全 文 ：收稿日期:2000-11-18初稿;2000-12-25修改稿
基金项目:福建省自然科学基金资助项目(C 96065)
　食用菌学报　2001.8(1):1 ～ 4
　Acta Edulis Fungi
双孢蘑菇mtDNA粗提物的酶切分析
廖剑华　王泽生　陈美元　李洪荣　卢政辉
(福建省轻工业研究所 ,福州　350005)
摘　要　发展了一种粗提双孢蘑菇 mtDNA 的方法 , 获得 As2796 亲代及子代系列菌株的
m tDNA粗提物 , 用 HaeⅢ 、CfoI、MspI、TaqI 等内切酶进行酶切 , 并对酶切结果进行了分析和讨论。
关键词　双孢蘑菇;mtDNA;限制性酶切
一般食用菌 mtDNA占总 DNA 的比例较高 ,且 mtDNA GC 含量比核 DNA 低 ,仅 30%左
右 ,故用识别四个GC碱基对的内切酶对总 DNA进行酶切时 ,mtDNA因识别位点少而能保留
较大片段 ,电泳后可直接进行多态性分析〔1〕 。由于双孢蘑菇细胞多核 , 故其 mtDNA 占总
DNA的含量较低 ,该方法难以显示 mtDNA 的清晰带型〔2〕。而提取纯 mtDNA ,或因操作麻
烦 ,或因设备要求较高 ,所需的菌丝量也较多 ,不便进行多种菌株的大规模培养和纯 mtDNA
的提取。故我们发展了一种折衷的简便方法 ,先粗提双孢蘑菇的 mtDNA ,然后用识别四个GC
碱基对的限制酶进行酶切分析 。
1　材料和方法
1.1　菌株
双孢蘑菇亲代菌株 8213 、02及其杂交子一代菌株W95-2 ,子二代菌株 As2796 ,子三代菌
株 4607 ,以及另一供试菌株 751-341 ,均由福建省蘑菇菌种研究推广站提供。
1.2　试剂
1.2.1　酶类　RNaseA购自美国Sigma公司 ,限制性内切酶HaeⅢ、Cfo I、MspI、TaqI 购自德国
宝灵曼公司。
1.2.2　化学试剂　Tris碱 、饱和酚购于上海生工公司 ,其它试剂均为国产分析纯。
1.3　菌丝培养
各菌株接在 PDA 液体培养基上 ,24℃静置培养 15 ～ 30d。
1.4　粗mtDNA提取
根据美国 Sy lvan公司提取纯 mtDNA的方法(私人通信),并加以修改和简化。用两层纱
布过滤菌丝体 ,加蒸馏水洗一遍 ,尽量挤干水分 。称重后 ,按 12mL 缓冲液/10g 菌丝体的比例
加入预冷的 Buf fer A(1.0M 蔗糖 , 10mM KH2PO4 , 0.1%BSA , 2mM 半胱氨酸 , 1mM EDTA ,
pH7.2),在高速组织捣碎机中充分破碎 , 1700g 4℃离心 20min ,上清液用两层纱布过滤后 ,
DOI :10.16488/j.cnki.1005-9873.2001.01.001
15000g 4℃离心 20min 。用 20mL Buf fer B(0.6M 蔗糖 ,10mM Tris-Cl ,pH7.5 , 2mM EDTA)
洗涤一遍 ,15000g 4℃离心 20min 。沉淀加 2mL Buffer C(10mM Tris-Cl ,pH8.0 , 10mM ED-
TA ,100mM NaCl , 2%N-十二烷基肌氨酸钠)混匀 ,加 RNase A 至 0.5mg/mL , 30℃水浴
30min ,酚 、氯仿/异戊醇各抽提一遍 。加 0.1V 3M NaAc(pH5.2), 2V 无水乙醇-20℃沉淀
2h ,台式离心机收集沉淀 ,70%乙醇洗后吹干 ,溶于适量纯水中 , -20℃保存备用 。
1.5　酶切
用厂家提供的缓冲液 ,50μL体系 ,适量 DNA 和内切酶 ,适宜温度下酶解 2.5h ,加 EDTA
至 10mM 终止反应。
1.6　电泳
按文献〔3〕的方法。用 0.8%琼脂糖检测提取的 DNA样品 ,用 1.0%琼脂糖检测酶切产
物 ,电压 5V/cm 。结束后 ,EB染色观察并照相 。
2　结果与分析
2.1　粗mtDNA提取结果
凝胶电泳分析表明 ,提取的粗 mtDNA 产量约 200 ～ 600ng/g 湿菌体(混有核 DNA),质量
尚可 ,都在 20Kb以上 ,有一定拖尾(图 1)。由于混有核 DNA ,用常规的内切酶酶切不能得到
mtDNA的清晰带型 ,因为核 DNA 酶解后产生的连续大小弥散状片段阻碍了 mtDNA 酶解片
段的观察 。但由于 mtDNA在提取的混合DNA中的比例大大提高(估计占 60%以上),使用识
M:λDNA/ EcoRI+HindⅢ markers ,下同
M:λDNA/ EcoRI+HindⅢ markers , similarly hereinaf ter
图 1　双孢蘑菇粗 mtDNA在 0.8%琼脂糖
凝胶上电泳分离结果
Fig.1　Electrophoretic patterns of crude mtDNA of
A.bisporus on 0.8% agarose gel
1道:无酶对照;2 , 3;4 , 5;6 , 7;8 , 9 道:分别为内切酶
HaeⅢ , CfoI , MspI , TaqI 酶切带型;2 , 4 , 6 , 8 道:2796粗
mtDNA;3 , 5 , 7 , 9道:751～ 341粗m tDNA
Lane 1:non-enzyme CK;Lane 2 , 3;4 , 5;6 , 7;8 , 9:bands
of HaeⅢ , CfoI , MspI , TaqI resp.;Lane 2 , 4 , 6 , 8:2796
crude mtDNA;Lane 3 , 5 ,7 , 9:751～ 341crude mtDNA
图 2　双孢蘑菇粗 mtDNA内切酶酶切图谱
Fig.2　Band patterns of crude mtDNA of
A.bisporus by endonuclease digestion
别四个GC碱基对的内切酶酶切时 ,很容易得到清晰的条带 。我们使用四种内切酶 HaeⅢ(识
别GG CC)、CfoI(识别 GCG C)、M spI(识别 C CGG)、TaqI(识别 T CGA)对粗 mtDNA 进行
酶切 ,获得的片段数达 15 ～ 20条(图 2),接近纯 mtDNA 酶切的效果。该提取方法简单 ,操作
2 食　用　菌　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　8 卷
方便 ,一次可提取多个样品 ,菌丝体用量介于直接分析法和纯 mtDNA提取法之间 ,20g 湿菌体
提取的粗 mtDNA 可供 10次酶切 。
2.2　As2796亲子代系列菌株的mtDNA分析
As2796是我站选育的高产优质杂交菌株之一 ,其亲子代关系如下〔4〕:
8213
不育单孢分离
As165
02
不育单孢分离
361-2
杂　交
W95-2 单孢分离 2796 单孢分离 4607
　　　 　　　　P　　　　　　　　　　Ps　　　　　　　　F1　　　　　　　　F2　　　　　　　F3
　　　　　异核亲本　　　　　　同核不育株　　　　杂交子一代　　　　杂交子二代　　　杂交子三代
优质菌株 8213和高产菌株 02的不育单孢杂交获得子一代W95-2 ,再通过连续的单孢
分离获得子二代 2796和子三代 4607 。mtDNA酶切图谱(图 3 ,图 4)显示 , 8213和W95-2 、
2796 、4607具有相同的线粒体基因型 ,而 02则呈现另一种不同的线粒体基因型 。这表明双孢
蘑菇线粒体是单亲本遗传的 ,杂交菌株 W95-2 、2796 和 4607 遗传了优质亲本 8213的线粒
体。对 2796家系的 mtDNA分析也直接验证了 Sonnenberg 关于双孢蘑菇线粒体单亲遗传的
论断〔1〕。
1道:无酶对照;2～ 6道:2796 、4607 、8213 、 W95-2和
02的粗m tDNA 酶切带型
Lane 1:non-enzyme CK;Lane 2～ 6:Digestion pat terns of
2796 , 4607 , 8213 ,W95-2 and 02
图 3　双孢蘑菇粗 mtDNA的 HaeⅢ酶切图谱
Fig.3　Band patterns of crude mtDNA of
A.bisporus by HaeⅢ digestion
1道:无酶对照;2 ～ 6 道:2796 、4607 、8213 、W95-2和
02的粗m tDNA 酶切带型
Lane 1:non-enzyme CK;Lane 2～ 6:Digestion pat terns of
2796 , 4607 , 8213 ,W95-2 and 02
图 4　双孢蘑菇粗mtDNA的 CfoI酶切图谱
Fig.4　Band patterns of crude mtDNA of
A.bisporus by CfoI digestion
3　讨论
常规的差速离心法提取纯 mtDNA〔5〕 ,需用 DNaseI 消化线粒体沉淀以去除核 DNA的污
染 ,再通过反复洗涤去除 DNaseI ,纯度要求较高的还要用蛋白酶 K 去蛋白 ,用超速离心去多
糖。该 mtDNA粗提法省略了这些步骤 ,使得操作大为简化 ,也减少了 mtDNA 的损失 。与氯
化铯密度梯度离心法提取纯 mtDNA〔1〕相比 ,该法不需超速离心机及相关操作 。当然该法的缺
点也是明显的。由于提取到的是 mtDNA粗提物 ,其应用是有限的 ,只能用几种内切酶进行酶
31 期　　　　　　　　　　　廖剑华等:双孢蘑菇 mtDNA 粗提物的酶切分析
切和线粒体分型 ,而不便进行 PCR及杂交等其它分子生物学操作。
根据 Sonnenberg对双孢蘑菇 mtDNA的基因分型〔1〕 , 2796线粒体基因型属 Ⅱ型 ,而 02线
粒体基因型属Ⅰ型 ,分别与世界上第一批育出的杂交菌株 U3和 U1属同一类型 。根据 HaeⅢ
酶切结果 ,2796与 02 的 mtDNA 分别切出 15条和 14 条带 ,其中共同带 11 条 ,两者相似值
S=2×11/(15+14)=75.9%,相似值较高。而从总 DNA获得的双孢蘑菇菌株间的遗传相似
值也较高〔6〕。这些说明了双孢蘑菇线粒体遗传的保守性及种质基因库(包括核 DNA和 mtD-
NA)的贫乏。在未来育种计划中 ,为了改良商品菌株 ,含有更多基因变异性的野生菌株具有重
要作用。
联系我们所做的这些菌株的同工酶谱〔7〕 , 2796 、8213 、02 分别属三种不同的同工酶类型:
HG4(杂合型)、G(优质型)和 H(高产型),而线粒体基因型并不能把三种菌株完全分开 ,暗示
了这些由核DNA编码的同工酶与 mtDNA无关。当然这并不说明双孢蘑菇mtDNA与菌株类
型无关 ,还有待继续进行更深入的实验 。
参　考　文　献
1　Sonnenberg ASM , Van Loon PCC , Van Griensven LJLD.Mitochondrial geno types and their inheritance in the
cultiv ated mushroom Agaricus bisporus.In:Genetics and Breeding of Agaricus.Wageningen:Pudoc, 1991.42
～ 51.
2　曾凡亚 , 张义正.食用真菌线粒体 DNA 的直接分析.微生物学通报 , 1998 , 25(1):5～ 9.
3　萨姆布鲁克 J ,弗里奇 EF , 曼尼阿蒂斯 T(金冬雁 ,黎孟枫等译).分子克隆实验指南(第二版).北京:科学
出版社 , 1992.304～ 318。
4　Wang ZS , Liao JH , Chen M Y et al.Molecular genetic study on the family of hybrid strain As2796 of Agaricus
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1999.66 ～ 74.
5　冯国宏 , 程文 ,陆师义.玉米黑粉菌 mtDNA 的研究.遗传学报 , 1991 , 18(4):378～ 384.
6　曾伟 , 宋思扬 ,王泽生等.双孢蘑菇及大肥菇的种内及种间多态性 RAPD 分析.菌物系统 , 1999 , 18(1):55 ～
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7　Wang ZS , Wang HC.Isozyme pat terns and characteristics of hybrid strains of Agaricus bisporus.Micol.
Neotrop.Apl., 1990 ,(3):19～ 29.
Analysis of Crude mtDNA of Agaricus bisporus
by Restriction Digestion
Liao Jianhua　Wang Zesheng　Chen Meiyuan　Li Hongrong　Lu Zhenghui
(Fujian Research Institute of Light Industry , Fuzhou　350005)
Abstract　An ex traction method fo r the crude mtDNA o f Agaricus bisporus was developed , the crude
m tDNAs of parent and offspring strains of As2796 were obtained and digested by endonuclease HaeⅢ 、Cfo I、MspI
and TeqI resp., while the digestion results were also analy zed and discussed.
Key words　Agaricus bisporus;mtDNA;Restriction digestion
4 食　用　菌　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　8 卷