全 文 ：作者简介:董学卫(1982-),男 ,山东大学威海分校海洋学院在读研
究生。 E-mail:dxwsd@163.com
通讯作者:朱启忠
收稿日期:2007 -06-11
第 23卷第 5期
2 0 0 7年 1 0月
Vol.23, No.5
Oct.2 0 0 7
大绿菇菌丝体富锌能力的研究
StudiesonZnaccumulationofrussulavirescens
董学卫
DONGXue-wei　
朱启忠
ZHUQi-zhong　
郭　锦
GUOJin　
郭晋东
GUOJin-dong
(山东大学威海分校海洋学院 ,山东 威海　264209)
(MarineColegeofShandongUniversityatWeihai, Weihai, Shandong264209, China)
摘要:对大绿菇菌丝体进行液体富锌培养。首先对大绿菇的
耐锌和富锌特性进行研究 , 结果表明:大绿菇具有很强的耐
锌能力和富锌能力 , 其菌丝体在锌浓度为 50 ～ 2 000mg/L的
固体培养基上均能够生长;菌丝体对锌的最适富集质量浓度
为 200 mg/L,超过 300mg/L锌质量浓度对菌丝体的生长有
较大影响。本试验还对富锌培养条件进行优化 ,在培养温度
26 ℃, 起始 pH5 ～ 6,振荡速度 100 r/min, 250 mL三角瓶装
液 75 mL, 接种量 15% (V ∶V), 培养基中锌添加量为
200mg/L时 , 大绿菇菌丝的生物转化量及菌丝体富锌率最
高 , 此时菌丝体生物量达到 8.79 g/L, 菌丝体含锌量为
2.530mg/g, 富锌率为 10.51%。对锌的有机化研究结果表
明:大绿菇能将锌转化形成体内共价结合的有机锌 , 而不是
简单的物理吸附 , 且其有机化程度在 81.6%左右。
关键词:大绿菇;锌;富集
Abstract:RussulavirescenswasculturedinliquidmediumcontainingZn
ions.TheZn-resistingandZn-accumulatingcharactersofsubmergedcul-
tureRussulavirescenswerestudiedinthispaper.Theresultsshowedthat
thecapacityofbothZn-resistingandZn-accumulatingofRusulavirescens
washigh.ThestraincangrowinthesolidmediumwithZincconcentrition
from 50 to2 000 mg/L.However, theZinccontentabove200 mg/Lham-
pereditsgrowth.Whenzincaddedtotheliquidmediumupto200 mg/L,
thehyphaehavethemostzincabsorbance.ItisalsofoundthattheZn-re-
coveryandthebiomassofRussulavirescenswerethehighestunderthe
liquidcultureconditions, thatis, fermentiontemperature26 ℃ , pH5～ 6,
stirringspeed100 r/min, 250 mLshakeflashcontaining75 mLmedium
containingZinc, inoculationsize15%.Withthiscondition, thebiomassof
myceliareached8.79 g/L, contentofZn2.530 mg/g, ratioofZn-accu-
mulation10.51% .Inourstudy, thedegreeoforganized-Znwasupto
81.6%.
Keywords:Russulavirescens;Zinc;Accumulation
锌是人体必需的微量元素之一 ,是许多金属酶的组成成
分或酶的激活剂。能参与细胞基因的转录和复制 ,促进激素
与受体的特异结合 , 促进生长发育与组织再生 , 增强智力发
育 , 尤其在有机化之后 , 形成的金属———有机复合物对人体
可产生各种特殊的生理功能和保健功能 , 人体缺锌将导致食
欲不振 、生长停滞以及免疫功能障碍等 [ 1] 。食品中以游离态
存在的锌不易被人体吸收 , 且一般游离态的金属均具有一定
毒性 [ 2] 。倘若通过食药用菌菌丝体细胞内物质代谢转化 , 将
无机锌结合到大分子活性物质(如多糖和蛋白质)上 , 成为有
机锌多糖和锌蛋白 , 则可避免无机锌的缺点 , 更有利于有机
锌的免疫功能和食药用菌抗病功能的发挥 [ 3] 。
本试验以大绿菇这种生长周期短的食用菌为材料进行
菌丝体富锌培养 , 研究大绿菇的富锌特性 , 锌的有机化程度
以及温度 、pH、接种量 、转速 、浓度 、培养基成分等各种理化因
素对锌富集的影响并筛选出最佳培养条件 , 为人类提供理想
高效的锌源 , 预防锌缺乏症。
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
ZnSO4:上海试验试剂有限公司 , AR;
双硫腙:广州化学试剂公司 , AR;
其他试剂:为国产分析纯;
721可见光分光光度计:上海光谱仪器有限公司;
离心机:上海安亭科学仪器厂;
摇床:龙口市先科仪器公司;
大绿菇(Russulavirescens):由海洋学院生物化学与分子
生物学实验室提供;
固体培养基:PDA培养基;
液体培养基(质量分数 , %):玉米粉 2, 蔗糖 2, 麸皮 1,
KH2PO4 0.1, MgSO4 0.1, VB 10mg/dL;
发酵培养基(质量分数 , %):玉米粉 2, 蔗糖 2, 麸皮 1,
KH2PO4 0.1, MgSO4 0.1, VB 10mg/dL。
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DOI :10.13652/j.issn.1003-5788.2007.05.037
1.2　培养方法
1.2.1　固体平板培养　将大绿菇接种到锌含量分别为 0,
50, 100, 200, 300, 400, 600, 800, 1 000, 2 000 mg/L的平板上 ,
于 26℃下培养 10d,测定菌落直径和萌发时间。
1.2.2　液体培养
液体菌种培养:取经活化的平板菌(约 1 cm2)接入液体
培养基中 , 500 mL三角瓶装培养基 100 mL, 一个平板接一
瓶 , 26 ℃, 150 r/min振荡培养 7 d。
富锌发酵培养:将液体菌种接入装 50 mL发酵培养基的
三角瓶中 , 接种量为 15%,分别加入终浓度为 0, 50, 100, 200,
300, 400 mg/L的 ZnSO4 母液 , 26 ℃, 120 r/min振荡培养
10 d。
1.3　菌丝体生物量的测定
取 150 mL发酵液于 3 000 r/min离心 20 min, 蒸馏水洗
涤 3次 , 60℃烘至恒重 , 分析天平称重 [ 4] 。
1.4　菌丝体富锌中锌有机化程度分析
持续透析法 [ 5] 。精确称取 0.5 g富锌菌丝体 , 在双蒸水
中反复透析 , 直至用茚三铜法检验透析液中无氨基酸为止 ,
测定菌丝体中含锌量。透析液中无机锌可以代表富锌菌丝
体中的无机锌含量 , 有机化程度指菌丝体中有机锌与总锌含
量的比值。
1.5　锌质量浓度的测定
双硫腙分光光度法测定 [ 6] 。
1.6　富锌率的计算 [ 7]
富锌率 =[富锌菌丝体含量(μg/g)-空白菌丝体锌含量(μg/g)] ×富锌菌丝体干重(g/100 mL)培养基内锌含量((μg/100 mL) ×100%
2　结果与讨论
2.1　大绿菇固体培养耐锌能力
将大绿菇接种到含不同浓度锌的固体平板上培养 , 考察
菌丝生长情况。 试验结果表明:大绿菇在含锌 50 ～
2 000 mg/L的培养基上均能生长 ,当培养基锌的浓度在 50 ～
200mg/L时对大绿菇菌丝体的生长有明显的促进作用 , 当锌
质量浓度超过 200 mg/L时大绿菇菌丝生长开始受到抑制。
结果见图 1。
图 1　大绿菇菌丝耐锌能力
2.2　大绿菇液体培养富锌能力
根据固体平板培养结果 , 配制锌质量浓度为 0, 50, 100,
200, 300, 400, 500 mg/L的液体培养基 ,进行液体培养 , 结果
见表 1。
表 1　大绿菇液体培养的富锌能力
Zn
/(mg· L-1)
干重
/(g· L-1)
含锌量
/(mg· g-1)
富锌率
/%
0 6.47 0.139 0
50 8.53 0.365 3.86
100 9.14 0.722 5.33
200 8.79 2.530 10.51
300 5.82 2.264 4.10
400 4.21 2.691 2.81
　　从表 1可看出 , 培养基中锌质量浓度为 0 ～ 100 mg/L
时 , 菌丝体中锌含量几乎不变 , 但对菌丝体生长有明显的促
进作用;培养基锌浓度达 300 mg/L后 , 菌丝体富集作用缓
慢。从菌体对锌的富集率来看 ,以添加 200 mg/L锌较适宜 ,
此时锌的富集率最大 , 达 10.51%。
2.3　锌有机化程度分析
采用持续透析法测定液体培养大绿菇富锌在菌丝体内
的有机化程度。结果见表 2。
表 2　锌的有机化程度分析
时间
/h
菌丝体总 Zn
质量分数
/(mg· g-1)
菌丝体处理后 Zn
质量分数
/(mg· g-1)
透析液中无机
锌质量浓度
/(g· L-1)
0 2.530 - -
12 - 2.396 78
24 - 2.158 115
36 - 1.849 182
48 - 1.843 184
　　从表 2可看出 , 大绿菇对锌有生物转化能力 , 持续透析
36 h后菌丝体内锌质量分数基本不变 , 表明锌与菌丝体内的
物质紧密结合形成有机锌复合体 , 不宜渗透析出 , 48 h时游
离锌含量为 18.4%, 其菌丝体内锌的有机化程度应为
81.6%。
随着培养基中锌浓度逐渐升高 ,菌丝体中锌的有机化程
度也在逐渐降低 , 这是由其富集机理决定的。大绿菇富集微
量元素的过程主要经历了一快一慢 2个步骤:第 1步 , 生物
吸附过程 , 培养基中的离子通过络合或离子交换等形式与菌
丝体细胞表面的化学基团结合 , 这一过程快速且不需要能
量 , 与代谢无关 ,主要受离子种类与浓度 、pH、富集时间 、竞争
离子等因素影响;第 2步 ,主动运输过程 , 离子透过细胞膜进
入细胞内部 , 形成真正的有机态微量元素 , 这一过程缓慢且
需要能量 , 与代谢过程有关 ,主要受代谢强度影响 [ 7] 。
18
科研开发 　 2007年第 5期
2.4　培养条件对大绿菇富锌的影响
2.4.1　接种量对大绿菇富锌的影响　从图 2可看出 , 接种
量为 15%, 发酵菌丝生物量和菌丝体含锌量都最高 , 因此 ,确
定接种量为 15%。
图 2　接种影响量对大绿菇富锌的影响
2.4.2　摇床转速对大绿菇富锌的影响　从图 3可看出 , 随
着摇床转速的增加 , 菌丝生物量和富锌量都有所增加;当转
速达到 100 r/min时 ,菌丝生物量和富锌量均最高;当转速高
于 100 r/min时 ,随着转速增加 , 菌丝生物量和富锌量均有所
下降。这说明大绿菇菌丝体需要一定的通气量 ,但较高的转
速可能会破坏菌丝体 , 不利于菌丝体自身生长和其对锌的富
集作用 [ 8] 。因此 , 确定转速为 100 r/min。
图 3　摇床转速对大绿菇富锌的影响
2.4.3　起始 pH对大绿菇富锌的影响　调节发酵培养液的
初始 pH分别为 4, 5, 6, 7, 8进行试验。从图 4可看出 , 初始
pH为 5 ～ 6时 , 菌丝生物量和菌丝含锌量都达到最高。因
此 , 确定发酵培养初始 pH为 5 ～ 6。
图 4　起始 pH对大绿菇富锌的影响
2.4.4　摇瓶装液量对大绿菇富锌的影响　在 250 mL三角
瓶中分别装入 25, 50, 75, 100, 125 mL培养基 , 接种量为
15%, 在 pH 5 ～ 6, 摇床转速为 100 r/min条件下进行培养。
由图 5可看出 , 随着摇瓶装液量的增加 , 菌丝体生物量先升
高后降低 , 装液量在 50 mL时生物量达到最高 , 而装液量为
75 mL时锌含量达最高。图 5表明:由于好氧菌的特性 ,培养
基的溶氧对大绿菇的生长代谢至关重要 , 过高或过低都不利
于大绿菇富锌 [ 4] 。本试验以菌丝体含锌量为目标产物 , 因此
确定装液量为 75mL。
图 5　装液量对大绿菇富锌的影响
2.4.5　培养温度对大绿菇富锌的影响　由图 6可看出 , 随
着温度的增加 , 菌丝体生物量是升高的 , 但菌丝体含锌量是
降低的。这说明较高的温度有利于菌丝体的生长 ,但不利于
锌的积累。由于在 26℃时菌丝体含锌量最高 ,故确定 26 ℃
为最适培养温度。
图 6　培养温度对大绿菇富锌的影响
3　结论
锌是人体新陈代谢必须的重要微量元素 , 与很多基础性
生理活动密切相关 , 维持机体正常代谢 。开发优质安全的补
锌食品 、药品是目前普遍关注的方向。目前补锌产品研究多
依赖无机补锌途径而鲜有效果更好的有机态补锌食品 [ 9] 。
国内外富集微量元素作为人及动物营养添加剂及药物所用
菌种主要为酵母 [ 10] ,还有的使用食用细菌的 [ 11] ,而以食药用
菌为材料对其富锌能力进行研究的则寥寥无几。少数研究
试验对象多为灵芝 、松茸等珍稀药用菌类 , 这些菌生长周期
较长 , 作为一般补锌食品或用为生产用菌种则不太合适。本
试验以大绿菇为试验菌种 ,因其生长迅速 ,培养周期短 , 且具
有较好的富锌能力 , 能较好的应用于生产开发 , 是一种新型
的安全高效补锌保健食品。
参考文献
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19
第 23卷第 5期 董学卫等:大绿菇菌丝体富锌能力的研究 　
图 2　1号菌株进行出芽与孢子生殖
2.2.1　本试验采用的酵母富集培养基有麦芽糖培养基 、麦芽
汁培养基 、PDA培养基 ,其中生长效果最好的是 PDA培养基。
2.2.2　在耐高糖试验中 , 在葡萄糖浓度为 50%, 60%的培养
基中的菌落形态与在葡萄糖为 2%(正常葡萄糖浓度)的培
养基中的菌落形态有明显不同 ,前者菌落变成半透明 , 且菌
落直径普遍较小 , 后者形态正常。
2.2.3　到目前为止 , 所发现的酵母种已超过 500种 , 分属于
60多属。在酵母属的区分中 , 主要根据其形态学特征 , 如细
胞形态 、芽殖方式 、能否产生子囊孢子及假菌丝 ,并结合少量
生理生化特性 , 其中以糖的发酵和同化为最重要。在碳源同
化试验中 , 同一菌种 ,当利用不同糖类时 , 细胞形态不同。如
3号菌 ,球拟酵母属(Torulopsis), 可以同化山梨糖与乳糖 , 前
者细胞为饱满的圆形 , 后者细胞为细长的椭圆形。
表 2　酵母菌鉴定结果
编
号
糖发酵
葡萄
糖
蔗
糖
麦芽
糖
可溶性
淀粉
糖同化
柠檬
酸
乳
糖
木
糖
山梨
糖
甘露
醇
乙
醇
氮同化
硝酸
钾
硫酸
铵
其他试验
尿素
分解
耐高糖
50%
耐高糖
60%
类淀
粉
产
酯
石蕊
牛乳
缺维
生素
热致死温度
/℃
耐酒精
能力
1 + + + - - - - - - + + + - + + - + - + 54 弱
2 + - - - - - - - + + + + - + + - + +1 + 54 弱
3 + + + - + + + + + + + + - + + - + - + 54 弱
4 + + + - - - - - - + + + - + + - + - + 54 弱
　　 　 +为阳性;-为阴性;1:+培养基变红 ,但未有胨化和凝乳现象;-培养基没有任何变化
3　结论
本试验从我国民间传统的面食发酵剂中 , 经分离鉴定筛
选得到 3 种酵母菌 , 它们分别是丝毕赤酵母属 (Hyphop-
ichia),酵母属(Saccharomyces)和球拟酵母属(Torulopsis),初
步证明了民间传统面食发酵剂的发酵作用是由酵母菌引起
的。它们的发酵能力 、发酵条件的优化以及其它有益菌种的
进一步鉴定将有待深入研究。
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第 23卷第 5期 王乃鑫等:传统面食发酵剂中酵母菌的分离鉴定