全 文 ：南京农业大学学报 2015，38(1) :57－62 http:/ /nauxb．njau．edu．cn
Journal of Nanjing Agricultural University doi:10．7685 / j．issn．1000－2030．2015．01．009
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收稿日期:2014－05－06
基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(KYZ201147) ;教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET－12－0890) ;南京农业大
学青年科技创新基金(KJ2011009)
作者简介:程越，硕士研究生。* 通信作者:蒋甲福，教授，博导，主要从事菊花新基因挖掘、分离与功能鉴定研究，E-mail:jiangjiafu@ njau．edu．cn。
程越，韩笑，杨煊，等．菊花脑花器官的离体培养［J］． 南京农业大学学报，2015，38(1) :57－62
菊花脑花器官的离体培养
程越，韩笑，杨煊，陈发棣，房伟民，蒋甲福*
(南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095)
摘要:［目的］研究菊花脑(Chrysanthemum nankingense)花蕾再生不定芽的机制，构建菊花脑再生体系。［方法］以菊花脑花
蕾为试材，研究花蕾大小、生长调节剂浓度和花器官类型对不定芽再生的影响，同时采用常规石蜡制片法，对不定芽再生过
程进行组织学观察。［结果］直径为 0．4 cm 的花蕾最适于诱导不定芽再生;花蕾外植体的最适再生培养基为 MS+2．0
mg·L－1 6－BA+0．25 mg·L－1 NAA，再生率达 66．5%，平均不定芽数为 4．9。花托的再生率为 42．6%，舌状花、管状花再生率分
别为 16．7%和 13．1%，子房仅分化出少量芽体。组织学观察表明，花蕾中再生不定芽的部位为花托。不定芽的最适生根培
养基为 1 /2MS+0．2 mg·L－1 IBA，生根率和移栽成活率均为 100%。［结论］菊花脑花蕾再生不定芽属于器官间接发生途径，
以花蕾为外植体可构建高效稳定的再生体系。
关键词:菊花脑;花蕾;再生体系;组织细胞学
中图分类号:S682．1 文献标志码:A 文章编号:1000－2030(2015)01－0057－06
Floral organ in vitro culture of Chrysanthemum nankingense
CHENG Yue，HAN Xiao，YANG Xuan，CHEN Fadi，FANG Weimin，JIANG Jiafu*
(College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)
Abstract:［Objectives］Studying the regeneration mechanism of flower bud of Chrysanthemum nankingense，establishing its regeneration
system．［Methods］Some factors including size，plant growth regulators combinations and floral organ types were studied on flower bud
of C. nankingense for shoot regeneration，meanwhile，through the conventional paraffin method，histological observation about the whole
process of regeneration was conducted．［Ｒesults］The optimal size of flower bud for differential was 0．4 cm，and the optimal differential
medium was MS+2．0 mg·L－1 6-BA+0．25 mg·L－1 NAA，which resulted in the highest regeneration rate(66．5%)and highest average
number of adventitious bud(4．9)．Further analysis revealed that regeneration rate of torus was 42．6%，of ray flower and tubular flower
was 16．7% and 13．1%，respectively，while only a small amount of buds differentiated from ovary． Through histological observation of
flower bud，the adventitious buds originated from torus． The optimal rooting medium was 1 /2MS+0．2 mg·L－1 IBA and the rooting rate
and survival rate reached 100%．［Conclusions］The adventitious buds regeneration in flower bud belonged to indirect organogenesis，
and taking flower bud as explant would contribute to a high efficient and stable regeneration system for C. nankingense．
Keywords:Chrysanthemum nankingense;flower bud;regeneration system;histology
菊花脑(Chrysanthemum nankingense)又名路边黄、菊花叶等，为菊科菊属多年生宿根草本植物，适应性
强，在江苏、湖南、贵州等地均有野生种。菊花脑的嫩茎和叶富含维生素、挥发油和矿物质，具有消暑清热、
调中健脾、降压开胃等保健功效，在江苏地区属于经济价值较高的传统野生蔬菜。
菊花脑属于二倍体植物，遗传背景较为简单且参与栽培菊的起源［1］，将其作为模式植物开展研究可为栽
培菊的遗传育种提供理论依据。目前国内外对菊花脑的报道多集中在生产技术［2］、成分分析［3］、遗传加
倍［4－5］、种属间杂交［6－7］及以菊花脑叶片、茎段和叶柄为外植体构建再生体系［8－9］等方面。本试验以菊花脑花
器官为外植体，研究不同质量浓度生长调节剂对不定芽再生、生根的影响，观察花蕾不定芽的分化过程，旨在
探索花蕾再生不定芽的机制，建立高效稳定的再生体系，为菊花脑的遗传转化提供新的受体系统。
1 材料与方法
1．1 材料与培养条件
供试材料为二倍体菊花脑的花蕾，取自南京农业大学中国菊花种质资源保存中心。
南 京 农 业 大 学 学 报 第 38卷
组培室温度为(22 ± 1)℃，相对湿度为 40% ～ 50%，光照时间为 16 h·d－1，光照强度为 32 ～ 36
μmol·m－2·s－1。
1．2 试验方法
1．2．1 花蕾大小对不定芽再生的影响 先对花蕾进行消毒:于秋季选取尚未露白、萼片包裹紧密的菊花
脑花蕾，流水冲洗 20～30 min，在超净工作台上先用 70%乙醇(体积分数)浸泡 30 s，再用 0．1%(体积分数)
升汞溶液浸泡 7～8 min，无菌水冲洗 5次。选择直径为 0．2、0．4 和 0．6 cm共 3 种大小的花蕾为外植体，分
别接种于添加 1．0 mg·L－1 6－BA、0．5 mg·L－1 NAA 的 MS 培养基(含 30 g·L－1蔗糖，7 g·L－1琼脂，pH 调至
5．8，以下同)。每处理接种 24个，重复 3次，30 d后统计污染率和再生情况。不定芽长势按生长从弱到强
依次划分为 3个等级，分别用+、++和+++表示，分级标准对应为不定芽叶片卷曲畸形和玻璃化、不定芽黄
绿色和绿色。
1．2．2 不同浓度生长调节剂对不定芽再生的影响 花蕾消毒方法同 1．2．1节。将直径为 0．4 cm的花蕾接
种至 9种再生培养基:以 MS为基本培养基，6－BA 质量浓度设置为 1．0、2．0 和 3．0 mg·L－1，NAA 设置为
0．1、0．25和 0．5 mg·L－1。每处理接种 30个外植体，重复 3次，30 d后统计愈伤率、不定芽再生率和平均不
定芽数。愈伤率=形成愈伤的外植体总数 /接种外植体总数×100%;不定芽再生率=再生不定芽的外植体
总数 /接种外植体总数×100%;平均不定芽数=再生不定芽总数 /再生不定芽的外植体总数。
1．2．3 不同花器官对不定芽再生的影响 花蕾消毒方法同 1．2．1节。在超净工作台上将直径为 0．4 cm的
花蕾拆分为花托、舌状花、管状花和子房，并用手术刀切去舌状花和管状花的部分上端。将这 4 种花器官
分别接种于花蕾的最适再生培养基中，每种花器官接种 30 个外植体，重复 3 次，30 d 后统计愈伤率、不定
芽再生率和平均不定芽数。
1．2．4 花蕾不定芽再生的组织细胞学观察 花蕾消毒方法同 1．2．1节。将直径为 0．4 cm的花蕾接种至最
适再生培养基培养 30 d。每隔 3～4 d取 5个花蕾，FAA固定 24 h，4 ℃保存。按常规石蜡法包埋，组织切
片经铁矾－苏木精染色后，在 OLYMPUS BX41TF显微镜下观察拍照。
1．2．5 生根培养与炼苗移栽 切取长约 2 cm的菊花脑不定芽，接种至生根培养基(以 1 /2MS为基本培养
基，IBA质量浓度分别为 0、0．05、0．1、0．2和 0．3 mg·L－1)。20 d后统计生根率、平均根数和平均根长。每处
理接种 10个外植体，重复 3次。不定根在最适生根培养基中长至 3～4 cm时，将瓶盖半开炼苗。3 d 后取
出组培苗，洗净根部培养基，移栽至混合基质(泥炭、蛭石、珍珠岩质量比为 1 ∶2 ∶1)中，每日喷水保湿，15 d
后统计成活率。
1．3 数据处理
采用 Microsoft Excel 2007及 SPSS 20．0软件 Duncans多重比较法(P＜0．05)进行统计分析。
2 结果与分析
2．1 花蕾大小对不定芽再生的影响
由表 1 可知:花蕾直径越小，包裹的越紧密，消毒效果越好。直径 0．2 cm 的花蕾污染率最低，为
10．4%，但再生率和平均不定芽数也最低，再生出的不定芽个体小，长势弱。直径 0．6 cm 的花蕾再生率和
平均不定芽数均为最大值，但消毒效果最差，污染率达 37．5%。0．4 cm 的花蕾污染率较低，再生率和平均
不定芽数较高，分别为 31．9%和 2．9个，不定芽长势健壮。因此，直径 0．4 cm 的花蕾适于用作诱导不定芽
的外植体。
表 1 花蕾大小对不定芽再生的影响
Table 1 Effects of different sizes of flower bud on shoot regeneration
花蕾直径 / cm
Diameter of flower bud
污染率 /%
Browning rate
再生率 /%
Ｒegeneration rate
平均不定芽数
Average number of adventitious buds
不定芽长势
Growth potential of adventitious buds
0．2 10．4c 23．6b 2．5b ++
0．4 18．8b 31．9a 2．9a +++
0．6 37．5a 34．7a 3．1a +++
注:1)+:不定芽卷曲畸形和玻璃化;++:不定芽黄绿色;+++:不定芽绿色。+:The adventitious buds are curly，abnormal and hyperdric;++:
The adventitious buds are yellow-green;+++:The adventitious buds are green．
2)同一列中不同小写字母表示在 0．05水平差异显著。The different small letters in the same column mean significant difference at 0．05
level． The same as follows．
85
第 1期 程越，等:菊花脑花器官的离体培养
2．2 6－BA和 NAA对花蕾愈伤诱导和不定芽分化的影响
花蕾接种 1周后开始膨大，花萼增厚突起。12 d 后花蕾继续膨大开放，并在其底部形成黄色愈伤组
织。2周后陆续观察到绿色芽点突起，大多数芽点发生于花蕾侧面和底部的愈伤组织，也有少数发生于花
蕾中部。25 d后不定芽分化完全，呈绿色或黄绿色丛生状(图 1)。
图 1 不同浓度 6－BA和 NAA对花蕾不定芽再生的影响
Fig. 1 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on shoot regeneration of flower bud
编号 1～9同表 2。The code 1－9 are corresponding to Table 2．
由表 2可知:随着 NAA质量浓度的升高，愈伤率不变(均为 100%) ，愈伤量增多。6－BA和 NAA的浓
度对不定芽分化的影响很大，当 NAA(或 6－BA)浓度一定时，随着 6－BA(或 NAA)浓度的升高，不定芽再
生率和平均不定芽数呈现出先升高后降低的趋势。2．0 mg·L－16－BA 与 0．25 mg·L－1NAA 组合，再生率最
高为 66．5%，平均不定芽数最多，为 4．9个，不定芽为黄绿色或绿色，生长健壮。在 3．0 mg·L－16－BA或 0．5
mg·L－1NAA时，不定芽易出现叶片卷曲畸形和玻璃化现象。因此，MS+2．0 mg·L－16－BA+0．25 mg·L－1NAA
最适于诱导花蕾再生不定芽。
表 2 不同质量浓度 6－BA和 NAA对花蕾不定芽再生的影响
Table 2 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on shoot regeneration of flower bud
编号
Code
生长调节剂质量浓度 /(mg·L－1)
Plant growth regulator concentrations
6－BA NAA
愈伤率 /%
Callus induction
rate
再生率 /%
Ｒegeneration
rate
平均不定芽数
Average number
of adventitious buds
不定芽长势
Growth potential of
adventitious buds
1 1．0 0．10 100 22．2e 2．5d +
2 1．0 0．25 100 35．6cd 3．1c +++
3 1．0 0．50 100 31．1d 2．9cd ++
4 2．0 0．10 100 57．8b 4．1b +++
5 2．0 0．25 100 66．5a 4．9a +++
6 2．0 0．50 100 38．9cd 3．4bc ++
7 3．0 0．10 100 43．3c 3．8b ++
8 3．0 0．25 100 54．5b 4．1ab +
9 3．0 0．50 100 36．7cd 3．3bc +
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南 京 农 业 大 学 学 报 第 38卷
2．3 不同花器官对不定芽再生的影响
由表 3可知:不同花器官的愈伤率和再生率差异很大。舌状花和管状花接种 2 周后形成绿色致密状
愈伤，4周后再生出芽体，再生率较低，分别为 16．7%和 13．1%，不定芽茎叶细小，存在玻璃化现象。子房接
种 2周后形成黄色疏松状愈伤，愈伤率较高为 65．8%，但再生率最低且再生时间长，培养 30 d 时只分化出
少量芽体。花托接种 10 d后形成黄色致密状愈伤，3周后再生出不定芽，愈伤率和再生率远高于其他花器
官，分别为 77．4%和 42．6%，不定芽为绿色，叶形正常，长势良好。
表 3 不同花器官对不定芽再生的影响
Table 3 Effects of different flower organs on shoot regeneration
花器官
Flower organs
愈伤率 /%
Callus induction rate
再生率 /%
Ｒegeneration rate
平均不定芽数
Average number of adventitious buds
不定芽长势
Growth potential of adventitious buds
舌状花 Ｒay flower 41．2c 16．7b 4．5a ++
管状花 Tubular flower 38．5c 13．1b 3．7b ++
子房 Ovary 65．8b 6．3c 1．4c +
花托 Torus 77．4a 42．6a 3．2b +++
2．4 花蕾不定芽再生的组织细胞学观察
接种 0 d的花蕾，其花托表面紧密排布着一层狭长形细胞，体积较小，细胞核颜色深，内部的薄壁细胞
体积大，细胞核颜色浅(图 2－A)。接种 10 d后，花托内部少数薄壁细胞胞质浓缩，细胞核变大，聚集成分
生细胞团(图 2－B)。这些细胞作为生长中心继续分裂，构成了与周围愈伤细胞存在明显界限的分生组织
结节(图 2－C)。接种 16 d，花托愈伤组织的表层细胞大量增殖，向相同方向极性分裂，形成瘤状突起
(图 2－D)。接种 22 d，表层瘤状突起分化为生长锥，这表明花托愈伤组织芽分化属于外起源。随着叶原
基的出现，生长锥成长为完整不定芽(图 2－E)。
图 2 花蕾不定芽再生的组织细胞学观察
Fig. 2 Observation of the organizations anatomy on shoot regeneration of flower buds
A. 花托表皮细胞结构;B. 分生细胞团;C. 分生组织结节;D. 花托表层瘤状突起;E. 不定芽。箭头指示分化的细胞和分生组织。
A. Structure of receptacle epidermis;B. Meristematic cell mass;C. Merisematic nodules;D. Strumae in receptacle epidermis;E-
. Adventitious bud． The arrows indicate the differentiation and meristem cells．
2．5 生根培养基的选择与炼苗移栽
生根培养 6～7 d后，不定芽切口处长出白色不定根。由表 4可知:菊花脑在 5种生根培养基中的生根
率均为 100%。在不添加 IBA的 1 /2MS培养基中，不定芽根系细长，根毛稀疏。当 IBA质量浓度在 0．05～
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第 1期 程越，等:菊花脑花器官的离体培养
0．20 mg·L－1范围内，随着 IBA浓度的升高，根系变得更加粗壮。当 IBA质量浓度为 0．20 mg·L－1时，平均根
数为 7．1条，平均根长为 7．35 cm，根系粗长，根毛浓密，生根效果最好。再生植株经炼苗后移栽 15 d 的成
活率为 100%。
表 4 不同质量浓度 IBA对菊花脑不定芽生根的影响
Table 4 Effects of different concentrations of IBA on rooting of C. nankingense
ρ(IBA)/
(mg·L－1)
生根率 /%
Ｒooting rate
平均根数
Meaning number of roots
平均根长 / cm
Meaning length of roots
根系生长状态
Growth state of roots
0 100 6．9a 6．68b 细长，根毛稀疏 Thin，long and the fibril is sparse
0．05 100 4．7c 4．96c 细短，根毛稀疏 Thin，short and the fibril is sparse
0．10 100 5．5b 5．22c 粗短，根毛浓密 Wide，short and the fibril is thick
0．20 100 7．1a 7．35a 粗长，根毛浓密 Wide，long and the fibril is thick
0．30 100 6．7a 7．19a 粗长，根毛浓密 Wide，long and the fibril is thick
3 结论与讨论
本研究中，最适于诱导菊花脑花蕾再生的植物生长调节剂组合为 2．0 mg·L－1 6－BA+0．25 mg·L－1
NAA，低浓度的 6－BA诱导不定芽再生的概率低、平均不定芽数少，高浓度的 6－BA 或 NAA 则易引发苗体
玻璃化，这说明较高浓度的细胞分裂素与较低浓度的生长素搭配有利于不定芽再生，这与李辛雷等［10］对
不同品种小菊再生体系构建的研究结果相一致。
菊花花器官是离体再生的良好材料，Song等［11］研究了 6 种菊花叶片、叶柄、茎段和花瓣的再生能力，
结果表明花瓣诱导不定芽的再生率最高，平均不定芽数最多;李玉芬［12］比较了栽培菊不同花器官的再生
频率，结果表明花蕾、雌雄蕊分化的不定芽数最多，其次为花托、花萼，花瓣分化的不定芽数最少。本研究
发现，菊花脑不同花器官中花托的再生率最高，舌状花、管状花次之，子房的再生率最低且再生周期长。由
此可见，菊属植物花器官的再生能力不仅因品种而异，同一品种不同花器官的再生能力也存在差别。本研
究还发现舌状花和管状花形成愈伤和不定芽的部位在花瓣基部，上部切口几乎无愈伤产生，可能是因为基
部是花瓣的发生处，该处组织分化程度低于花瓣上部，真实原因有待进一步考证。
器官间接发生途径是指先通过外植体诱导愈伤组织，愈伤组织再分化出芽和根，继而获得完整植株的
过程，这是组培成苗的一种较为普遍的方式［13］。赵云鹏等［14］对花烛愈伤组织解剖结构的研究表明，花烛
离体再生以器官间接发生途径为主，芽原基主要形成于愈伤组织近表层处，属于外起源。本研究结果与之
相似，培养初期菊花脑花托内部形成了具有再生潜能的分生组织结节，但在后续观察中并未发现其进一步
分化，培养中后期花托愈伤表层细胞大量增殖，分化为芽原基。
以菊花脑叶片、茎段和叶柄为外植体已成功构建再生体系，但每个外植体的出芽数并不清楚，其优点
在于取材方便［8－9］。本研究以花蕾为外植体，虽然外植体只能在秋季开花时取材，但是若通过光周期调节
也可实现周年开花以方便取材。在我们研究过程中发现菊花脑的花蕾出芽数在 4 个左右，可以满足下一
步转化要求。构建高效稳定的再生体系是植物基因工程育种的基础［15］。本研究通过器官间接发生途径，
成功以花蕾为外植体建立了再生体系，为菊花脑的离体培养提供了新的外植体类型，也为其遗传转化奠定
了基础。
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责任编辑:范雪梅
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