全 文 ：第 14卷第 1 期 上 海 水 产 大 学 学 报 Vol.14 , No.1
2005年 3 月 JOURNAL OF SHANGHAI FISHERIES UNIVERSITY March , 2005
文章编号:1004-7271(2005)01-0006-06
三种礁膜属藻类的分子遗传多样性
和亲缘关系的 RAPD分析
收稿日期:2004-09-04
基金项目:浙江省科学技术厅科技兴海专项基金(2002C23014)
作者简介:谢恩义(1966-),男 , 湖南邵阳人 ,副教授 ,博士 ,从事水产增养殖及生物技术研究 , E-mai l:xieenyi@sohu.com
通讯作者:马家海(1940-),男 ,教授 , Tel:021-65710020 , E-mail:mjh25@sh163.net
谢恩义1 , 2 , 孙　彬1 , 马家海1
(1.上海水产大学生命科学与技术学院 ,上海　200090;
2.怀化学院生物工程系 ,湖南 怀化　418008)
摘　要:用 RAPD技术对礁膜 、袋礁膜和宽礁膜进行了 DNA 多样性分析 ,这 3 种礁膜的基因组 DNA 分子量均
约23Kb。在使用的88 个随机引物中 , 有43 个引物在所有样品中都能重复性较好地扩增出条带清晰的多态性
片段 ,多态引物比例为 48.86%, 袋礁膜 、宽礁膜和礁膜多态位点比例分别为 55.93%、65.28%和 53.14%。礁
膜与宽礁膜 、宽礁膜与袋礁膜以及礁膜与袋礁膜种间遗传距离分别为 0.411 8 , 0.414 8 , 0.437 5。通过对遗传
距离分析 ,结果表明采自 3 个不同海区的样本为同一礁膜属的 3 个种 , 与传统分类鉴定结果相吻合。 UPGMA
和NJ 法构建的种间分子系统树一致 , 结果是宽礁膜和礁膜之间的亲缘关系最近 ,宽礁膜与袋礁膜之间的亲缘
关系较远 ,礁膜与袋礁膜之间的亲缘关系最远 , 这与宽礁膜与礁膜共有形态特征较多 ,袋礁膜与宽礁膜 、礁膜
共有形态特征少相验证。
关键词:礁膜属;RAPD;遗传多样性;亲缘关系
中图分类号:S 917　　　文献标识码:A
Application of RAPD in analysing genetic variation and genetic
relationship of three species of Monostroma (Chlorophyta)
XIE En-yi1 ,2 , SUN Bin1 , MA Jia-hai1
(1.College of Aqua-life Science and Technology , Shanghai Fisheries University , Shanghai　200090 , China;
2.Department of Bioengineering , Huaihua College , Huaihua　418008 , China)
Abstract:Random amplified polymorphic DNA markers were used to analyse the DNA diversity of Monostroma
nitidum , M.latissimum and M .angicava.The size of genomic DNA of each species was about 23 kb.43 primers
screened from 88 random primers generated repeatedly clear polyotripic bands in all samples , and the proportion was
48.86%.The polymorphic sites proportion of M.nitidum , M.latissimum and M.angicava were 53.14%,
65.28% and 55.93% respectively.The inter-species genetic distances among those species(M.nitidum , M.
latissimum and M.angicava)were 0.411 8 , 0.414 8 and 0.437 5 respectively.The result showed that these
samples coming from three different marine area were the same genus but different species.Those were consistent
with the conventional systemic identification.The molecular phylogenetic tree constructed by UPGMA method
coincided with that constructed by NJ method.The result also indicated that the genetic relationship between M.
latissimum and M.nitidum was the nearest , that between M.latissimum and M.angicava was farther , and that
between M.nitidum and M.angicava was the farthest.The result also testified the fact that M .nitidum and M.
latissimum shared more common characteristics in morphology , while M.angicava shared less common
characteristics in morphology with M.nitidum and M .latissimum.
Key words:Monostroma;RAPD;genetic diversity;genetic relationship
　　礁膜属(Monostroma)最初划为石莼科(Ulvaceae),Kunieda 把礁膜科(Monostromaceae)与石莼科分
开[ 1] 。Cho等[ 2]用 RAPD技术进行了石莼目(Ulvales)藻类的遗传多样性标记和分析 ,发现礁膜属与石莼
属(Ulva)在遗传上存在显著差异 ,两者有较远的亲源关系 ,从而证明 Kunieda 的分类是正确的。杨君等
对石莼属和浒苔属(Enteromorpha)进行了 RAPD分析[ 3] 。在自然分类系统上 ,单凭形态特征是很难区分
礁膜属种类的 ,必须结合生活史的观察 ,但礁膜属藻类的生活史周期长 ,为了快速鉴定礁膜属种质资源 ,
以利育种育苗时选择适合栽培种类 ,在传统的形态分类的基础上 ,有必要对礁膜属种类进行分子遗传多
样性分析。运用 RAPD技术对大型海洋绿藻类研究较少 ,本文利用 RAPD技术对我国常见的 3种礁膜
属藻类 ,即礁膜(M .nitidum)、袋礁膜(M.angicava)、宽礁膜(M.latissimum)进行了 DNA 多样性分析 ,
以期为礁膜属种类的遗传育种提供理论和实践依据 ,为合理保护和利用礁膜属藻类的种质资源提供理
论依据。
1　材料和方法
1.1　材料
试验材料:礁膜采自浙江省奉化市沿海;袋礁膜采自山东省青岛市沿海;宽礁膜采自浙江省玉环县
人工栽培的网帘上。上述材料采集后 ,阴干至含水量为 30%～ 40%左右 ,用内放冰冻冰袋的保温箱带
回实验室 ,保存于-20℃的冰箱内待用 。提取DNA前 ,用消毒过滤海水仔细清洗新鲜藻体 ,洗去泥砂和
其它附着物 ,再用滤纸吸干表面水分 ,然后用于 DNA制备 。
1.2　总DNA的提取
参考杨君等[ 3]的方法并加以改进。把研石本 、杵和离心管等高压消毒。样品(约500 mg 鲜样品)加少
量提取缓冲液[ 3 %CTAB ,100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),20 mmol/L EDTA(pH 8.0),1.4mmol/L NaCl ,0.2
%(V/V)巯基乙醇 , 1 %PVP]于研石本中 ,把研石本放冰块上充分研磨样品呈糊状 ,转移至 1.5 mL 离心管
中 ,再加入 500μL 提取缓冲液 ,混匀后 ,于 60℃温浴20 min后 ,再置于-20℃冰冻 10 min ,后置于 60℃温
浴10 min ,加入 1/3体积 5 mmol/L KAc ,充分混匀 ,然后加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1),轻缓摇匀后 ,
8000 r/min离心 10 min。将上清液移至新管 ,并加入 2/3 体积异丙醇 ,轻缓混匀 ,于 12000 r/min离心 5
min;倒去异丙醇 ,用 Trip头挑出白而粘的絮状沉淀物 ,70 %乙醇洗涤 1 ～ 2次 ,无菌真空抽干 ,溶于 400
μL 0.1×TEⅡ中备用 ,使用时用TEⅡ缓冲液稀释到适当浓度 。
1.3　扩增前样品 DNA完整性 、浓度和纯度的测定
扩增前将总 DNA抽提物进行 1.2 %琼脂胶电泳(电压 5 V/cm ,电泳时间约 1.5 h),测定样品 DNA
的完整性 ,确定其分子量的大小。并将完整的 DNA样品用 752型紫外分光光度计测定 OD260值和OD280
值 ,以测定 DNA浓度和纯度 ,然后根据原浓度 ,将其稀释到 20 ng/μL ,保存于 4℃冰箱中备用 。
1.4　DNA扩增和电泳检测
1.4.1　随机引物
试验用的随机引物(10 bp)有 66个购自上海生工(Sngon)生物工程公司 ,另外 20个由上海摩尔生化
实验室合成 ,共计 88个 。
71期　　　　　　　　 谢恩义等:三种礁膜属藻类的分子遗传多样性和亲缘关系的 RAPD分析
1.4.2　RAPD反应体系
10×Buffer 、4×dNTP(10 mmol/L)、MgCl2(25 mmol/L)、引物(10μmol/L)和去离子水购自上海生工生
物工程公司 , TaqDNA聚合酶(5 U/μL)购自Canada Buistar Co.LTD。
RAPD反应条件为:反应总体积为 25 μL ,内含 10×Buffer(100mmol/L tris-HCl pH8.3 , 500 mmol/L
KCl)2.5μL ,MgCl2(10μmol/L)2.2μL , TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.3μL , 4×dNTP(10 mmol/L)1μL ,引物(5
μmol/L)2μL ,模板 DNA(10 ng/μL)2μL ,去离子水 15μL。
1.5　RAPD反应程序
RAPD反应在M J Research INC-PTC100TM公司生产的 PCR仪器上扩增 ,RAPD反应条件与Williams等
(1990)基本相似。基因组 DNA在PCR扩增仪上经 94℃预变性4 min后进行42个扩增循环 ,每个循环包
括:94 ℃变性 45 s ,37 ℃复性 1 min ,72 ℃延伸 1.5 min , 最后在 72 ℃延伸 10 min。
1.6　电泳检测
扩增产物经含 0.5μg/mL溴化乙锭 (EB)的 1.2 %琼脂糖凝胶电泳 ,以 DL-2 000作为分子量标记
物 ,电泳缓冲液为TBE ,在4 v/cm电场强度下电泳2.5 h左右 ,然后置于Gene-Genius凝胶成像仪下观察 、
拍照 。
1.7　统计分析
为避免因 RAPD技术的重复性较差而影响实验结果 ,作者进行了多次重复实验 ,只将重复性较好的
引物用于最终的结果分析 。并且在所有获得的片段中 ,只分析了稳定性较好的 、大小为 500 ～ 2 000 bp
的片段 ,未分析过大和过小的片段 。按照Nei等计算种间带纹相似系数(Sxy)的公式:Sxy =2 Nxy /(Nx
+Ny),再由 D =1-Sxy 算出 2个种间的遗传距离 。
2　结果
2.1　基因组 DNA的提取
琼脂糖凝胶电泳检测所提 DNA分子量大小约 23 kb ,紫外检测OD260/OD280值为 1.7 ～ 1.9 ,且重复性
较好 。
2.2　RAPD扩增结果
在所试用的 88个引物中有 43个引物在所有样品中都能成功且重复较好地扩增 ,得到一定大小的
片段(图 1为部分引物扩增产物电泳图),其中以清晰 、可辨扩增条带作为原始数据统计。88个引物中
有43个引物扩增出了较明显的多态性片段 ,多态引物比例为 48.86 %,3个种共检测到 342个可以统计
的位点 ,其中多态性位点 251个 ,占总位点数的 73.4 %。单引物最多可以产生 15个位点 ,最少产生 3个
位点 ,平均每条引物能扩增出 7.95个位点 ,其中平均多态位点为 5.84个 ,所扩增片段长度范围在 300 ～
2 500 bp之间 。袋礁膜总位点数为 177个 ,多态位点数为 99个 ,多态位点比例为 55.93 %;宽礁膜总位
点数为 216个 ,多态位点数为 141个 ,多态位点比例为 65.28 %;礁膜总位点数为 175个 ,多态位点数为
93个 ,多态位点比例为53.14 %。
2.3　种间的遗传相似系数及遗传距离
统计各种间共有的 RAPDS ,计算得到种间的遗传相似系数和遗传距离(表 1)。袋礁膜与宽礁膜之
间的遗传相似系数为 0.585 2 ,遗传距离为0.414 8;袋礁膜与礁膜之间的遗传相似系数为 0.562 5 ,遗传
距离为0.437 5;宽礁膜与礁膜之间的遗传相似系数为 0.588 2 ,遗传距离为 0.411 8。
2.4　聚类分析
根据 43个引物综合计算所得的礁膜属各种间遗传距离 ,应用 Phylip软件包 ,按照UPGMA法和N-J
法分别构建聚类图(图2-a、b)。从图中可以看出2种聚类分析结果一致 ,宽礁膜和礁膜先聚在一起 ,然
8 上 海 水 产 大 学 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　　14卷
后再共同与袋礁膜聚在一起。
表 1　袋礁膜 、宽礁膜和礁膜种间的遗传相似系数(对角线以上)/遗传距离(对角线以下)
Tab.1　Genetic similarity(above diagonal)/ genetic distances(below diagonal)matrix of
M.angicav , M.latissimum and M.nitidum
袋礁膜(M.angicava) 宽礁膜(M.latissimum) 礁膜(M.nitidum)
袋礁膜(M.angicava) - 0.585 2 0.562 5
宽礁膜(M.latissimum) 0.414 8 - 0.588 2
礁　膜(M.nitidum) 0.437 5 0.411 8 -
图 1　引物 P1-P20、S13-S15 、S53 、S55 扩增产物电泳图谱
Fig.1　RAPD patterns of M.nitidum(J), M.latissimum(K)and M.angicava(D)using different primers
(P and S are code names of different random primers)
注:(1)为引物 P1-P10扩增产物电泳图谱;(2)为引物P11-P18扩增产物电泳图谱;
(3)为引物P18-P20 、S53 、S55扩增产物电泳图谱;(4)为引物 S13-S15扩增产物电泳图谱。
91期　　　　　　　　 谢恩义等:三种礁膜属藻类的分子遗传多样性和亲缘关系的 RAPD分析
图 2　利用 UPGMA(a)和 N-J(b)法分析得到的聚类图
Fig.2　Dendrograms constructed by UPGMA(a)and N-J(b)cluster analy sis according
to genetic distance(1.M.angicava;2.M.latissimum ;3.M.nitidum)
3　讨论
3.1　DNA的提取
大型海藻细胞内不仅具有较高的核酸酶活性[ 4] ,而且细胞内含大量的多糖[ 5] ,在绿藻中 ,细胞壁微
纤维主要由木聚糖 、甘露聚糖及纤维素组成 ,而是还有少量的葡聚糖存在于细胞质内 ,另外尚有大量的
硫酸多糖组成细胞间物质 ,包括硫酸木聚糖 、硫酸鼠李糖等[ 6 , 7] 。由于海藻多糖是水溶性的 ,使海藻细
胞忍受渗透压变化的能力增强 。海藻多糖将 DNA缠绕包裹其中 ,在提取过程中使溶液十分粘稠 ,很难
分离 。海藻细胞较小(大约10μm),细胞壁又厚 ,因此 ,多糖的去除是海藻DNA提取所面临的一大难题。
DNA样品中的酸性多糖 、鞣酸 、多酚等 ,这些物质不仅会干扰 RAPD的进行[ 8] ,而且会影响实验的结果 ,
因此 ,在进行DNA提取的过程中必须尽量克服多糖的污染和干扰。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)是
一种阳离子型去污剂 ,它能跟核酸形成复合物 ,该复合物溶解于高盐溶液且稳定性好 ,同时它可选择性
地结合肽聚糖和蛋白质 ,并能有效地降低蛋白质的含量 。60 ℃左右的温浴可大大减少碳水化合物的含
量。经过如此处理 ,可以成功地除去蛋白质 、多糖的干扰。实验还发现 ,样品中加入少量提取缓冲液及
少量石英砂 ,低温充分研磨 ,然后于 60 ℃温浴 ,再冰冻(-20 ℃)1 ～ 2次 ,经过温浴 、冰冻再温浴处理 ,这
样使组织细胞易于破裂 ,使DNA从细胞中游离出来 ,能获较高产量的 DNA。
3.2　礁膜 、宽礁膜和袋礁膜三者之间的亲缘关系
根据 Theorpe[ 9]的研究结果 ,遗传相似系数 I<0.85 (遗传距离 D>0.15)的 2种群不可能为同一物
种 ,同属间 I为 0.2 ～ 0.8(D=0.2 ～ 0.8),同种间 I 是 0.8 ～ 0.97 , D为 0.03 ～ 0.2。本实验检测的样品 J
(礁膜)和K(宽礁膜)间遗传距离为 0.411 8 ,K(宽礁膜)和 D(袋礁膜)间遗传距离为 0.414 8 , J(礁膜)和
D(袋礁膜)间遗传距离为 0.437 5 ,据此 ,本实验采自 3个不同地点的样本为同一礁膜属的 3个种 ,即礁
膜 、宽礁膜和袋礁膜 ,与传统分类相吻合。石莼属与浒苔属的属间遗传距离为 0.596 ,石莼属内的种间
遗传距离为0.443[ 3] ,这与本实验研究礁膜属内的种间遗传距离相近 。
遗传距离的数值大小可以基本判断出所试材料之间亲缘关系的远近。从 UPGMA法和N-J法聚类
分析所得到的结果是一致的 ,都是宽礁膜和礁膜先聚在一起 ,然后再与袋礁膜聚到一起 ,这说明宽礁膜
和礁膜之间的亲缘关系最近 ,宽礁膜与袋礁膜之间的亲缘关系较远 ,与遗传距离的数值大小一致。礁膜
与袋礁膜之间的遗传距离最大 ,也说明礁膜与袋礁膜之间的亲缘关系最远 。
宽礁膜与礁膜生活史相似 ,而它们的生活史与袋礁膜有许多不同之处 。宽礁膜喜栖居于高潮带 ,礁
膜喜栖居于中 、高潮带 ,而袋礁膜常栖居于中 、低潮带。宽礁膜和礁膜为冷温性藻类 ,分布纬度较袋礁膜
为低 ,袋礁膜属亚寒性藻类 ,我国仅见于黄海和渤海。宽礁膜和礁膜在外形上均有光泽 ,配子体叶缘均
有壁褶 ,细胞切面观 ,礁膜为圆形 ,宽礁膜为长卵圆形;袋礁膜在外形上无光泽 ,细胞切面观为纵长方形。
传统分类上 ,从 3种礁膜的栖息习性 、生活史和形态特征等比较上看 ,宽礁膜与礁膜共有特征较多 ,亲缘
关系相近 。袋礁膜与宽礁膜 、礁膜共有特征少 ,亲缘关系较远 。这说明本研究以形态特征 、生活史等为
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依据的传统分类结果与以 DNA分子水平上的 RAPD标记结果一致。
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