全 文 ：第 35卷 第 9期 东　北　林　业　大　学　学　报 Vo .l 35 No. 9
2007年 9月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UN IVERSITY Sep. 2007
思茅松 RAPD反应体系的优化 1)
　　　　　　　姜远标　　　　　　　　吴　涛　陈少瑜　袁瑞玲
(思茅地区林业科学研究所 ,思茅 , 665000)　　　(云南省森林植物培育与开发利用重点实验室(云南省林业科学院))
　　摘　要　从思茅松幼苗的嫩叶中提取基因组 DNA作为模板 ,运用均匀设计方法 ,获得思茅松 RAPD扩增反应
的优化体系:20μL反应体系中 , DNA模板用量 50 ng,引物浓度 0. 5mm o l L - 1 , Mg2+浓度 4mm o l L - 1 , TaqDNA聚
合酶用量 2. 0 U, dNTP浓度 0. 75mmo l L- 1。用 19条引物进行验证 , 证实该体系重复性好 、结果稳定。
关键词　思茅松;RAPD;均匀设计;体系优化
分类号　S791. 259
Optim ization of RAPD R eact ion Cond ition s for Pinus kesiya var. langbianensis /Jiang Yuanbiao(Forestry Research
Institute o f S im ao P re fecture, Yunnan P rovince, Sim ao 665000, P. R. China);W u Tao, Chen Shaoyu, Yuan Ruiling( the Key Laborato ry of Forest P lan t Cu ltiva tion and U tilization of Yunnan P rovince, Yunnan Academ y o f Fo restry) / /Jour-
nal o fNo rtheast Fore stry University. - 2007, 35(9). - 16 ～ 19
The random am plified polym o rphic DNA (RAPD) reaction sy stem was optim ized by m eans of unifo rm design using
genom ic DNA ex trac ted from young leave s o fP inus kesiya va r. langbianensis as temp la te. The op tim a l 20μL PCR reaction
solution fo rRAPD analy sisw as obtained as 50 ng DNA tem pla te, 0. 5mm ol L -1 random primer, 4mm ol L -1M g2+, 2. 0U
TaqDNA po lym erase, 0. 75mmo l L -1 dNTPs. A validation o f 19 d iffe rent prim ers by the op tim ized reaction sy stem show s
c lear bands and good stab ilitie s.
K ey words　P inus kesiya var. langbianensis;Random amplified po lymorph ic DNA;Uniform design;Sy stem optim ization
　　思茅松(Pinus kesiya var. langbianensis)是云南省主要用材
及采脂树种, 其分布面积占云南省林地面积的 11%, 拥有 1亿
m3的蓄积量。思茅松树干富含树脂 、品质优良 ,是云南省主要
采脂树种之一;同时 ,生长迅速 ,是我国针叶树种中最速生的种
类之一 ,其木材广泛用于建筑、家具制造等行业;而且该树种的
纤维长 ,成浆后物理性能优异 ,是非常好的纸浆原料 [ 1] ,在云南
省林业生产和生态环境建设中起着极其重要的作用。关于思
茅松的遗传育种研究越来越受到重视。许玉兰 、段安安探讨了
思茅松遗传改良研究现状及育种策略 [ 2] ;吴丽圆等对不同居群
的思茅松进行了染色体核型研究, 并比较了其基因组 DNA的
提取方法 [ 3 -4] ;陈少瑜等运用等位酶分析方法研究了思茅松天
然种群及其种子园的遗传多样性 [ 5 - 6] 。林木分子生物学研究
起步较晚 ,基因组序列相关信息的缺乏限制了分子标记技术的
应用 ,而 RAPD标记技术不需要预先知道 DNA序列的信息 ,在
林木的遗传研究中更易被采用 [ 7] 。同时 ,该标记技术比其它的
分子标记技术的试验过程更为简单 、快速且成本相对较低, 成
为目前林木遗传研究中使用最为广泛的一种分子标记 [ 7] 。但
RAPD标记技术受多种因素影响 ,其稳定性和可重复性也一直
是人们关注的热点 [ 8 - 9] 。由于不同的生物种类对反应体系的
要求不同 ,为了获得理想的试验结果 ,必须对各有关因素进行
优化。目前, 文献报道的多采用单因素或二因素设计来优化
RAPD反应体系 [ 10 - 12] , 笔者尝试将均匀设计运用于思茅松
RAPD反应体系的优化, 并用 19条引物对优化结果进行验证 ,
建立一套适合思茅松基因组 RAPD分析的技术体系 ,为进一步
采用这一技术进行深入的遗传研究奠定基础。
1　材料与方法
材料:以云南省思茅市林业科学研究所提供的优良无性
1)思茅林产业发展科技平台建设。
第一作者简介:姜远标 ,男 , 1967年 1月生 ,思茅地区林业科学研
究所 ,高级工程师。
收稿日期:2006年 11月 22日。
责任编辑:程　红。
系实生幼苗的嫩叶作为提取基因组 DNA的材料。
仪器与试剂:Beckman公司 Avanti - 30高速冷冻离心机 ,
Perkin E lme r公司 Gene Amp 9700 PCR仪, Syngene公司的 Gene-
Genius Bio Imaging System凝胶成像仪, B IO -RAD公司 PowerPac
Basic电泳仪等。 RAPD引物由北京奥科生物技术公司合成 ,长
度均为 10 bp,碱基序列见表 1。 dNTP、Taq酶 、10×Reaction Buff-
er、MgC l2均购自上海申能博彩生物技术有限公司 , DNA Marker
(DL2000)购自 TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。
表 1　RAPD引物编号及序列
编号 序列(5′- 3′) 编号 序列(5′- 3′)
1 AGGGGTCTTC 11 AAAGCTGCGG
2 GTGACGTAGG 12 GACGGATCAG
3 GGGTAACGCC 13 ACCGCGAAGG
4 GTGATCGCAG 14 TGAGCGGACA
5 CAATCGCCGT 15 GGTCTACACC
6 GTTTCGCTCC 16 CACCGTATCC
7 GTCCACACGG 17 AGGGCCGTCT
8 CTGCTGGGAC 18 ACAACGCCTC
9 CCACAGCAGT 19 GTAACCAGCC
10 CTCACCGTCC
　　基因组 DNA提取:参照吴丽圆 [ 4]的高盐沉淀法并略有改
动。具体方法如下:秤取 1. 0 g思茅松幼嫩针叶 ,用液氮研磨
至细粉状后 , 转入 10m L离心管中;加入 3 mL提取液 , 充分摇
匀 ,之后 65℃水浴 30 m in, 12 000 r /m in离心 10 m in;取上清
液 ,加入等体积氯仿∶异戊醇 (24∶1);充分混匀后 , 10 000 r /
m in离心 10m in;重复抽提 2次 ,取上清液;加入 2. 5倍体积无
水乙醇(预冷),在冰箱中静置 1 h后 ,用无菌枪头挑出白色絮
状沉淀物;用 70%乙醇洗涤 2次 , 风干后溶于 100μL TE中。
加入适量的 4 mo l L- 1NaC l, 使溶液中 NaCl的终浓度达到 2. 5
mo l L- 1 ,再次用无水乙醇将 DNA沉淀出来 , 经 70%乙醇洗
涤风干后 , 溶于 100μL TE中。所提取的 DNA用 0. 8%琼脂
糖凝胶电泳检测 , 并与 λDNA进行浓度比较和调整。
试验设计:参考尹佟明 [ 13] 、谢一青 [ 14]等有关研究文献 ,试验
初步选定思茅松 RAPD反应各因素的浓度范围。反应体系 20
DOI牶牨牥牣牨牫牱牭牴牤j牣cnki牣dlxb牣牪牥牥牱牣牥牴牣牥牨牨
μL, Bu ffer均为 2μL,均匀设计选择模板 DNA、M g2+、dNTP、引物
浓度以及 Taq DNA聚合酶用量 5个因素(s=5),每个因素取 4个
水平(q=4),按 U20(45)的均匀表来安排第 1次试验[ 15]。因素与
水平的安排见表 2,试验安排见表 3。以第 1次均匀设计优化出
的扩增体系为依据 ,固定一个稳定的因素 ,再进行第 2次均匀设
计试验 ,对其余因素进行筛选 ,直至优化出最佳反应体系。第 2
次均匀设计按 U12(34)进行 ,试验安排见表 4。
表 2　RAPD扩增体系因素与水平安排
水平
因　　　素
模板 DNA /
ng
引物 /
mm ol L- 1
TaqDNA /
U
M gC l2 /
mm ol L- 1
dNTP /
mm ol L- 1
1 10 0. 25 0. 5 2. 0 0. 25
2 30 0. 50 1. 0 3. 0 0. 50
3 50 0. 75 1. 5 4. 0 0. 75
4 100 1. 00 2. 0 5. 0 1. 00
表 3　第 1次均匀设计试验安排 U20(45)
试验编号模板 DNA /
ng
引物 /
mm ol L- 1
TaqDNA /
U
M gC l
2
/
mm ol L- 1
dNTP /
mm ol L - 1
1 30 0. 25 2. 0 3. 0 0. 25
2 100 0. 75 0. 5 3. 0 1. 00
3 30 0. 75 1. 5 2. 0 1. 00
4 10 0. 50 1. 0 3. 0 0. 25
5 30 1. 00 0. 5 4. 0 0. 50
6 10 0. 50 2. 0 4. 0 1. 00
7 50 0. 75 1. 0 2. 0 0. 25
8 30 0. 25 0. 5 2. 0 0. 75
9 100 0. 50 2. 0 2. 0 0. 75
10 100 0. 25 1. 0 3. 0 0. 50
11 10 1. 00 1. 5 2. 0 0. 50
12 50 1. 00 2. 0 3. 0 0. 75
13 10 0. 75 0. 5 4. 0 0. 75
14 30 1. 00 1. 0 5. 0 1. 00
15 50 0. 25 1. 5 4. 0 1. 00
16 10 0. 25 1. 5 5. 0 0. 50
17 50 0. 50 0. 5 5. 0 0. 25
18 100 1. 00 1. 5 4. 0 0. 25
19 100 0. 50 1. 0 5. 0 0. 75
20 50 0. 75 2. 0 5. 0 0. 50
　　PCR程序及产物检测:PCR扩增程序 , 94 ℃预变性 4
m in;94℃变性 1 m in、36℃复性 1 m in、72 ℃延伸 2 m in, 40个
循环;最后 72℃延伸 7 m in;4℃保存。产物检测 , 取 8 μL扩
增产物 , 与 1. 4 μL上样缓冲液混匀 , 电泳缓冲液为 0. 5 ×
TBE,在含 0. 5m g L- 1溴化乙锭的 1. 2%琼脂糖凝胶中电泳 ,
电压 4 V /cm。凝胶成像仪上拍照 ,记录试验结果。
表 4　第 2次均匀设计试验安排 U12(34)
试验编号 模板 DNA /ng 引物 /mmo l L - 1 T aqDNA /U dNTP /mmo l L -1
1 50 0. 50 1. 5 1. 00
2 100 1. 00 1. 0 0. 75
3 30 0. 50 1. 5 0. 50
4 30 1. 00 1. 5 0. 50
5 100 0. 75 1. 5 1. 00
6 30 0. 75 1. 0 1. 00
7 100 0. 50 1. 0 0. 75
8 50 1. 00 2. 0 1. 00
9 30 1. 00 2. 0 0. 75
10 100 0. 75 2. 0 0. 50
11 50 0. 75 1. 0 0. 50
12 50 0. 50 2. 0 0. 75
　　均匀设计优化的反应体系对 19条引物的扩增:用 19条
引物(引物序列见表 1)对优化的思茅松 RAPD反应体系进行
PCR扩增 , 检测其反应体系的可靠性和稳定性。以灭菌双蒸
水作对照 , 重复 3次。
2　结果与分析
2. 1　第 1次均匀设计优化的结果
由图 1可见 ,泳道 2、 3、 6、7、 8、 9、10、 11、 12、13无扩增产
物或扩增产物成片状模糊带 , 这 10个试验体系中的 Mg2+浓
度都较低 , 而 dNTP 浓度较高。 因此 , 可以推断思茅松的
RAPD标记反应体系需要较高浓度的 M g2+, 较低浓度的
dNTP。泳道 5、14、15、18、19、 20的扩增片断效果好 , 查看它们
的反应体系可知 , M g2+浓度都较高 ,为 4mmo l L- 1或 5mmo l
L -1;其他因素的变动范围都较大。根据以上结果 , 同时考虑
M g2+浓度过高可能产生非特异性扩增片断 , 因此 , 固定 M g2+
浓度为 4 mm ol L -1 ,进一步对其余 4个因素进行优化 。
2. 2　第 2次均匀设计优化的结果
根据第 1次优化设计的试验结果 ,把 Mg2+浓度设定为 4
mmo l L - 1 ,进行第 2次优化设计 ,试验结果见图 2。从图 2可
以看出, 泳道 2、6、7、10、11、12扩增效果较好。泳道 12的扩增
片断数量最多 、清晰度是最好的。根据 2次均匀设计的试验结
果 ,选定最佳反应体系(20μL)中的各因素组分为:DNA模板
用量 50 ng,引物浓度 0. 5mmo l L- 1 , M g2+浓度 4mmo l L- 1 ,
TaqDNA聚合酶用量 2. 0 U, dNTP浓度 0. 75mm o l L -1。
图 1　第 1次均匀设计试验结果
注:1～ 20为 20个试验安排。
17第 9期　　　　　　　　　　　　　　姜远标等:思茅松 RAPD反应体系的优化　　　　　　　　　　
图 2　第 2次均匀设计试验结果
注:1～ 12为 12个试验安排。
2. 3　优化体系对 19条引物的扩增结果
根据 2次均匀设计试验优化出的思茅松 RAPD标记最佳
反应体系 , 用 19条引物对该体系进行可重复性和稳定性验
证 ,试验结果见图 3。从图 3可以看出 , 19条引物应用该优化
体系皆能得到扩增产物 , 且多数引物的扩增条带数目多 、清晰
度佳 , 3次重复的结果都一致 , 表明该体系具有很好稳定性和
可重复性。
3　结论与讨论
通过 2次均匀设计 , 本研究优化出思茅松 RAPD反应体
系:在 20μL反应体系中 , DNA模板用量 50 ng, 引物浓度 0. 5
mm ol L -1 ,M g2+浓度 4 mm o l L - 1 , TaqDNA聚合酶用量 2. 0
U, dNTP浓度 0. 75 mm o l L -1。 PCR扩增程序为:94 ℃预变
性 4m in;94℃变性 1m in、 36℃复性 1m in、72℃延伸 7m in, 40
个循环;最后 72℃延伸 7m in;4℃保存。
图 3　 19条引物扩增的试验结果
注:CK为对照;1～ 19为 19条不同引物的扩增结果。
　　均匀设计方法是在正交设计的基础上发展起来的一种新
的适用于多因素多水平的设计方法 , 同时对多个因素的不同
水平进行研究 , 找出研究因素的最佳组合 ,是快速 、科学的方
法之一。 沈一岚 [ 16]通过正交试验设计 , 快速获得万寿菊
(Tagetes erect)稳定的 RAPD优化体系。谢一青 [ 14]的研究结
果表明 , 运用均匀设计方法快速得到条带清晰 、稳定性好的适
合光皮桦(B etu la lum inifera)的最优 RAPD体系。笔者尝试将
该法运用于思茅松 RAPD反应体系的优化 , 快速获得了稳定
的试验结果。
RAPD标记是 PCR扩增技术的具体应用 , 其结果受反应
体系中多个因素的影响。首先是 DNA模板的质量 ,高质量的
DNA模板是保证 RAPD反应顺利 、稳定进行的必要条件。模
板浓度在一定范围内对扩增结果影响较小 , 纯度对扩增的特
异性影响很大 , 模板 DNA的用量宁可少量 , 但要纯些 [ 17] 。本
试验的 DNA模板用高盐沉淀法提取 , 经琼脂糖电泳检测 , 含
有微量 RNA, 但能满足 RAPD的要求。汪小泉 [ 18]也认为模板
DNA中的 RNA对扩增结果无影响。 其次 , 反应体系中的
M g2+、 dNTP、引物浓度以及 Taq DNA聚合酶用量都与扩增效
果的好坏密切相关 , 并且它们中的一种因素 , 其浓度的高低 、
用量的多少会对其他因素产生明显的影响。M g2+浓度直接
影响着引物退火的特异性 、产物的真实性以及酶的催化能力。
Taq酶的聚合作用需要一定浓度的 Mg2+来激活 , 同时引物 、
模板双链的解链和退火温度也受 M g2+的影响 [ 13] 。 Low e[ 19]
指出 Mg2+可以提高 DNA双链结构的稳定性 , 增加 M g2+浓度
会使引物的错配频率增加 , 引物浓度与 M g2+浓度是相互影响
的。孟现东 [ 20]等在枫香(Liquidambar formosana)的 PCR扩增
程序优化过程中 , 选定 M g2+的合适浓度为 3. 0 mm o l L - 1 , 并
且提及:大部分木本植物的 PCR扩增都需要较高的 M g2+浓
度。朱秀志 [ 11]在优化峨眉含笑(M ichelia w ilson ii)的 RAPD体
系时发现 , Mg2+的适宜浓度较低 , 为 1. 5 mm ol L - 1。这些研
究结果表明了 M g2+浓度在 RAPD反应体系中的重要性 ,并且
变动范围较大。本研究的结果表明 , 思茅松的 RAPD反应体
系需要较高浓度的 Mg2+(4 mm o l L - 1)。当在进行扩增体系
优化得不到产物时 , 排除模板因素外 , 应该首先考虑 Mg2+浓
度。 dNTP的浓度直接影响产物的产量 、特异性及合成的可靠
性 ,同时对 M g2+浓度有较大的影响。钟军 [ 21]指出 ,在较低的
dNTP浓度下 , 增加 Mg2+浓度则扩增的严谨性下降;当 dNTP
浓度过高时 , 又会螯合大量的 M g2+,使得没有足够的 Mg2+来
激活酶的活性 , 导致扩增量减少 , 甚至得不到扩增产物。
TaqDNA聚合酶效果的好坏和用量的多少 , 能显著影响 PCR
扩增反应 , 是影响扩增结果的重要因素之一。有关 M g2+、
dNTP、引物及 TaqDNA聚合酶对 RAPD反应体系影响的详细
讨论可参见尹佟明 [ 13]和 Sambrook[ 22] 。
尽管有关 RAPD反应体系建立及优化的报道很多 , 对其
结果的稳定性也存在一些争议 , 但笔者认为不同植物的
RAPD最佳反应体系差别很大 , 所谓 “最佳 ”或 “优化 ”, 其目
的就是获得清晰 、稳定 、重复性高的扩增结果 , 只要建立针对
某一植物的最佳反应体系并严格控制试验条件和反应体系是
18 　　　　　　　　　　　东　北　林　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　第 35卷
完全可以实现研究目的的。
参　考　文　献
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(上接 13页)3个种子发芽指标为变量 , 对各种源进行主成分
分析 , 再利用得分进行系统聚类 ,确定不同种源花楸种子的表
征群 [ 10] 。聚类分析结果表明:在 25水平上可以将 7个种源
分为 A、B两个表征群 , 长白种源和白河种源为 A群 , 其它 5
个种源为 B群;而在 20水平上 , 可以进一步划分为 a、 b、 c 3
个表征群 , 除长白种源和白河种源为 a群外 ,汪清 、海林和通
化 3个种源为 b群 , 其余 2个种源为 c群(图 4)。 不同种源
花楸种子发芽特性差异较大 , 因此 ,若以种子发芽特性来评价
花楸种子的优劣 , 可以看出:长白种源和白河种源发芽效果最
好 , 发芽率高 ,发芽速度快;其次是汪清 、海林和通化种源;牡
丹江种源和带岭种源种子发芽率较低 ,平均发芽时间较长 , 发
芽效果最差。
图 4　花楸种子发芽特性聚类树形图
3　结论与讨论
花楸种子发芽比较容易 ,但对发芽条件要求严格。另外 ,
采种时期 、采种母树年龄 、采后处理 、贮藏及运输等对发芽特
性都有一定的影响。
不同质量浓度的赤霉素处理 ,花楸种子的发芽率 、平均发
芽时间和发芽势差异较为显著 。低质量浓度的赤霉素可以促
进种子的发芽 ,但赤霉素质量浓度过高则会抑制种子的发芽;
因此 ,在生产中以质量浓度为 0. 1 ～ 0. 2 g L - 1的赤霉素浸泡
种子 24 h,可以提高种子发芽率 , 缩短种子的发芽时间。但经
不同质量浓度的赤霉素处理过的种子在萌发过程中的生理变
化还有待于进一步研究。
花楸种子的发芽率 、平均发芽时间和发芽势都与种源的
纬度分布有关。从北到南随着纬度的降低 , 种子的发芽率和
发芽势提高 , 而平均发芽时间则缩短。笔者认为这是花楸种
子为适应温度 、水分等环境条件而长期形成的一种生态适应 ,
分布在低纬度地区的种子 , 由于温度较高 、空气湿润 , 休眠期
短 ,种子萌发更容易 ,反之亦然。因此 , 花楸种子的发芽特性
是对不同种源地气候适应的结果 , 这与刘震等 [ 9] 、刘桂丰
等 [ 11]的研究结果相一致 。
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19第 9期　　　　　　　　　　　　　　姜远标等:思茅松 RAPD反应体系的优化