，第 1 个保守区域
作为 PI-Ⅰ识别标签［19］，第 2 个保守区域是 PI-Ⅰ结
合靶蛋白酶区域，P1 位点氨基酸作为识别靶蛋白酶
的主要位点［20］，其主要抑制胰凝乳蛋白酶;而 PI-Ⅱ
家族成员有 2 个活性中心，可同时抑制胰蛋白酶和
胰凝乳蛋白酶。
目前对植物蛋白酶抑制剂的研究主要集中在
草本植物，而在木本植物中的研究较少，仅在蔷薇
科植物苹果［21 － 22］和杨柳科植物欧洲白杨［23］有相关
的研究报道。双子叶植物中豆科和茄科拥有的丝
氨酸蛋白酶抑剂数目最多，在单子叶植物中禾本科
拥有的丝氨酸蛋白酶抑制剂数目最多［24］。植物 SPI
的功能主要是调节蛋白酶的活性，在抵御病原菌侵
染和昆虫取食危害方面发挥重要作用［25］。利用转
基因技术将丝氨酸蛋白酶抑制剂基因转入植物，赋
予植物抵抗病原菌侵染和昆虫取食危害的能力的
研究已取得一定进展。1987 年，Hilder 等［26］首次将
豇豆(Vigna unguiculata)的胰蛋白酶抑制剂 CPTI编
码基因转入烟草(Nicotiana tabacum) ，转入的 CPTI
能有效抑制取食烟草的烟芽夜蛾(Heliothis vires-
cens)的生长，而对烟草植株本身并没有造成明显的
伤害。目前，来自大豆(Glycine max)和马铃薯(So-
lanum tuberosum)等植物的至少 12 种蛋白酶抑制剂
基因被导入水稻(Oryza sativa)、烟草、棉花(Gossypi-
um spp．)中，获得了多个在一定程度上能够抵抗昆
虫取食的转基因植物品系［27 － 29］。植物蛋白酶抑制
剂在林木抗虫基因工程中的应用正处于起步阶段，
虽然已获得一些导入蛋白酶抑制剂基因的转基因
植株，并部分进入大田试验阶段［30 － 32］，但这些研究
还局限于抗鳞翅目的食叶昆虫。另外，木本植物蛋
白酶抑制剂基因应用于抗虫基因工程中的研究报
道也相对较少。
桑树(Morus L．)是重要的生态经济林木，在我
国已有几千年的栽培历史。桑叶中的一些蛋白质
以及次生代谢产物对许多昆虫的取食具有抑制作
用［33 － 34］，其中包括丝氨酸蛋白酶抑制剂等防御蛋
白。除了家蚕，自然界中的很多昆虫无法取食桑
叶，因此研究桑树丝氨酸蛋白酶抑制剂对害虫取食
桑叶的抑制作用具有重要的理论和实用意义。本
研究鉴定川桑(Morus notabilis)基因组中的丝氨酸
蛋白酶抑制剂编码基因，对其序列特征和系统进化
584 蚕 业 科 学 2014;40 (4)
关系进行分析，检测桑树根、皮、花、芽、叶中丝氨酸
蛋白酶抑制剂基因的组织表达模式，并验证 PI-Ⅰ家
族基因对创伤的响应表达模式。
1 材料与方法
1. 1 川桑 SPI基因的鉴定
将川桑蛋白质序列分批提交至 MEＲOPS 数据
库(http:∥merops． sanger． ac． uk /) ，通过 Blastp 比
对，获得候选的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。利用
Pfam(http:∥pfam． janelia． org /)和 SMAＲT(http:∥
smart． embl-heidelberg． de /smart /change － mode． pl)分
析候选基因编码蛋白质的结构域。川桑基因组序
列与蛋白质序列来自 MorusDB 数据库(http:∥mo-
rus． swu． edu． cn /morusdb /)。
1. 2 SPI蛋白及编码基因结构分析
对获得川桑 SPI蛋白的氨基酸序列进行分子质
量、等电点预测(http:∥www． expasy． org /)及信号肽
分析(http:∥www． cbs． dtu． dk /services /SignalP /)。
获得 SPI 的基因序列以及 CDS 序列后，将数据提交
至 GSDS基因结构显示系统(http:∥gsds． cbi． pku．
edu． cn /)进行基因结构分析。
1. 3 SPI蛋白的多重序列比对和系统进化分析
鉴定的 SPI蛋白用 ClustalX 软件进行多序列比
对，比对结果用 GeneDoc 软件分析。系统发生树利
用 MEGA5. 0 软件构建，采用 Neighbor-Joining 方法
(Bootstrap 值设定为 1 000)分析川桑 SPI 不同家族
之间的进化关系。
1. 4 SPI基因的组织表达模式分析
利用川桑根、皮、花、芽、叶的 ＲNAseq 数据量化
ＲPKM值(reads per kilobase of exon model pre million
mapped reads) ，分析 SPI 基因的组织表达模式。
Multi Experiment Viewer软件用于 SPI基因表达水平
归一化及聚类分析，采用 Hierarchical Clustering
(HCL)方法进行层次聚类。川桑各组织的 ＲNAseq
数据来自 MorusDB数据库。
1. 5 创伤诱导 PI-Ⅰ家族基因的表达分析
以广东桑(Morus atropurpurea)品种粤桑-69851
供试。供试桑苗在人工气候箱中培养 45 d 左右，使
用消毒处理过的打孔器沿叶片中脉两侧进行打孔。
根据川桑 PI-Ⅰ家族成员编码基因序列设计 6 对引
物。其中 MnSPI29 基因的上游引物序列为 5-CAA-
CATGGCATCCAACTCTC-3，下游引物序列为 5-G-
CCCTATCACTCCGAATCTCC-3;MnSPI30 基因的
上游引物序列为 5-TTGTCGGAGTTCAAGGAGAGG-
3，下游引物序列为 5-ATAGACGATGCCGTGGTT-
3;MnSPI31 基因的上游引物序列为 5-TGTCGGA-
GTTCAAGGAGAGG-3，下游引物序列为 5-ATAG-
ACGATGCCGTGGTTG-3;MnSPI32 基因的上游引
物序列为 5-TCTGAGCGTTGTCAAGGAAA-3，下游
引物序列为 5-GATCATGGGCACGGTGGT-3;Mn
SPI33 基因的上游引物序列为 5-CAGCGGCAAAG-
AT-3，下游引物序列为 5-CAACGTGAGGTACAGT-
GGAGAC-3;MnSPI34 基因的上游引物序列为 5-
AAATGGGAAAGAAGCCGAGAA-3，下游引物序列
为 5-TAGGGAAGTTGAGTGACGATGC-3。用上述
6 对引物，分别以创伤处理前(0 h)及处理后 1、6、12
h的叶片 cDNA 作为模板进行 ＲT-PCＲ 扩增。以桑
树核糖体蛋白基因 MnＲPL15 作为内参照，其上游引
物序列为 5-GGCTATGTGATTTACCGTGTT-3，下
游引物序列为 5-TTGGTCCAGTATGAGTTGAGAA-
3。PCＲ反应条件:94 ℃预变性 4 min;94 ℃ 40 s，
60 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，共 30 个循环;72 ℃延伸 10
min。扩增产物用 2%琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果与分析
2. 1 川桑 SPI基因家族成员
通过川桑蛋白质数据库比对 MEＲOPS 数据库，
筛选得到 36个候选蛋白质序列，去除 2 个未在 Pfam
和 SMAＲT中检出结构域的候选蛋白质，共得到 34 个
SPI基因(表 1)。结构域分析发现 34 个 SPI 蛋白可
归类到 3个家族，有 19个 SPI蛋白属于 Kunitz家族，
命名为 MnSPI1 ～MnSPI19，分子质量介于 16 ～27 kD;
有 9个 SPI蛋白属于 Serpin 家族，命名为 MnSPI20 ～
MnSPI28，其中 4个成员的分子质量约 40 kD，具有完
整的 Serpin 结构域，另有 4 个成员的分子质量
＜30 kD，Serpin结构域不完整，而 MnSPI20 的分子质
量 ＞60 kD;有 6 个 SPI 蛋白属于 PI-Ⅰ家族，命名为
MnSPI29 ～ MnSPI34，分子质量 10 kD左右。仅鉴定到
了 3种类型的 SPI，说明 SPI 的类型在川桑中较为集
中。信号肽分析发现在 Kunitz家族 19个成员中仅有
4个成员不含有信号肽;而 Serpin及 PI-Ⅰ2 个家族的
蛋白质都不含有信号肽。预测有 30 个川桑 SPI 蛋白
的等电点 ＜7. 0，仅有 4 个蛋白质的等电点 ＞ 7. 0，说
明川桑中 SPI的等电点分布偏向于酸性。
第 4 期 王裕鹏等:川桑丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的鉴定与表达模式分析 585
表 1 在川桑基因组中鉴定的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因家族成员
Table 1 Identification of the SPI gene family members in Morus natobilis genome
基因名称
Gene name
基因编号
Gene ID
基因组位置 / nt
Position at the Scaffold
编码链
Strand
结构域
Domain
信号肽
Signal
peptide
分子质量 / kD
Molecular
weight
等电点
Isoelectric
point
MnSPI1 Morus020197 Scaffold570:659 205 ～ 659 924 + Kunitz 有 Yes 26. 63 4. 97
MnSPI2 Morus020198 Scaffold570:668 645 ～ 669 379 + Kunitz 有 Yes 27. 37 4. 92
MnSPI3 Morus002886 Scaffold714:23 101 ～ 23 826 + Kunitz 有 Yes 26. 70 4. 86
MnSPI4 Morus002887 Scaffold714:69 033 ～ 69 749 + Kunitz 有 Yes 26. 69 5. 12
MnSPI5 Morus005403 Scaffold1181:14 959 ～ 15 552 － Kunitz 无 No 21. 74 9. 04
MnSPI6 Morus010983 Scaffold1276:34 433 ～ 35 008 － Kunitz 无 No 20. 81 4. 46
MnSPI7 Morus010984 Scaffold1276:49 156 ～ 49 758 + Kunitz 有 Yes 21. 70 5. 41
MnSPI8 Morus010986 Scaffold1276:61 854 ～ 62 477 － Kunitz 有 Yes 22. 65 8. 35
MnSPI9 Morus010987 Scaffold1276:75 250 ～ 75 825 － Kunitz 有 Yes 21. 11 4. 93
MnSPI10 Morus010988 Scaffold1276:86 243 ～ 86 821 － Kunitz 有 Yes 21. 19 7. 52
MnSPI11 Morus010989 Scaffold1276:90 684 ～ 91 262 － Kunitz 有 Yes 21. 24 8. 53
MnSPI12 Morus004394 Scaffold2151:95 828 ～ 96 493 － Kunitz 有 Yes 24. 65 4. 91
MnSPI13 Morus004395 Scaffold2151:104 559 ～ 107 456 － Kunitz 无 No 18. 24 4. 61
MnSPI14 Morus004396 Scaffold2151:110 907 ～ 113 515 － Kunitz 有 Yes 17. 46 5. 82
MnSPI15 Morus004398 Scaffold2151:126 332 ～ 127 054 － Kunitz 有 Yes 26. 75 5. 08
MnSPI16 Morus004399 Scaffold2151:130 720 ～ 131 438 － Kunitz 有 Yes 19. 74 6. 29
MnSPI17 Morus004401 Scaffold2151:141 757 ～ 143 437 － Kunitz 无 No 22. 27 6. 84
MnSPI18 Morus000852 Scaffold3833:9 063 ～ 9 767 － Kunitz 有 Yes 15. 87 4. 87
MnSPI19 Morus000853 Scaffold3833:18 413 ～ 19 054 － Kunitz 有 Yes 23. 75 5. 00
MnSPI20 Morus015113 Scaffold120:163 794 ～ 168 452 － Serpin 无 No 60. 92 6. 29
MnSPI21 Morus014443 Scaffold250:123 924 ～ 126 128 + Serpin 无 No 42. 41 5. 95
MnSPI22 Morus013305 Scaffold275:197 683 ～ 201 697 － Serpin 无 No 25. 65 5. 05
MnSPI23 Morus012632 Scaffold544:163 459 ～ 163 827 － Serpin 无 No 13. 22 5. 08
MnSPI24 Morus015884 Scaffold602:188 299 ～ 190 297 － Serpin 无 No 25. 83 5. 15
MnSPI25 Morus021823 Scaffold1009:402 150 ～ 404 002 + Serpin 无 No 42. 33 6. 20
MnSPI26 Morus021839 Scaffold1009:476 983 ～ 478 534 － Serpin 无 No 46. 76 6. 61
MnSPI27 Morus009124 Scaffold1108:22 732 ～ 24 512 － Serpin 无 No 46. 23 6. 08
MnSPI28 Morus009126 Scaffold1108:30 576 ～ 31 432 － Serpin 无 No 22. 93 6. 91
MnSPI29 Morus017422 Scaffold363:314 672 ～ 315 184 － PI-Ⅰ 无 No 8. 23 6. 17
MnSPI30 Morus017423 Scaffold363:320 957 ～ 321 453 － PI-Ⅰ 无 No 7. 66 4. 94
MnSPI31 Morus017424 Scaffold363:335 508 ～ 335 990 － PI-Ⅰ 无 No 7. 66 4. 94
MnSPI32 Morus005746 Scaffold1229:29 478 ～ 29 878 － PI-Ⅰ 无 No 7. 73 6. 71
MnSPI33 Morus005748 Scaffold1229:34 915 ～ 35 372 － PI-Ⅰ 无 No 7. 74 6. 70
MnSPI34 Morus005749 Scaffold1229:36 420 ～ 40 347 － PI-Ⅰ 无 No 14. 54 4. 77
2. 2 川桑 SPI基因家族的系统进化关系和基因结
构特征
从表 1 可以得知，Kunitz、Serpin、PI-Ⅰ 3 个家族
的 SPI基因编码蛋白质的分子质量差异较大，并且
氨基酸序列也有较大的差异。基于其保守结构域
序列构建的系统发生树(图 1-A)显示，Kunitz、Ser-
pin、PI-Ⅰ家族的成员分别聚在一起，而且来自同一
Scaffold的基因几乎都聚在一起。如 MnSPI6 ～ MnS-
586 蚕 业 科 学 2014;40 (4)
PI11 均来自于 Scaffold1276，这 6 个 SPI 基因分布于
Scaffold 56 kb 的范围内;MnSPI12 ～ MnSPI17 均来
自于 Scaffold2151，分布于 Scaffold 48 kb 的范围内
(表 1)。结果表明部分川桑 SPI 基因在基因组上呈
现集中分布，不同家族的 SPI 蛋白质序列具有明显
的差异，而同一家族 SPI蛋白质序列具有保守性。
外显子和内含子的分化在基因进化过程中扮
演重要的角色。对川桑 SPI基因结构分析结果与聚
类分析的结果之间有着关联性(图 1-B) :除 MnS-
PI13、MnSPI16、MnSPI17、MnSPI18 基因有 2 个外显
子以及 MnSPI14 基因有 3 个外显子外，Kunitz 家族
单外显子基因占到 73. 7%(14 个) ;Serpin 家族基因
的外显子数目介于 1 ～ 4 之间，但 MnSPI20 却含有 7
个外显子;含有 2 个外显子的 PI-Ⅰ家族基因有 5
个，MnSPI34 基因含有 3 个外显子、2 个 PI-Ⅰ结构
域，属于复合型丝氨酸蛋白酶抑制剂，推测 MnSPI34
在基因进化过程中，其基因结构发生了变化，导致
结构域数目增加。以上分析表明，不同 SPI 基因家
族的基因结构差异较大，推测各家族可能是独立进
化而来。
A．节点处的数值表示自举检验 1 000 次的支持率
B．川桑 SPI基因结构示意，矩形框代表外显子，线条代表内含子
A． Number at the node is bootstrap support from 1 000 replicates
B． Schematic diagram of Morus notabilis SPI gene structures． Ｒectangular frame represent exons and solid lines represent introns
图 1 川桑丝氨酸蛋白酶抑制剂基因家族的系统发生树(A)和基因结构特征(B)
Fig. 1 Phylogenetic tree (A)and features of gene structure (B)of Morus notabilis SPI gene families
第 4 期 王裕鹏等:川桑丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的鉴定与表达模式分析 587
2. 3 川桑 SPI蛋白家族的保守基序
参照文献［35］将川桑 Kunitz 家族成员分为 4
类(表 2)。有一种类型的 2 个成员不含有半胱氨
酸，另一种类型的 2 个成员只含有 1 个半胱氨酸，这
2 种类型都不能形成二硫键;有一种类型的 2 个成
员含有 2 个半胱氨酸，推测能形成 1 对二硫键;有一
种类型的 13 个成员的半胱氨酸数目 ＞ 2 个，其中 5
个成员含有 4 个半胱氨酸，推测能形成 2 对二硫键。
以川桑 5个具有完整结构域的 Serpin 家族蛋白
与拟南芥(Arabidopsis thaliana)Atserpin1 蛋白(Gen-
Bank登录号:Q9S7T8)进行多重序列比对(图 2)，
表 2 川桑丝氨酸蛋白酶抑制剂 Kunitz家族蛋白的半胱氨酸
残基数目
Table 2 Number of cysteine residue in Kunitz family SPIs from
Morus notabilis
分类
Group
蛋白质名称
Protein name
半胱氨酸残
基数目 / 个
Number of
cysteine residue
a MnSPI12，MnSPI19 0
b MnSPI13，MnSPI17 1
c MnSPI16，MnSPI18 2
d
* MnSPI1，* MnSPI2，* MnSPI13，* MnSPI4，
MnSPI5 ～MnSPI11，MnSPI14，* MnSPI15
＞2
* 标记的蛋白质含有4个半胱氨酸残基。
Proteins that marked with * contain four cysteine residues．
方框代表 YXXGXDXＲXF保守基序，箭头表示反应活性环重要的氨基酸残基。
The conserved motif YXXGXDXＲXF is boxed． The important residues of reactive center loop are shown in arrows．
图 2 川桑 Serpin家族蛋白与拟南芥 Atserpin1 蛋白的氨基酸序列多重比对
Fig. 2 Alignment of 5 Serpin family proteins in Morus notabilis with Arabidopsis thaliana Atserpin1 protein
588 蚕 业 科 学 2014;40 (4)
发现川桑 Serpin的 α螺旋和 β折叠二级结构对应的
序列与 Atserpin1 蛋白之间具有保守性，其中 4 个川
桑 Serpin 蛋白具有保守基序 YXXGXDXＲXF，反应
活性环处的氨基酸残基具有多样性。
基于已报道的 6 个 PI-Ⅰ家族蛋白［2 个来自马
铃薯，3 个来自番茄(Lycopersicon esculentum) ，1 个来
自大豆］与川桑的 6 个 PI-Ⅰ家族蛋白进行多序列比
对(图 3) ，发现与其他 PI-Ⅰ家族蛋白一样，川桑 PI-
Ⅰ家族蛋白也具有 2 个保守区域，且序列(包括 P1
位点)相对保守。
P08454． 2、P01052． 1—马铃薯 Solanum tuberosum，P16064． 1—大豆 Glycine max，
P05118． 1、P16231． 1、P20076． 1—番茄 Lycopersicon esculentum。
方框表示 PI-Ⅰ的 2 个保守区域，箭头表示与蛋白酶结合的重要氨基酸残基。
The two conserved regions of PI-Ⅰ are shown in box． The residues that interact with protease are shown in arrows．
图 3 川桑 PI-Ⅰ家族蛋白与其他植物 PI-Ⅰ家族蛋白的氨基酸序列多重比对
Fig. 3 Multiple sequence alignment of amino acid sequence of PI-Ⅰfamily proteins
from Morus notabilis and other plants
2. 4 川桑 SPI基因的组织表达模式
利用川桑根、皮、花、芽、叶的 ＲNAseq 数据量化
ＲPKM值，分析不同 SPI 家族基因在各组织中的表
达模式(图 4) :有 91%(31 个)的 SPI基因在 5 个组
织器官中有表达，有 3 个 SPI 基因(MnSPI24、
MnSPI25、MnSPI32)在 5 个组织器官中均未检测到
表达。聚类分析结果显示 Kunitz 家族基因在不同
组织器官中具有 4 类表达模式(图 4-A) ，分别命名
为Ⅰ ～Ⅳ。其中:Ⅰ簇基因主要在芽中表达，在花
中有微弱的表达;Ⅱ簇基因主要在叶片中表达，但
除 MnSPI13、MnSPI17、MnSPI19 外，其余的 5 个基因
在花中也有表达;Ⅲ簇基因在花中表达，仅 MnSPI5
在根和皮中有微弱的表达;Ⅳ簇基因除在根部表达
外，部分基因在皮和花中也有微弱表达。另外，除
MnSPI14 外，位于 Scaffold2151 的基因全部聚于Ⅱ
簇;除 MnSPI5 外，位于 Scaffold1276 的基因都聚于
Ⅲ和Ⅳ簇。这一结果表明，位于同一 Scaffold 上的
Kunitz家族基因具有相似的表达模式。Serpin 家族
基因在不同组织器官表达模式如图 4-B所示，在根、
皮、花中分别检测到有 3 个、5 个和 4 个基因的表
达，而在叶与芽中只分别检测到 2 个和 1 个基因的
表达。PI-Ⅰ家族基因的表达则表现出了组织特异
性(图 4-C) ，如 MnSPI29 和 MnSPI30 分别在桑树的
花与皮中特异性表达。以上结果表明，不同类型的
SPI基因在组织表达模式上存在一定的差异，可能
具有不同的生物学功能。
第 4 期 王裕鹏等:川桑丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的鉴定与表达模式分析 589
A，B，C．分别为 Kunitz、Serpin和 PI-Ⅰ3 个家族基因的表达模式
图中不同颜色表示基因相对表达水平，其中绿色、黑色和红色分别代表低、中、高 3 个等级的基因表达量。
A，B and C． The expression patterns of SPI genes belonging to Kunitz，Serpin，and PI-Ⅰ
families respectively． Colors in the map indicate relative levels of gene expression． Green，black and red indicates low，
medium and high levels of gene expression respectively．
图 4 基于川桑组织 ＲNAseq数据量化 ＲPKM值的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因表达模式
Fig. 4 Tissue expression pattern of the SPI genes based on the values of quantitative ＲPKM by ＲNAseq from Morus notabilis
2. 5 粤桑-69851 桑苗叶片创伤处理后 PI-Ⅰ家族基
因的诱导表达
以桑品种粤桑-69851的桑苗叶片为材料，根据川
桑 PI-Ⅰ家族 6 个基因的序列设计引物，以经创伤处
理后不同时间的桑苗叶片 cDNA为模板进行 ＲT-PCＲ
扩增，结果如图 5 所示。在正常生理状态下 MaS-
PI29、MaSPI30 和 MaSPI33 均有表达，但 MaSPI30 和
MaSPI33仅微量表达，MaSPI31、MaSPI32 和 MaSPI34
均不表达。创伤处理叶片中，MaSPI29 和 MaSPI30 的
响应较明显，在创伤 1 h 表达量明显上调，然后随时
间延长表达下调，MaSPI31 在创伤后 6 h 仅有微量表
达，至 12 h表达量明显上调，MaSPI34在创伤后6 h表
达量上调;MaSPI32 和 MaSPI33 对创伤无明显的响
应。以上结果表明，MaSPI29、MaSPI30、MaSPI31和
MaSPI34的表达均可以响应叶片创伤信号，但在响应
的时间上存在差异。
图 5 桑品种粤桑-69851 的叶片经创伤处理后
PI-Ⅰ家族基因的表达谱
Fig. 5 Expression profile of PI-Ⅰfamily genes from
Morus atropurpurea Yuesang-69851 leaves
under wounding treatment
590 蚕 业 科 学 2014;40 (4)
3 讨论
丝氨酸蛋白酶抑制剂作为一类数目最多、研究
最为深入的蛋白酶抑制剂，在植物对外界不良因子
的防御过程中扮演重要角色。Christeller 等［2］将植
物的丝氨酸蛋白酶抑制剂分为 8 个家族，但是本研
究在川桑的基因组中只鉴定获得 Kunitz、Serpin 和
PI-Ⅰ3 个家族的共 34 个 SPI 基因，表明 SPI 蛋白的
类型在不同物种之间具有可变性。另外，Kunitz 家
族基因在川桑基因组中的分布比较集中，而且位于
同一 Scaffold上的基因其组织表达模式上也具有相
似性，在桑树生理活动过程中可能执行相同的功
能。除 MnSPI14 外，位于 Scaffold2151 的基因全部
聚于Ⅱ簇，该簇基因主要在桑树叶片中表达，而叶
片也是昆虫取食的主要部位，因而推测位于 Scaf-
fold2151 上的 Kunitz家族基因可能在桑树防御昆虫
取食危害中具有重要作用。
已有的研究表明，大部分植物丝氨酸蛋白酶抑
制剂主要分布在储藏器官中，尤其在种子及球茎中
含量最多，同时在根、叶、花、果实等器官也有分布，
但是不同物种间丝氨酸蛋白酶抑制剂在各个组织
器官中的分布有较大差异。如曾英等［36］在波叶青
牛胆(Tinospora crispa)根茎中分离到一种胰蛋白酶
抑制剂，Moura等［37］在胡椒树(Capsicum annuum)叶
片中发现了创伤诱导表达的蛋白酶抑制剂。基因
表达模式分析发现，SPI 基因在川桑的根、皮、花、
芽、叶中均有表达，说明 SPI基因在川桑不同组织表
达的多样性，暗示其在川桑中发挥重要的生物学功
能。其中，在花与叶片中表达的 SPI 基因分别占到
了 SPI基因总数的 59%和 32%，这些基因可能在抵
御病原菌及昆虫咬食方面起作用。通过对粤桑-
69851 叶片创伤处理后分析 PI-Ⅰ家族的 6 个 SPI基
因表达谱发现，有 4 个基因具有创伤诱导表达特性，
其中 MaSPI31 和 MaSPI34 在正常生理状况下的叶
片中没有检测到表达，属于诱导型的蛋白酶抑制剂
基因，推测上述 4 个基因可能具有抗虫作用，可作为
桑树候选害虫防御基因。
桑树是重要的经济林木，其桑叶和桑果具有重
要的经济价值。桑叶中的蛋白质含量很高，是重要
的蛋白质饲料来源;桑果中含有丰富的次生代谢物
质，具有重要的药用价值和保健功能。然而，桑叶
和桑果也是植食性昆虫取食及病原微生物侵染的
主要器官。已有研究报道，植物丝氨酸蛋白酶抑制
剂能够有效地抑制昆虫的取食危害和病原微生物
的侵染［26，34，38 － 41］。因此，进一步研究丝氨酸蛋白酶
抑制剂在桑树病虫害防御方面的作用及其功能应
用将具有重要意义。
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