全 文 ：第 1 0卷第 3期
3 2 0 0年 6月
中 国水 产 科 学
Jn om a l f oFis e hy rSe ie e ne s C f ohi
na
V ol
.
1 0
Ju n
.,
N o
.
3
2 (幻3
黄海蓝点马蛟 m tD N A D 一 lo p 序列变异分析
姜艳艳` , 2 , 孔晓瑜` ,喻子牛` ,庄志猛 2 , 金显仕2
( 1
. 中国海洋大学 海水养殖教育部重点实验室 , 山东 青岛 26 60 3 ; 2 . 农业部海洋渔业资源
可持续利用重点开放实验室 , 中国水产科学研究院 , 黄海水产研究所 , 山 东青岛 26 6() 7 1 )
摘要 : 采用聚合酶链式反应 (CP R )技术对山东半岛南岸水域的蓝点马纹 (及。爪 6 e or
~
n
iPho 瓜。 )群体 ( n = 20) 的
mt DN A D 一 lo p 序列进行扩增 ,获得了大小约为 s o bP 的扩增产物 。 P CR 产物经纯化后进行序列测定 ,得到了 4 or
bp 的核昔酸片段 (除去引物及部分端部序列 ) 。 用 eG n e dco 软件进行排序比较 ,在这 20 个个体中 ,共检测到 54 个
变异位点 ,包括 2 个碱基缺失 、 1个碱基插人 、 43 个转换位点 、 7 个颠换位点及 2 个转换与颠换同时存在的位点 。 运
用 M EG A 软件计算出不同个体间的遗传距离 ,并据此构建了 U P G MA 和 NJ 系统树 。 用 D N A SP 软件计算出的多态
位点数 ( )S 为 54 、核昔酸多样性 (尸` )和平均核昔酸差异数 ( K )分别为 0刀 27 1 和 n . 以7 。 研究结果表明 ,蓝点马纹
的 mt DN A D 一 lo p 基因个体变异程度较大 ,适合于群体内及群体间不同个体的遗传多样性分析。
关键词 :蓝点马纹 ; mt D N A ;D 一 lo p ;遗传多样性
中图分类号 : 9Q 59 . 47 9 文献标识码 : A 文章编号 : 1X() 5 一 87 37 一 ( 2X() 3 ) 0 3 一 0 177 一 07
蓝点马纹 (反 。 m be or lno 、 n iPh on i。 ) ,俗称为马
加 、马绞 、鱿鱼等 ,广泛分布于东北亚水域 , 为营长距
离徊游的暖温性大型中上层经济鱼类 ,具有生长迅
速 ( 1个月的体长增长达 or m m 、 在 5 一 n 月的 1 个
生长季节内便可达商品规格 ) 、性成熟早 、 种群结构
较简单 、世代更新快等特点 ,可望成为重要的增养殖
对象 〔’ 」。 自20 世纪 50 年代以来 ,蓝点马绞一直是
我国黄渤海和 东海海区最为重要 的渔业对象之
一 2[] 。 但 20 世纪 70 年代后期起 , 由于秋汛拖网渔
业过多地捕捞当年幼鱼资源 ,致使渔获组成低龄化 ,
资源受到严重破坏 。 以往有关东黄海蓝点马敛的研
究主要集中在渔业资源学方面 〔` 一 ’ 〕 , 已有学者根据
其形态特征 ,采用计数性状及量度性状对东海蓝点
马鱿的种群进行鉴别〔6〕 。 迄今 , 国内尚未见蓝点马
纹遗传多样性方面的研究报道 。
线粒体 D NA ( m tD N A )具有进化速率快 、群体内
变异大 、 分子结构简单 、基本序列清楚及严格的母系
遗传等特点 ,已成为种内、 种间近缘群体间遗传分化
关系研究的有力工具 〔` 〕 。 本研究对分布于黄渤海
的蓝点马鱿 m tD N A D 一 lo p 序列进行 P CR 扩增和
测序以分析该蓝点马蛟群体的遗传多样性 , 旨为制
定合理的资源增殖和保护措施提供科学依据 。
收稿日期 : 2X() 2 一 o 一 0 ;2 修订日期 : 2X() 2 一 11 一 2.8
甚金项目 :国家重点基础研究发展规划资助项 目 ( 1G 9 9 04 3 7 ) ;山东
省自然科学基金资助项 目 ( y ZX( X) 1兀吟 ) .
作者简介 :姜艳艳 ( 19 76 一 ) , 女 , 硕士研究生 , 从事海洋分子生物学
研究 .
通讯作者 :喻子牛 , E 一 naI il : c a r l z y u @ ou q . ed u . 。 n
1 材料和方法
1
.
1 材料
4 0 尾蓝点马纹样品于 20 1 年 5 月下旬采 自山
东半岛南岸水域 ,平均叉长为 420 . 8 m m ,平均体重
为 61 2 . 2 9 ,均为 1 龄鱼 。 取尾部肌肉于低温冰箱中
保存 ( 一 70 ℃ )备用 。
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 总 D N A 提取 从 40 尾蓝点马敛样品中随
机选取了 20 个个体 ,取 0 . 1 9 肌肉组织以提取总
D N A
。 总 D N A 的提取按常规的“ 酚 一 氯仿 ” 方法进
行 〔’ 〕 , DN A 经异丙醇沉淀 、 70 % (体积分数 )乙醇洗
涤并干燥后 ,用 10 林L 超纯水溶解 , 一 20 ℃保存备
用 。
1
.
2
.
2 P CR 扩增 采用 p CR 扩增 m tD N A D 一 l o o p
区靠近 C yt o b 基因的部分苏氨酸 tR N A ( tR N A hT r )基
178 中 国 水 产 科 学 第 0 1卷
因 、全部脯氨酸 Rt N A( Rt N A、 )基因和其后的 D-
l op 绝大部分区域 ,所用正链引物和反链引物 [ ’ ” 〕分
别为 :
D I ( L1 59 2 6 )
: 5
` 一 T C A A AG C T TA CA C CAGT CT
T GT A A AC C 一 3 ’ 和 2D ( H 164 9 8 ) : 5 ` 一 C C T GA AG
T A GG A A CC A GA T G 一 3 ` 。
每个 P CR 反应总体积为 30 卜L ,其中模板 D N A
l 林L , d NT p s ( 2
.
5 m m ol/ L ) 2
.
4 林L , 引物 ( 10 林m o F
L ) 0
.
6 林 L , T叫 聚合酶 ( SU / 林L ) 0 . 2 林L , 3 . 0 卜L缓
冲液 ( 1 x or ,含 M g , 十 )和适量的去离子双蒸水 。
在 PT C 一 10 CP R 仪上进行 PC R 反应 , 采用热
启动 CP R ( 8 0 ℃ ) ,反应程序为 : 94 ℃预变性 2 m in ,
然后进行 3 3 个热循环 ( 9 4 ℃ 、 4 5 5 , 5 2 ℃ 、 1 m in , 7 2
℃ 、 l m i n ) , 72 ℃ 延伸 5 m in ; 10 ℃ 保温 。 CP R 产物
用 1 . 4% 琼脂糖凝胶电泳分离 , E B 染色 ,凝胶成像
系统观察并照像 。
1
.
2
.
3 P C R 产 物 测序 P C R 产物经试剂盒
( S K 142
,上海生工 )纯化后 , 由 P e kr i n E lm e r 公司的
A B I PR ISM B i g D y e T M T e mr i
n a ot r C y e l e s e q u e n e i n g
R e a a y R e ac t i o n K i t 及 A m p l iT a q DN A p o ly m e asr e 在
PCR 仪上进行测序反应 ,产物纯化后在 A BI P IR SM
37 7 x L DN A 测序仪上进行单向测序 ,测序结果进行
人工核对 、 校正 ; eG en do c 软 件进行排 序 比较 ;
M E以 软件计算个体间的遗传距离 ,并构建 UP G M A
和 NJ 系统树 ; DN A S P 软件计算遗传多样性参数 。
fo叩 基因的 AT 含量 ( 65 % )和中华鳄 D 一 lo p 基因
的 A T 含量 ( 58 . 1% )非常接近 [ ` ’ 一 ’ 2 〕 ,这也符合脊椎
动物 m tD N A D 一 lo p 区域碱基组成的特点 。
2 0 0b0
I O0 0 b
5 0b0
10b0
2 结果与讨论
2
.
1 目的片段的序列特征及群体内的序列变异
目的 DN A CP R 扩增产物的电泳检测结果如图
1所示 。 可以看到大小约为 50 b p 的 1 条整齐而清
晰的条带 。
本研究共测定了蓝点马蛟 20 个个体的 m tD N A
D 一 fo 叩序列片段 ,在除去引物及部分端部序列后 ,
其碱基序列长度为 4 10 b p 。 利用 B IA ST 与 G E N -
B A N K 中线粒体 D N A 序列进行比较 ,结果表明与脊
椎动物的相同序列片段部分有很高的同源性 (大于
8 6% )
。
A
、
T
、
c
、
G 4 种碱基在 20 个个体中的平均含量
分别 为 3 1 . 4 2% ( 3 0 . 8 1% 一 3 1 . 9 5% ) 、 3 7 . 2 2 %
( 36
.
3 4% 一 3 7
.
8 0% )
、
1 1
.
9 3% ( 1 1
.
4 6% -
12
.
6 8% )
、
19
.
4 3% ( 1 8
.
7 8% 一 2 0
.
0 5% )
,
A T 含量
( 68
.
64 % )高于 G C 含量 ( 31 . 36 % ) 。 结果表明 ,蓝
点马纹 m tD N A D 一 lo p 基因的 AT 含量与梭鱼 D -
图 1 目的 D N A 的 P C R 扩增产物
F ig
.
1 P C R am IP沂ed p r o d u c st of D 一 】加 p in SaP isn h
m 和应 e r e l
M : D ZL 《XX) 分子标记 ;
5
.
2
、
5
.
3
、
5
.
7
、
5
.
8 :分别为蓝点马纹的 4 个个体。
M : D皿0( 刃 Mar k er ;
5
.
2
,
5
.
3
,
5
.
7
,
5
.
8 : OF
u r i n d i v i d u al s Of S Pa n i sh
acm
h e rel
.
D 一 ol 叩序列变异位点在蓝点马蛟群体中的分
布如表 1 所示 。 41 0 b p 长度的核昔酸序列中共检测
到 5 4 个变异位点 , 其 中存在 2 个碱基缺失 (位点
9 7
、
13 8 )
,
l 个碱基插人 (位点 17 3 ) , 4 3 个转换位点
( A
一 G 、 C 一 T )
,
7 个颠换位点 (位点 3 、 7 、 8 、 1 1 、 2 1 、
85
、
13 9 )及 2 个转换与颠换同时存在的位点 (位点
16
、
108 )
。 结果可以看出 , 在 4 10 bP 的核昔酸序列
中 , 9 3% 的变异位点分布在 1 一 30 坤 , 而颠换位点
则集中分布在 1 一 10 b p 。
2
.
2 群体内遗传多样性分析
2
.
2
.
1 遗传多样性参数 通过 D N A S P ( 3 . 5 0 ) 软
件计算出这 20 个个体的遗传多样性参数 : 多态位点
数 ( S )为 54 ,核昔酸多样性 ( p ` )为 0 . 0 2 7 1 , 平均核
昔酸差异数 ( K )为 1 1 . 047 ,可见 ,该蓝点马敛群体的
遗传多样性较为丰富 。 近年来 , m tD N A 的研究不断
深人 ,其 D 环是 m tD N A 中不编码多肤链的核昔酸
片段 ,无修复系统 , 不受选择压力的影响 , 因而积累
了较多的变异 [ ” 〕 。 m tD N A 母系遗传特性使得相对
少的个体即可代表该群体的有效样本 (有效群体
小 ) ,反映出遗传变异情况 , 因此 , 这些参数已能代
表该群体的 D 环序列的变异水平 。
本研究所得的蓝点马蛟遗传多样性参数 ( s , 尸`
和 K )较梭鱼的 D 一 l o o p 数值 ( s = 2 6 , 尸` = 0 . 0 13 5 7 ,
天 = 6 . 6 4 3 ) [ ’ 4〕及中华鲜的 D 一 l o o p 数值 ( s = 3 5 , p `
= 0
.
0 12 5
,
K 二 5
.
2肠 l ) 〔” 〕高 , 这种现象一方面可
能与种类差异有关 ;另一方面 ,可能与蓝点马纹的栖
第 3期 姜艳艳等 :黄海蓝点马级 t m DN A D一 l op序列变异分析 17 9
息地多样性 , 活动范围大有关 , 因为蓝点马蛟广泛分
布于东黄海 、 渤海近岸水域的产卵场 、索饵场和越冬
场 ,并作长距离徊游 。 此外 ,蓝点马蛟不同于梭鱼等
其他增养殖鱼类 , 尚未受到由于人工苗种培育而导
致的近交等方面的影响 , 因而具有较丰富的遗传多
样性 。
2
.
2
.
2 个体间的遗传关系 应用 M E G ZA 软件 ,根
据 D 一 lo p 序列算出了 20 个个体间的 uK m ar 遗传
距离 (表 2 ) 。 从表 2 可见 , ①2 0 个个体中任何 2 个
个体间的遗传距离均不为 0 . 0 , 即任何 2 个个体的
核昔酸序列不完全相同 ,故共有 20 种单倍型 ;②最
大值 0 . 059 为个体 5 . 8 与 5 . 29 之间的遗传距离 ;③
最小值 0 . 0 2 为个体 5 . 7 与 5 . 30 之间的遗传距离 。
以 20 个个体的 D 一 lo p 序列构建的 UGP M A 系
统树和 NJ 系统树分别如图 2 、 图 3 所示 。 从图中可
以看出 , 2 种方法得到的系统树的拓扑结构基本一
致 , 20 个个体形成了 2 大分支 。 线粒体 D N A 属于
母系遗传 ,可推断该群体的 20 个个体可能来源于 2
个不同的母系祖先 ls[ 了。
S n i P 1 7
S n IP 3 1
S n i P 2 3
S n l P Z
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0 0 5
圈 2 由 D 一加p 序列得到的 U P G M A 系统树
n g
.
2 U P GM A Ph y】o g e n e t ie t n沈 b as ed on D 一的 p se q u e o c e s
3 结论
本研究从 D 环序列获得的群体遗传多样性参
数和个体间的遗传关系都表明 , 蓝点马敛山东半岛
南岸水域群体 目前的遗传多样性非常丰富。 从遗传
学和进化角度看 ,一个物种的遗传多样性高低与其
适应能力 、生存能力和进化潜力密切相关 。 物种的
遗传多样性越丰富 , 其适应能力 、生存能力和进化潜
力就越大 ,或者说遗传多样性为物种的适应能力 、生
存能力和进化潜力提供了潜在的遗传基础和储备 。
反之 , 遗传多样性的降低可导致其适应能力 、 生存
能力降低 , 物种退化 , 极端情况下甚至威胁物种生
存〔’ “ 〕。 近年来由于盲目发展流网数量 , 网 目缩小以
及秋后大量拖捕当年幼鱼 ,致使鱼体小型化 、渔获组
成低龄化 , 严重损害幼鱼资源 , 造成产量不稳 〔’ 1 。
长此以往 ,将会损害其遗传多样性和种质资源 的稳
定性 。 因为没有以前的数据作参照 ,本研究无法判
定蓝点马绞山东半岛南岸水域群体的遗传多样性水
平是否由于近年来过度捕捞有所降低 , 也不能肯定
遗传多样性水平受其影响的程度 。 当然 , 更不能因
为目前的相对丰富的遗传多样性水平而忽视必要的
保护和管理措施 ,相反 ,应广泛地分析各群体的遗传
第 3 期 姜艳艳等 :黄海蓝点马级 m t DA N D一 lo p序列变异分析 1 7 9
息地多样性 , 活动范围大有关 , 因为蓝点马蛟广泛分
布于东黄海 、 渤海近岸水域的产卵场 、索饵场和越冬
场 ,并作长距离徊游 。 此外 ,蓝点马蛟不同于梭鱼等
其他增养殖鱼类 , 尚未受到由于人工苗种培育而导
致的近交等方面的影响 , 因而具有较丰富的遗传多
样性 。
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2 个体间的遗传关系 应用 M E G ZA 软件 ,根
据 D 一 lo p 序列算出了 20 个个体间的 uK m ar 遗传
距离 (表 2 ) 。 从表 2 可见 , ①2 0 个个体中任何 2 个
个体间的遗传距离均不为 0 . 0 , 即任何 2 个个体的
核昔酸序列不完全相同 ,故共有 20 种单倍型 ;②最
大值 0 . 059 为个体 5 . 8 与 5 . 29 之间的遗传距离 ;③
最小值 0 . 0 2 为个体 5 . 7 与 5 . 30 之间的遗传距离 。
以 20 个个体的 D 一 lo p 序列构建的 UGP M A 系
统树和 NJ 系统树分别如图 2 、 图 3 所示 。 从图中可
以看出 , 2 种方法得到的系统树的拓扑结构基本一
致 , 20 个个体形成了 2 大分支 。 线粒体 D N A 属于
母系遗传 ,可推断该群体的 20 个个体可能来源于 2
个不同的母系祖先 ls[ 了。
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3 结论
本研究从 D 环序列获得的群体遗传多样性参
数和个体间的遗传关系都表明 , 蓝点马敛山东半岛
南岸水域群体 目前的遗传多样性非常丰富。 从遗传
学和进化角度看 ,一个物种的遗传多样性高低与其
适应能力 、生存能力和进化潜力密切相关 。 物种的
遗传多样性越丰富 , 其适应能力 、生存能力和进化潜
力就越大 ,或者说遗传多样性为物种的适应能力 、生
存能力和进化潜力提供了潜在的遗传基础和储备 。
反之 , 遗传多样性的降低可导致其适应能力 、 生存
能力降低 , 物种退化 , 极端情况下甚至威胁物种生
存〔’ “ 〕。 近年来由于盲目发展流网数量 , 网 目缩小以
及秋后大量拖捕当年幼鱼 ,致使鱼体小型化 、渔获组
成低龄化 , 严重损害幼鱼资源 , 造成产量不稳 〔’ 1 。
长此以往 ,将会损害其遗传多样性和种质资源 的稳
定性 。 因为没有以前的数据作参照 ,本研究无法判
定蓝点马绞山东半岛南岸水域群体的遗传多样性水
平是否由于近年来过度捕捞有所降低 , 也不能肯定
遗传多样性水平受其影响的程度 。 当然 , 更不能因
为目前的相对丰富的遗传多样性水平而忽视必要的
保护和管理措施 ,相反 ,应广泛地分析各群体的遗传
第 3期 姜艳艳等 : 黄海蓝点马纹 mt DN A D一 l op 序列变异分析 18 1
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1 8 2中 国 水 产 科 学 第 1 0卷
多样性情况 , 以之为参照 , 在今后定期对它们进行
遗传多样性的监测 , 然后根据其变化趋势 , 采取相
应有效措施 , 以维持现有合理的遗传多样性为前提 ,
科学地保护蓝点马鱿种质资源 , 以求其资源的可持
续利用 。
S n i P 1 0
S n i p 2 9
图 3 由 D 一 lo P 序列得到的 NJ 系统树
F i g
.
3 N J Ph y】o ge n e t i c ter b as e d on D 一 lo P s e q u e n ces
本研究仅对采自山东半岛南岸水域生殖群体的
样本进行了分析 ,有关结果尚不能全面地反 映蓝点
马绞多个群体的遗传多样性水平与群体分化状态 。
此外 , m tD N A 不同区域的变异率存在差异 , 遗传变
异解析能力也有所不同。 在本研究中 , D 一 lo p 序
列的个体变异较大 ,使我们能充分地检测 到群体丰
富的遗传多样性 , 这正是 D 一 lo p 序列的优势和广
泛用于群体水平研究的原因 。 当然 , m tD N A 其他基
因也可用于群体水平 (和种上水平 ) 分析 。 同时 ,
应该注意 , 由于存在于 D 一 lo p 序列某些位点的多
重 (次 )的替换 ,所检测的遗传多样性水平可能会略
有偏高 。 对此 ,可选择 m tD N A 其他不同的基因 (如
c ol
、
c yht 等 ) , 进一步比较蓝点马鱿群体内及群体
间的遗传多样性 。 更好的方法是把线粒体 D N A 序
列数据与核基因组多样性数据 (如 AF Lp 、 R ADP )结
合起来 ,相互印证和补充 ,则能更客观 、 全面地揭示
蓝点马纹的遗传多样性水平及其群体分化状况 。
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eP 二t i Bas
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第 3期 姜艳艳等 :黄海蓝点马纹 m t D NA D一 lo P序列变异分析1 8 3
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