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篦齿蒿提取物的抗菌试验



全 文 :动物医学进展,2012,33(5):78-81
Progress in Veterinary Medicine
篦齿蒿提取物的抗菌试验
 收稿日期:2012-01-10
 基金项目:国家自然科学基金项目(31060318);教育部春晖计划启动资金项目
 作者简介:裴大为(1982-),男(满族),内蒙古通辽人,硕士研究生,主要从事动物生理学研究。*通讯作者
裴大为,王纯洁*,敖日格乐
(内蒙古农业大学兽医学院,内蒙古呼和浩特010018)
  摘 要:为了研究篦齿蒿(Neopallasia pectinata)水提取物及醇提取物的体外抑菌作用,采用牛津杯法
测定篦齿蒿各种提取物对大肠埃希菌,金黄色葡萄球菌,沙门菌和链球菌的抑菌圈直径。用试管2倍稀释法
测定其最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC),以金黄色葡萄球菌和链球菌感染小鼠,判断其体内抗
菌效果。结果表明,篦齿蒿各种提取物都具有一定的抑菌作用,尤其是对金黄色葡萄球菌,其乙酸乙酯提取
物和正丁醇提取物是体外抗菌的主要活性部分。篦齿蒿提取物对链球菌感染小鼠体内抗菌效果较差,对金
黄色葡萄球菌感染小鼠体内抗菌成分主要集中在乙酸乙酯提取物内,对小鼠死亡保护率明显高于阴性对照
组,可达75%。
  关键词:篦齿蒿;提取物;最低抑菌浓度;最低杀菌浓度;小鼠
中图分类号:S853.75 文献标识码:A 文章编号:1007-5038(2012)05-0078-04
  篦齿蒿(Neopallasia pectinata)即为栉叶蒿,为
一年生草本菊科植物栉叶蒿的地上部分。其味苦性
寒,具有清利肝胆、消炎、抗菌、抗病毒和止痛作用。
其化学成分主要为植物甾醇和倍半萜类及其衍生
物,其抗菌作用与所含的β-谷甾醇和倍半萜类及其
衍生物有关[1-2]。本试验测定了篦齿蒿的几种提取
物对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和链球菌
的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC),以
检验篦齿蒿提取物的体外抑菌效果。测定了篦齿蒿
的几种提取物对金黄色葡萄球菌和链球菌感染小鼠
的保护率,检验体内抗菌效果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药物 篦齿蒿,从内蒙古锡林郭勒盟草原采
摘,阴干,粉碎,过40目筛。
1.1.2 实验动物 纯昆明种小鼠,体重20g±2g,
雌雄兼用,购自内蒙古大学实验动物中心,许可证号
SCXK(蒙2002-0001)。
1.1.3 菌株 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球
菌由课题组从呼和浩特地区奶牛场乳房炎患牛奶中
分离并鉴定[3],沙门菌由内蒙古农业大学兽医学院
微生物实验室提供。
1.1.4 试剂 普通琼脂、营养肉汤:广东环凯微生物
科技有限公司,批号:20100622,均按常规方法配置。
1.2 方法
1.2.1 药物的提取 
1.2.1.1 篦齿蒿水提取物的制备 50g粉碎后的
篦齿蒿,加入200mL蒸馏水浸泡1h,煎煮15min,
过滤;残渣再加入100mL蒸馏水,煮沸后10min,
过滤,合并提取液,浓缩至 50 mL,使浓度达到
1g/mL。高压灭菌,4℃保存备用。
1.2.1.2 篦齿蒿醇提取物的制备 200g粉碎后的
篦齿蒿置于2 000mL的烧瓶中,加入950mL/L的
乙醇800mL,加热回流提取,分别提取3次,每次
1.5h,过滤合并提取液,减压浓缩成浸膏放入无菌
瓶中4℃保存备用[4]。将制备好的乙醇浸膏散于少
量水中,以石油醚(1∶1)萃取3次,得石油醚萃取
物;以同样方法比例依次得到乙酸乙酯萃取物、正丁
醇萃取物组和最后留下的水母液[5-6]。减压浓缩干
燥,入无菌瓶中放置于4℃冰箱备用。
1.2.2 菌液制备 将经过培养的单个菌落接种于
营养肉汤中,于生化培养箱中37℃培养18h~24h,
用生理盐水10倍系列稀释,将与标准化浊度相当的
作为试验用菌悬液,存于4℃冰箱备用[7]。
1.2.3 抗菌试验 
1.2.3.1 药物的抑菌圈直径的测定 采用牛津杯
法,在无菌条件下,将0.5mL菌液加入到普通营养
琼脂中,用玻璃涂布棒涂匀,为菌层。将牛津杯放入
培养基中,分别加入1g/mL的篦齿蒿水提物和醇
提取物的萃取物各100μL,37℃培养24h(链球菌
DOI:10.16437/j.cnki.1007-5038.2012.05.017
48h),测量其抑菌圈直径,极度敏感为直径大于15
mm,在10mm~15mm之间为高度敏感,8mm~
10mm为敏感,8mm以下为不敏感[8-9]。
1.2.3.2 药物的最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌
浓度(MBC)的测定 采用二倍稀释法测定篦齿蒿
水提物和萃取物组对4种菌的 MIC。将5种药液浓
度分别配制成1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、
0.031 25g/mL,在上述试管中分别加入已制备好的
菌液50μL,混匀,37℃培养24h(链球菌48h),以
观察 未 见 细 菌 生 长 的 药 物 浓 度 为 该 药 液 的
MIC[10-11];从未见细菌生长的试管中分别吸取50μL
培养物接种于普通营养琼脂平板上,37℃培养24h
(链球菌48h),菌落数小于5个即为此药液的
MBC[12-13]。
1.2.3.3 体内抑菌试验 将试验小鼠随机分为14
组,每组10只,分为两批阴性对照组、阳性对照组、
水提取物组、石油醚提取物组、乙酸乙酯提取物组和
正丁醇提取物组,水母液组。阴性对照组灌服无菌
水20g/kg;阳性对照组灌服9g/L环丙沙星药液
0.1g/kg;其他组灌服对应药液2g/kg。各组小鼠每
天灌药2次,灌服7d。末次给药1h后分为两大
组,金黄色葡萄球菌和链球菌组,给各组小鼠腹腔注
射80%最低致死量(MLD)的对应致病菌。观察感
染后3d内各组小鼠的死亡情况,保护率计算方法
为:(阴性对照组小鼠死亡数-处理组死亡数)/阴性
对照组小鼠死亡数×100%[14-15]。
2 结果
2.1 药物抑菌圈直径的测定结果
由表1可知,篦齿蒿的乙酸乙酯萃取物对沙门
菌、链球菌敏感,对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌高
度敏感,正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌和链球菌
高度敏感,水母液对金黄色葡萄球菌和链球菌敏感;
水提取物仅对金黄色葡萄球菌极度敏感,石油醚萃
取物不敏感。
表1 篦齿蒿5种提取物对4种细菌的抑菌效果
Table 1 The bacteriostasis diameter of the Neopallasia pectinata extracts
组别
Groups
抑菌圈直径/mm Diameter of inhibition zone
大肠埃希菌
E.coli
金黄色葡萄球菌
S.aureus
沙门菌
Salmonella
链球菌
Streptococcus
水提物 Aqueous extract - 17.84 - -
石油醚萃取物Petroleum ether extract - - - -
乙酸乙酯萃取物Ethyl acetate extract  12.03  12.21  9.22  8.22
正丁醇萃取物 N-butanol extract - 15.05 - 13.9
水母液Jelyfish liquid - 9.73 -9.19
2.2 药物的 MIC和 MBC测定结果
由表2可知,篦齿蒿乙酸乙酯萃取物对大肠埃
希菌、金黄色葡萄球菌的 MIC和 MBC分别达到
0.062 5、0.062 5和0.125、0.125g/mL,有显著抑
菌效果,对沙门菌、链球菌次之。正丁醇萃取物和水
母液对金黄色葡萄球菌和链球菌有显著抑菌效果;
石油醚萃取物对金黄色葡萄球菌有显著效果,对大
肠埃希菌次之;水提取物只对金黄色葡萄球菌有显
著效果,其 MIC 和 MBC 分别达到0.031 25和
0.062 5g/mL。
表2 篦齿蒿5种提取物对4种细菌的 MIC和 MBC
Table 2 MIC and MBC of the Neopallasia pectinata extracts in vitro  g/mL
组别
Groups
项目
Item
大肠埃希菌
E.coli
金黄色葡萄球菌
S.aureus
沙门菌
Salmonella
链球菌
Streptococcus
水提物 MIC - 0.03125 - -
Aqueous extract  MBC - 0.0625 - -
石油醚萃取物 MIC  0.25  0.0625 - -
Petroleum ether extract  MBC  0.5  0.0125 - -
乙酸乙酯萃取物 MIC  0.0625  0.0625  0.125  0.125
Ethyl acetate extract  MBC  0.125  0.125  0.25  0.25
正丁醇萃取物 MIC - 0.03125 - 0.0625
N-butanol extract  MBC - 0.0625 - 0.125
水母液 MIC - 0.0625 - 0.125
Jelyfish liquid  MBC - 0.125 - 0.25
2.3 体内抑菌试验结果
由表3可知,篦齿蒿提取物对链球菌引起的病
变疗效较差,试验组小鼠死亡保护率均高于阴性对
照组,其中篦齿蒿乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球
菌感染小鼠的保护率为75%,与阳性对照组相当。
97裴大为等:篦齿蒿提取物的抗菌试验
表3 篦齿蒿5种提取物对2种细菌感染小鼠的保护率
Table 3 The protection rate of Neopallasia pectinata extracts in mice infected with Staphyloccocus aureus and Streptococcus
组别
Groups
金黄色葡萄球菌S.aureus
动物数目/只
Animal number
死亡数量/只
Death number
保护率/%
Protection rate
链球菌Streptococcus
动物数目/只
Animal number
死亡数量/只
Death number
保护率/%
Protection rate
阴性对照组
Negative group
10  8  0.00  10  8  0.00
阳性对照组
Positive group
10  2  75.00  10  3  62.50
水提物
Aqueous extract
10  4  50.00  10  7  12.50
石油醚萃取物
Petroleum ether extract
10  5  37.50  10  7  12.50
乙酸乙酯萃取物
Ethyl acetate extract
10  2  75.00  10  6  25.00
正丁醇萃取物
N-butanol extract
10  4  50.00  10  6  25.00
水母液
Jelyfish liquid
10  7  12.50  10  6  25.00
3 讨论
从试验数据可以看出,篦齿蒿的各种提取成分
对4种常见致病菌均有一定程度的抑菌效果,尤其
对金黄色葡萄球菌作用明显,5种不同提取物对金
黄色葡萄球菌的 MIC都在0.0625g/mL或以上。
乙酸乙酯萃取物对4种菌的 MIC大于或等于0.125
g/mL,正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌和链球菌的
MIC和 MBC分别达到0.031 25、0.062 5g/mL和
0.062 5、0.125g/mL,抑菌效果显著,表明乙酸乙
酯萃取物和正丁醇萃取物是体外抗菌的主要活性部
分,水母液和石油醚萃取物略有抑菌作用。篦齿蒿
提取物的体内抗菌试验表明,对金黄色葡萄球菌引
起的病变较敏感,篦齿蒿体内活性成分主要集中在
乙酸乙酯提取物中,其他成分活性小。
试验表明篦齿蒿提取物的体内抗菌效果与体外
抑菌效果并不一致,药物在体内、体外对致病菌的疗
效不同可能与药物在体内的代谢或者药物进入体内
后可能参与或增强机体免疫力,增加或改变对致病
菌的作用方式有关,具体机理有待进一步研究。
参考文献:
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08 动物医学进展 2012年 第33卷 第5期(总第227期)
动物医学进展,2012,33(5):81-84
Progress in Veterinary Medicine
高效液相色谱法测定甲氧苄啶含量
邵耀东1,2,胡 彬2,赵小华2,谢纪兰2,郑贵超2
(1.青岛康地恩药业股份有限公司,山东青岛266111;2.江西康地恩派尼生物药业有限公司,江西南昌330500)
  摘 要:建立甲氧苄啶含量高效液相色谱测定方法。采用Diamonsil C18色谱柱(200mm×4.6mm,
5μm),以甲醇∶0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(30∶70)为流动相,流速为1.0mL/min,柱温为25℃,检测波
长为271nm。甲氧苄啶对照品浓度在10μg/mL~160μg/mL范围内与峰面积呈线性关系,线性回归方程
A=0.389 2C-0.369 6,r=0.999 9(n=5);平均回收率为99.61%,RSD=0.41%(n=5)。高效液相色谱法
快速、简便,专属性强,重现性好,准确度高,可用于甲氧苄啶原料含量的测定。
  关键词:甲氧苄啶;含量测定;高效液相色谱法
中图分类号:S859.53 文献标识码:A 文章编号:1007-5038(2012)05-0081-04
  甲氧苄啶(trimethoprim TMP)为广谱抗菌药
物,抗菌谱与磺胺类药物类似,有抑制二氢叶酸还原
酶的作用,但细菌较易产生耐药性,很少单独使
用[1]。磺胺药抑制二氢叶酸合成酶,两者合用,可使
细菌的叶酸代谢受到双重阻断,因而抗菌作用大幅
度提高(可增效数倍至数十倍),故有磺胺增效剂之
称,并可减少耐药菌株的出现,广泛应用于我国兽医
临床[2-3]。有关甲氧苄啶原料含量测定方法,《中国
兽药典》2005年版[4]和2010年版[5]都是非水滴定法
来测定含量,非水滴定法影响因素很多,整个测定过
程复杂,对环境要求较高,终点判定不准,测定结果
不太理想。高效液相色谱法是目前多数药物含量测
定时应用的方法,该方法专属性强、操作简便、重现
性较好。为了提高甲氧苄啶含量测定的速度,简化
操作过程,确保测定结果的准确性,笔者利用 HPLC
法进行了甲氧苄啶原料含量测定的研究,现报道
如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 UV-2450型紫外分光光度仪为日本
岛津公司产品;戴安170型高效液相色谱仪为美国
戴安公司产品;AG285分析天平为瑞士梅特勒-托利
多公司生产产品。
 收稿日期:2011-11-23
 作者简介:邵耀东(1979-),男,山东菏泽人,兽医师,主要从事兽药质量技术管理
櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙

Antibacterial Test of Neopallasia pectina Extracts
PEI Da-wei,WANG Chun-jie,AORI Ge-le
(College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot,Inner Mongolia,010018,China)
Abstract:In order to study the bacteriostasis in vitro and in vivo of the water extract and alcohol extract of
Neopallasia pectinata,the inhibition zone diameters of water extract and alcohol extract for E.coli,
Staphylococcus aureus,Salmonella and Streptococcus were detected by the method of Oxford Cup.MIC
and MBC were measured by tube double dilution.The Staphylococcus aureus and Streptococcius were se-
lected to infect the mice to judge the effect of extrat inhibition.Results showed that al the extracts of Ne-
opallasia Pectinate had some bacteriostatic effect,especialy sensitive to Staphylococcusaureus,the ethyl
acetate extract and N-butanol extracts were the main active part in bacteriostasis in vitro.The antibacterial
effect of extract of Neopallasia pectinate in vitro was not good to the streptococcal infection,the antibac-
terial ingredients in mice infected with Staphylococcus aureus were mainly in the ethyl acetate extract,its
effect was significantly higher than that in the negative control group in protective rate.
Key words:Neopallasia Pectinate;extract;MIC;MBC;mouse