全 文 ：第 卷第 期
年 月
激 光 生 物 学 报
一
甜叶菊 反应体系的优化
胡能兵 , 何克勤 , 张子学 , 林 平 , 隋益虎 , 崔广荣 `
安徽科技学院植物科学学院 ,安徽凤阳 安徽省甜叶菊工程技术研究中心 ,安徽 蚌埠
摘 要 以甜叶菊为试材 ,对影响其 反应体系的 个因子进行优化。结果表明 , 卜 的优化体系包括
双蒸水 林 , 含 溶液 林 , 的 林 , 卜 的引物
卜 , 的模板 林 , 聚合酶 热循环程序为 ℃预变性 , ℃变性 , ℃退火
, ℃延伸 , 个循环 ,最后 ℃延伸 。
关键词 甜叶菊 优化
中图分类号
文献标识码
文章编号 一 一 一 一
` 枯 , 、 , , 鳍 , , , 鳍
, , , ,
占 , , ,
吞
, 林 卜 , 卜 ,
协 , 林 协 , 协 一
℃ , ℃ ,
℃ , ℃ , ℃
占 己
甜叶菊 占 简称甜菊 、甜
草 、甜茶 、密菊等 ,为菊科甜叶菊属多年生草本植物 ,
原产南美巴拉圭一带 ,中国于 年引种成功〔〕。
甜叶菊富含糖营类物质 ,其糖昔具有高甜度 为蔗糖
一 倍 、低热量 仅为蔗糖的 的特点 ,
在体内不参与代谢 、不蓄积 、无毒性 ,被誉为是继甘
蔗 、甜菜之后的世界第三大糖源 。甜叶菊具有一定
的药理作用 ,对糖尿病 、心脏病和高血压等有较好的
疗效 ,现已广泛应用于保键饮料 、低热量食品和医药
行业科 。
目前 ,甜叶菊在国内外的研究仍然处于起步阶
段 ,如栽培 、离体快繁 、糖昔鉴定及优良单株筛选 、品
收稿日期 一 一 修回日期 一 一
基金项目 安徽省教育厅省级重点自然科学基金项目 蚌埠市科技计划项目 科字
作者简介 胡能兵 一 ,男 ,在职博士 ,讲师 ,主要从事园艺植物组织培养及育种工作 。 电子邮箱
, 通讯作者 崔广荣 一 ,男 ,安徽长丰人 ,博士 ,教授 ,主要从事植物生物技术研究工作 。 电子邮箱 币
第 期 胡能兵等 甜叶菊 反应体系的优化
种选育等方面 书〕,而与之相配套的优异基因的分子
标记 、种质资源指纹图谱构建却未见报道 ,这给从事
甜叶菊研究的各类人员 ,特别是期望品种得到保护
的育种家提出新的课题 。因此 ,开展分子技术方面
的研究已成为当前的首要任务 。基于此 ,本文拟通
过优化甜叶菊的 技术体系 ,建立稳定的
反应系统 ,既为品种的指纹图谱构建奠定前期基础 ,
亦为其它分子技术在甜叶菊上的应用铺路
扩增反应 基本的热循环程序为
℃预变性 , ℃变性 , ℃退火 ,
℃延伸 , , 个循环 ,最后 ℃延伸 。
扩增产物用 在 琼脂糖凝胶板上电
泳 ,加样量为 林 电泳结束后用 凝胶成
像系统进行拍照。
材料与方法
试验材料
甜叶菊杂交新品种 `皖甜 号 等 个亲本株 ,
由蚌埠永生农业科技有限公司提供 体系中使
用的 `、 和 酶购自北京康为世纪公司 ,
引物由上海 公司合成
试验方法
提取 采用胡能兵 中的
法一, 取 林 于 的琼脂糖凝胶板上进行
电泳检测 。
试验设计 体系优化采用单因子试
验 ,以 号材料对优化项目按照下面顺序依次开展
模板 浓度 、 和 `浓度 、引物浓度 、退火
温度 、 酶浓度和循环次数等 , 上述因子的处理水
平见表 ,下一个因子的优化是基于上一个因子在试
验范围内获得理想结果的基础上进行 。用于
反应的 林 基本反应体系为 双蒸水 · 协 ,
含 , , ,` 溶液 卜 , 、, `
的 林 , 卜 的引物 林 , 的模
板 卜 , 聚合酶 其中 ,用于优化反应
的 引物分别为 ` 和
` `
结果与分析
提取质量结果
随机取 个亲本单株的叶片提取 后进行琼
脂糖检测 。由图 可知 ,所提取的 带型整齐 ,纯
度高 ,无降解现象 ,经紫外分光光度计检测 , 纯
度较高 ,其浓度达到 州林
图 利用 法提取的 电泳图
。注 , 。 一尹 一 ` 。一
反应体系的优化分析
模板 和 浓度的优 化 以
表 】 体系的因子及其水平
子 〔·` 、 水平 卜
,到林
。
,
引物 林 、〕
退火温度 弋
酶
循环 亡 次
、 个引物对 种不同浓度的模板 、
进行筛选 ,结果见图 、 在 的 浓度下 ,
引物所扩增的条带较为模糊 ,呈弥散状 ,而 、
在其余浓度下表现条带数目一致 、产量相当 ,故
人选 的模板 浓度 不同 〔 浓度对
条 带 数 目 、产 量 影 响 较 大 当
为 林 时 , 引物未能扩增出条
带 , 引物扩增的产量较低 ,当 为 卜 时
时 , 引物扩增的条带类型减少 图 箭头所示 ,
引物扩增的条带呈弥散状 ,综合比较 林 、
卜时的 在两种引物的表现 ,以后者更为
合适 。
`和 引物 浓度 的优化 在 模板
和 卜 的 川 」基础上 ,用
种 十和引物浓度对引物 、 进行扩增 ,结果见
图 、 在 、 引物扩增的条带中 ,随着 `
巧 添加量的增加 ,条带数和产物量也随
之增加 ,但 林 和 卜 的 `之间无明显差
异 ,故以 林 为进一步试验的依据 。与 , 浓`度
562 激 光 生 物 学 报 第 卷
,
斗 、 一
图 不同模板 入浓度对仆、 带型影响
卜拜 、〔 , 卜淤一 。一 一
、
、 二 一
图 不同 `浓度对 带型影响
卜 、 、· 份 。。 、
一。
井 、 二 一
图 不同 ` 浓度对 带型的影响
一。
论丫一 〔 `一
井 、 乡 一
图 不同引物浓度对 带型的影响
、 一飞 一 ,
一
的表现相类似 ,随着引物浓度 林 的增加 ,
条带数和产物量也随之增加 ,而低浓度的 引物会
导致条带缺失 图 箭头所示 ,当引物为 林 和
林 时 ,处理的产物量相当 ,但高于浓度 衅
的处理 ,故选择 林 的 林 , 〔, 引物为佳 。
退火温度及 浓度的优化 用 种退
火温度对引物进行扩增 ,结果见图 随着退火温度
的不同 ,处理间的条带数和产物量也有差异 在试
验区间内 ,随着退火温度的提高 ,条带数减少 图
箭头所示 ,产物量降低 图 箭头所示 、 , 为
犷进一步验证退火温度对反应体系的稳定性 ,结合
几 浓度进行体系的优化 ,选择了 ℃、 ℃这
种温度和 种 浓度进行试验 ,结果见图 、 可
知 ,从退火温度方面考虑 ,随着温度的提高 ,小片段
比例增加 ,大片段比例减少 ,且体系不稳定 ,表现为
条带的缺少 图 箭头所示 、。 ,而 ℃条件下体
系稳定 从 浓度考虑 ,当 为 时 ,都未
能扩增出条带 ,当 为 ,弓物 未能扩增出
条带 ,引物 的条带模糊 ,说明扩一增的产物量较少 ,
综合比较 和 的表现 ,确定前者为适合的
浓度
循环数的优化
设计 个不同次数的循环进行扩增 ,在 种引物
中的表现与在 中的表现相类似 ,具体见图 。当
循环数为 时 ,引物 未扩增出条带 ,而引物
扩增出 条带 ,将循环数提高 时 , 种引物都扩增
出条带 ,数目与 、 次循环 一致 ,但产物量要明显
少 ,而 次循环和 次循环扩增在 种引物中未见
差异 ,故选择 次循环
讨论
技术具有操作简单 、实验成本较低 、节时
第 期 陈 鹏等 高功率微波辐照对视细胞膜脂质结构的影响
」
〔 〕
, , ,
定
【」 , , 一
, 叮
一 【」 , ,
一
, , ,
一 一
〔 」 , ,
【」 , , , 。 。
盯一
〔 」 , , 石
上接第 页
〔 」
。 」
群 , , 一
〔 」 , , ,
铭 罗 巴理
【」 邵 ,
, 一
〔 」 , 研 ,
哪
〕 , 一 ,
【 〕 , , ,
从即必
〔 」 邵 , , 一
【」 , , , 邵
。她 而 【」
, , 一
〔 」 胡能兵 紫色辣椒再生体系的建立及种质亲缘关系分析
〕合肥 安徽农业大学 ,
一 罗
〔 ,
【 」周延清 分子标记技术在植物研究中的应用「 」北
京 化学工业出版社 ,
一
宜 【 」 叮
,
【川 张子学 , 侯喜林 回归分析在辣椒品种 反应体系优化
中的应用 云南植物研究 , ,
一 , 一 脚
即 【」 , ,