全 文 ：第 35 卷 第 7 期 高 师 理 科 学 刊 Vol. 35 No.7
2015 年 7 月 Journal of Science of Teachers′College and University Jul. 2015
文章编号：1007-9831（2015）07-0049-05
HPLC 法分析羊栖菜与铜藻多糖的单糖组成
李伟，张旭，吴明江
（温州大学 生命与环境科学学院，浙江 温州 325035）
摘要：优化高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）分离鉴定糖醛酸和中
性还原单糖的最佳条件，并以此测定羊栖菜和铜藻多糖的单糖组成．改变磷酸盐缓冲液（PBS）
的浓度及 pH 值、PBS 与乙腈的比例、流动相的流速及柱温，获得最佳分析条件：流动相为 PBS
（0.1 mol/L，pH 6.9）-乙腈（v/v=83∶17），流速为 0.8 mL/min，检测波长为 254 nm，柱温为 25℃．以
三氟乙酸水解羊栖菜和铜藻多糖样品，水解产物用 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）进行柱
前衍生化，利用 HPLC分析单糖 PMP衍生物．结果表明，该方法测得各单糖线性关系和精密度均
良好，回收率较高，说明该方法较好，可以准确测定羊栖菜与铜藻多糖的单糖组成及质量分数．羊
栖菜与铜藻多糖均含有岩藻糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖及半乳糖
醛酸，且岩藻糖质量分数最高，但各单糖的质量分数差异较大．
关键词：羊栖菜；铜藻；多糖；单糖；高效液相色谱
中图分类号：Q539+.7 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1007-9831.2015.07.015
Analysis of the monosaccharide composition of polysaccharides from
Sargassum fusiorme and Sargassum horneri by HPLC
LI Wei，ZHANG Xu，WU Ming-jiang
（School of Life and Environmental Science，Wenzhou University，Wenzhou 325035，China）
Abstract：The analytical method of monosaccharides by high performance liquid chromatography（HPLC）was
optimized and applied to analyze monosaccharide composition of polysaccharides from Sargassum fusiorme and
Sargassum horneri．The concentration，pH value and ratio to acetonitrile of phosphate buffer（PBS），flow rate of
mobile phase and column temperature were changed to obtain the best analytical conditions. The mobile phase was
composed of PBS（0.1 mol/L，pH 6.9）-acetonitrile（83∶17）．The flow rate was 0.8 mL/min，and the detection
wavelength was set at 254 nm with column temperature of 25 ℃．The polysaccharides were hydrolyzed by
trifluoroacetic acid to give hydrolysates containing monosaccharide which reacted with PMP to produce the PMP
derivatives．The PMP derivatives were analyzed by HPLC. The linear relationships and degree of precision of nine
standard monosaccharides were all good and the recoveries were relatively high，indicating that this method can
accurately determine the monosaccharide compositions and contents of polysaccharides from Sargassum fusiorme
and Sargassum horneri．The polysaccharides from Sargassum fusiorme and Sargassum horneri were primarily
composed of fucose，galactose，xylose，mannose，rhamnose，glucuronic acid，glucose and galacturonic acid，and
Fuc occupied the lagest proportion．However，the monosaccharide content varied drastically．
Key words：Sargassum fusiorme；Sargassum horneri；polysaccharide；monosaccharide composition；HPLC

收稿日期：2015-05-02
基金项目: 国家自然科学基金资助项目（31470430；31200266；31070322）；温州市海洋环境与生物资源技术创新团队自主项目（C20120007-10）
作者简介：李伟（1987-），男，江苏淮安人，在读硕士研究生，主要从事糖生物学方面的研究．E-mail：liweiunique@126.com
通信作者：吴明江（1963-），男，黑龙江齐齐哈尔人，教授，博士，主要从事糖生物学方面的研究．E-mail：wmj@wzu.edu.cn
50 高 师 理 科 学 刊 第 35 卷
羊栖菜（Sargassum fusiorme）和铜藻（Sargassum horneri）同属褐藻门，马尾藻科，马尾藻属植物，
在我国主要分布于广东、福建、浙江和山东等沿海地区[1]．羊栖菜俗名为海大麦、海茜菜等，有“长寿菜”
之美誉[2]；铜藻又称丁香屋，有“海中森林”的美称[3-4]．这 2 种海藻均具有很高的药用价值和食用价值[5-6]．研
究表明，羊栖菜和铜藻中富含多糖、蛋白质、维生素、多种氨基酸、膳食纤维素及矿物质等营养物质，以
多糖质量分数最多[2，7-8]．近年来，关于羊栖菜和铜藻多糖的研究越来越多，主要涉及分离纯化[9-10]、结构[11-12]
及生物活性[12-16]等．
单糖组成是多糖性质、结构及构效关系研究的基础，HPLC 测定单糖组成操作简单、准确，重复性良
好，分析成本低，且能实现多种单糖较好地同时分离[17]．此前的研究虽有涉及羊栖菜多糖或铜藻多糖的单
糖组成[12-13，18]，但因相关研究选用的单糖标样不同而得到的结果不同．为了更客观准确地反映褐藻多糖的
单糖组成状况，本研究在其它研究的基础上选用 9 种单糖标样，对 HPLC 分析条件进行优化，并采用优化
的 HPLC 条件对羊栖菜和铜藻多糖的单糖组成进行分析验证．还对羊栖菜和铜藻多糖的单糖组成及其比例
进行对比研究，为深入研究其营养功能奠定基础，对这 2 种可食用海藻的开发利用具有重要的理论价值．
1 仪器与材料
1.1 仪器
1525 高效液相色谱仪（Waters 科技有限公司），包括 2487 紫外检测器、717plus 自动进样器及 Breeze
工作站；MS105DU 电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；HH-2 数显恒温水浴锅（江阴市保
利科研器械有限公司）；Milli-Q 超纯水仪（MILLIPORE 公司）．
1.2 材料与试剂
羊栖菜采购于浙江省洞头县，铜藻采购于浙江省南麂岛，由中国科学院海洋研究所王广策研究员鉴定．
L-鼠李糖（L-Rha），D-半乳糖醛酸（D-GalUA，国药集团化学试剂有限公司）；D-甘露糖（D-Man），D-
木糖（D-Xyl，中国药品生物制品鉴定所）；D-葡萄糖醛酸（D-GlcUA，SIGMA 公司）；D-葡萄糖（D-Glc，
TCI 公司）；D-半乳糖（D-Gal），L-阿拉伯糖（L-Ara，Dr Ehrenstorfer GmbH）；L-岩藻糖（L-Fuc，Fluka
BioChemika 公司）；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，ACROS 公司）；色谱纯甲醇和乙腈（Honeywell Burdick
& Jackson 公司）．其它试剂均为分析纯．
2 实验方法
2.1 多糖的分离与纯化
羊栖菜和铜藻多糖的提取参照文献[19]的方法，但有所改动．提取的液料比 v/m=30，温度为 85℃，煮
提 3 次，提取时间分别为 4，3，3 h，向提取液中加入 95%乙醇至乙醇终浓度为 80%，醇沉得到粗多糖．粗
多糖经大孔吸附树脂和 DEAE-纤维素柱层析初步纯化得羊栖菜多糖（SFP）和铜藻多糖（SHP）．
2.2 单糖分离条件的确定
2.2.1 单糖衍生化 标准单糖衍生化[20]：精确取 9 种 1 mg/mL 标准单糖溶液（Man，Rha，GlcUA，GalUA，
Glc，Gal，Xyl，Ara 和 Fuc）各 20 μL 于 1.5 mL 的离心管中，然后依次向其中加入 0.3 mol/L 的 NaOH 溶液
和 0.5 mol/L 的 PMP 各 0.5 mL，涡旋，于 70℃加热 30 min．反应后的样品以 10 000 r/min 离心 5 min，取 0.5
mL 上层清液于 10 mL 离心管中，依次加入 0.3 mol/L 的盐酸溶液和蒸馏水各 0.25 mL，涡旋．加入 2 mL 氯
仿，充分涡旋后 10 000 r/min 离心 5 min，去除氯仿层，重复 3 次．水层用 0.45 μm 的过滤器过滤后，进样
分析．
2.2.2 影响分离条件的因素 流动相由 A，B 两相组成，A 相为磷酸盐（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液（PBS）；
B 相为乙腈，采取等度洗脱的方式分离单糖．影响单糖分离的因素有 PBS 浓度、pH 值、PBS 与乙腈的比例、
流动相流速及柱温等．本研究中 PBS 的浓度分别为 0.05，0.10，0.20 mol/L；PBS 的 pH 值分别为 6.8，6.9
及 7.0；PBS 与乙腈的比例分别为 82∶18，83∶17 和 84∶16；流速分别为 0.6，0.8，1.0 mL/min；柱温分别
为 20，25，30℃．控制其它因素不变，研究某一因素对单糖分离效果的影响．
2.2.3 HPLC 分析 Waters 高效液相系统用于单糖的分离，色谱柱为 Thermo SCIENTIFIC ODS-2 HYPERSIL
C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），进样量为 20 μL，检测波长为 254 nm．
第 7 期 李伟，等：HPLC 法分析羊栖菜与铜藻多糖的单糖组成 51
2.3 单糖标准曲线、精密度及回收率
2.3.1 标准曲线绘制 依次各取 9 种 1 mg/mL 标准单糖溶液 0，10，20，30，40，50 μL 于 6 只 1.5 mL 离心
管中，建立标准单糖溶液的浓度梯度；按照 2.2.1 中的衍生化步骤进行衍生化；根据 2.2.2 中确定的最佳方
法进样分析，分别测定各单糖的峰面积．以标准单糖量 X（μg）为横坐标，峰面积 Y 为纵坐标，绘制标准
曲线．
2.3.2 仪器精密度实验 精确取 30 μL 9 种单糖标准溶液，按照 2.2.1 中的衍生化步骤进行衍生化，根据 2.2.2
中确定的最佳方法进样分析，重复进样 5 次，测定各单糖的峰面积，计算相对标准偏差，评估仪器的精密
度．
2.3.3 加样回收率 分别称取 2 mg 羊栖菜多糖和铜藻多糖，各加入等量的样品中含有的标准单糖，按 2.2.1
项进行衍生化后，进样检测，计算各单糖的平均加样回收率．
2.4 样品单糖组成测定
分别准确称取 2 mg SFP 和 SHP 于水解瓶中，加入 2 mol/L 三氟乙酸溶液 1 mL，密封，涡旋，120℃下
反应 1 h．反应液倒入蒸发皿中，45℃恒温干燥，并反复加入无水乙醇，直至完全蒸除三氟乙酸．加入 0.3
mol/L 的 NaOH 溶液 1 mL，溶解水解样品，按 2.2.1 项衍生化，根据 2.2.2 项确定的最佳方法进样分析，测
定各单糖的面积．
3 实验结果与讨论
3.1 单糖分离条件的确定
各因素对 9 种标准单糖分离效果均有较大影响，不同条件下各单糖分离效果见图 1．根据保留时间的
不同，可定性分析 9 种标准单糖出峰顺序．由图 1 可见，除 Gal，Xyl 和 Ara 外，其他 6 种单糖均能实现基
线分离，改变分离条件主要影响 Gal，Xyl 和 Ara 分离效果及保留时间．PBS 浓度降低、比例增加、pH 值
增大、流动相流速增大及柱温降低等都不利于 Gal 与 Xyl 的分离；反之则不利于 Xyl 与 Ara 的分离，柱温
升高还不利于 Rha 与 Glc A 的分离．PBS 浓度增加、比例增大、pH 值减小及柱温降低会缩短保留时间，反
之则会延长保留时间．减小流速虽能获得较高的分辨率，但大大延长了保留时间．综合各因素的影响，确
定单糖最佳分析条件为：流动相为 PBS 溶液（0.1 mol/L，pH6.9）∶乙腈=83∶17，流速为 0.8 mL/min，柱
温为 25℃．
保留时间/min保留时间/min
保留时间/min保留时间/min保留时间/min
图 1 不同因素对高效液相色谱分离 9种单糖的影响
注：A 为 PBS 浓度的影响；B 为 PBS 与乙腈比例不同的影响；C 为 PBS 不同 pH 值的影响；D 为流速的影响；E 为柱温的影响．
1 为 Man；2 为 Rha；3 为 GlcUA；4 为 GalUA；5 为 Glc；6 为 Gal；7 为 Xyl；8 为 Ara；9 为 Fuc．
52 高 师 理 科 学 刊 第 35 卷
最佳条件下 9 种标准单糖均能实现较好的分离，且不易分离的 Gal，Xyl 和 Ara 也几乎实现基线分离．
已有研究报道[21]，采用梯度洗脱的方法可以实现单糖的完全分离，但考虑到标准单糖及样品中杂质较少，
且分离度较好，所以本文只研究了简单方便的等度洗脱．
3.2 单糖标准曲线及精密度实验
9 种标准单糖的标准曲线、精密度及平均回收率的测定结果见表 1．由表 1 可见，9 种标准单糖的峰面
积与其质量分数呈良好的线性关系，相关系数 R2 在 0.990 3~0.995 8 之间．衍生化的单糖样品重复进样 5 次
的情况下，计算其相对标准偏差（RSD）在 0.94%~3.17%之间，表明该测定方法的精密度良好，符合分析
要求．经分析计算得各单糖的平均回收率在 96.35%~142.11%，表明该方法准确度较好．
表 1 9 种单糖的回归方程、精密度及回收率测定
标准单糖 回归方程 相关系数 R2 相对标准偏差 RSD/% 回收率/%
甘露糖 Y=8.38×104X+1.42×105 0.991 4 2.25 104.76
鼠李糖 Y=6.82×104X+9.88×104 0.992 7 1.10 102.31
葡萄糖醛酸 Y=5.14×104X+3.73×105 0.994 6 1.21 96.35
半乳糖醛酸 Y=2.62×104X+2.23×105 0.990 7 2.86 100.06
葡萄糖 Y=5.28×104X+3.83×105 0.990 3 0.94 103.62
半乳糖 Y=7.48×104X+3.92×105 0.995 8 2.01 108.55
木糖 Y=8.17×104X+1.26×105 0.993 3 2.06 103.41
阿拉伯糖 Y=8.82×104X+1.53×105 0.991 1 2.30 --
岩藻糖 Y=8.87×104X+1.15×105 0.994 3 3.17 142.11
3.3 样品单糖组成测定
SFP 和 SHP 水解、衍生化后，经 HPLC 分析，结果见图 2．根据保留时间可以定性分析出 SFP 和 SHP
所含单糖种类相同，三氟乙酸水解产物中均含有 Man，Rha，GlcUA，GalUA，Glc，Gal，Xyl 及 Fuc，均不
含 Ara．根据文献报道[22]，图 2 中标有 a 和 b 的２个峰应为甘露糖醛酸和古罗糖醛酸洗脱峰，因没有对应
的标准品，故未能对这２种糖醛酸进行定性和定量分析．
根据峰面积可计算出 SFP 与 SHP 酸水解
产物中各单糖的摩尔百分比，计算结果见表
2．由表 2 可见，SFP 和 SHP 所含单糖种类
虽相同，但各单糖的摩尔百分比却大不相
同．SFP 和 SHP 中单糖摩尔比最高的均为
Fuc，其次为 Gal．SHP 中各单糖摩尔比高低
顺序为：Fuc>Gal>Xyl>Glc>Rha>Man>GlcUA>GalUA；SFP 中各单糖摩尔比高低顺序为：Fuc>Gal>Xyl>Glc>
Man>Rha>GalUA>GlcUA．SHP 中 Fuc 的摩尔百分比高于 SFP，其它几种单糖的摩尔百分比均低于 SFP．
本研究测得羊栖菜和铜藻多糖的单糖组成结果与已有文献报道[12-13，18]稍有不同，主要在于本研究分析
的单糖种类更多，各单糖的摩尔比也随之不同，因而更准确地反映出单糖组成的实际状况，为其营养功能
性物质的深入研究提供依据．
保留时间/min 保留时间/min 保留时间/min
图 2 高效液相色谱分析 SFP和 SHP的单糖组成
注：A 为 9 种标准单糖；B 为 SFP；C 为 SHP．
1 为 Man；2 为 Rha；3 为 GlcUA；4 为 GalUA；5 为 Glc；6 为 Gal；7 为 Xyl；8 为 Ara；9 为 Fuc．
表 2 SFP 和 SHP 中各单糖的摩尔百分比
单糖组成/%样品
Man Rha GlcUA GalUA Glc Gal Xyl Ara Fuc
SHP 1.00 1.12 0.60 0.44 3.78 13.91 6.38 -- 72.77
SFP 3.34 2.03 1.06 1.34 5.06 26.15 13.02 -- 48.00
第 7 期 李伟，等：HPLC 法分析羊栖菜与铜藻多糖的单糖组成 53
4 结论
本研究通过改变单一因素，综合各因素对 9 种标准单糖分离的影响，最终确定了 HPLC 等度洗脱下最
佳的分离条件：Thermo SCIENTIFIC ODS-2 HYPERSIL C18 反相柱为色谱柱，流动相为 PBS 溶液（0.1 mol/L，
pH6.9）与乙腈混合液，比例为 83∶17，流动相流速为 0.8 mL/min，柱温为 25℃，检测波长为 254 nm．该
方法准确可靠，可同时对还原糖与糖醛酸进行分析，并且各单糖的分辨率较高．
三氟乙酸水解产物分析结果表明，SFP 和 SHP 中单糖种类相同，均主要由岩藻糖构成，但各单糖的摩
尔百分比差异较大．本研究测得 SHP 和 SFP 的单糖组成及摩尔比不同，预示着二者在结构及生物活性的差
异，相关研究有待进一步深入．本法不仅适用于羊栖菜和铜藻多糖的单糖组成分析，并且可以推广应用到
其它褐藻的单糖组成分析．
参考文献：
[1] 曾呈奎．中国常见海藻志[M]．北京：科学出版社，1983
[2] 戴志远，洪泳平，张燕平，等．羊栖菜的营养成分分析与评价[J]．水产学报，2002，26（4）：382-386
[3] 孙建璋，庄定根，孙庆海．铜藻人工栽培的初步研究[J]．南方水产，2009，5（6）：41-46
[4] 孙建璋，庄定根，王铁干，等．南麂列岛铜藻的研究[J]．现代渔业信息，2009，24（5）：19-21
[5] 许忠能，王朝晖，孙立．羊栖菜药用价值的研究进展[J]．中草药，2000，31（11）：876-878
[6] 赵东海，李梦璐，袁臻，等．铜藻总萜提取物抗抑郁活性及作用机制[J]．中国老年学杂志，2014，34（22）：6420-6421
[7] 袁清香，付玲．铜藻 Sargassum Horneri 的化学成分研究[J]．广东化工，2006，33（5）：42-43
[8] 朱亚珠，郝云彬．铜藻膳食纤维提取条件的研究[J]．浙江海洋学院学报：自然科学版，2008，27（2）：151-156
[9] 蒋定文，沈先荣，贾福星，等．羊栖菜多糖的提取及纯化[J]．食品科学，2007，28（12）：136-138
[10] 王作芸，赵学武．铜藻的褐藻糖胶、褐藻淀粉和褐藻胶的分离及纯化[J]．水产学报，1985，9（1）：71-77
[11] Li B，Wei X J，Sun J L，et al．Structural investigation of a fucoidan containing a fucose-free core from the brown seaweed，Hizikia
fusiforme[J]．Carbohydrate Research，2006，341：1135-1146
[12] Shao P，Chen X X，Sun P L，et al．Structural features and antitumor activity of a purified polysaccharide extracted from Sargassum
horneri[J]．International Journal of Biological Macromolecules，2015，73：124-130
[13] Shao P，Chen X X，Sun P L．Chemical characterization，antioxidant and antitumor activity of sulfated polysaccharide from
Sargassum horneri[J]．Carbohydrate Polymer，2014，105：260-269
[14] 宁准梅，王勤，林之川．羊栖菜多糖降血糖、调节血脂效果研究[J]．中国食品学报，2003（z1）：126-129
[15] 季宇彬，高世勇，张秀娟．羊栖菜多糖体外抗肿瘤作用及其诱导肿瘤细胞凋亡的研究[J]．中草药，2003，34（7）：638-642
[16] 吴越，曲敏，佟长青，等．羊栖菜多糖对小鼠抗疲劳作用的研究[J]．食品工业科技，2013，34（8）：350-352
[17] 梁军，夏永刚，杨炳友，等．柱前衍生化-HPLC 法分析麻黄多糖 ESP-B1 的单糖组成[J]．中草药，2011，42（10）：1985-1988
[18] Wu X D，Jiang W，Lu J J，et al．Analysis of the monosaccharide composition of water-soluble polysaccharides from Sargassum
fusiforme by high performance liquid chromatography/electrospray ionisation mass spectrometry[J]．Food Chemistry，2014，145：
976-983
[19] 王翀，吴涛．羊栖菜多糖提取与含量的测定[J]．哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2006，22（1）：11-13
[20] Strydom D J ． Chromatographic separation of 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone-derivatized neutral ， acidic and basic
aldoses[J]．Journal of Chromatography A，1994，678：17-23.
[21] 段元慧，邢丽红，丁海燕，等．柱前衍生-高效液相色谱法测定浒苔多糖的组成[J]．渔业科学进展，2014，35（2）：117-123
[22] Jonathan M C，Bosch G，Schols H A，et al．Separation and Identification of Individual Alginate Oligosaccharides in the Feces of
Alginate-Fed Pigs[J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61：553-560