全 文 ：植物资源与环境学报　2008, 17(1):7-12　　　　　　　　
JournalofPlantResourcesandEnvironment　　　　　
　　　 不同种源药用菊花 、野菊和菊花脑的
ISSR分子标记及遗传关系分析
吕　琳 , 秦民坚① , 贺丹霞 , 顾瑶华
(中国药科大学中药资源学研究室 教育部现代中药研究重点实验室 , 江苏 南京 210038)
摘要:采用 ISSR分子标记技术对来源于不同地区的 19份药用菊花(DendranthemamorifoliumRamat.)种源 、4份野
菊(D.indicumL.)种源 、1份菊花脑(D.nankingeseHand.-Mazz.)种源和 1份杂交菊花`黄金菊 (D.indicum×D.
morifolium`Gongju )种源进行了遗传关系分析。从 38条引物中筛选出 6条引物 , 共扩增出 66条带 ,平均多态性条
带百分率达 95.5%。聚类分析结果表明 , 取 λ=16, 25份种源可分成 2大组 ,即野菊 、菊花脑和杂交菊花归为一组 ,
19份药用菊花种源归为一组;19份药用菊花种源又可根据原产地进一步分成 2组 , 大部分原产北方的药用菊花种
源的遗传关系较近 , 而大部分南方栽培的药用菊花种源也有相对较近的遗传关系。
关键词:药用菊花;野菊;菊花脑;杂交菊花;ISSR分子标记;亲缘关系
中图分类号:R282.5;S567.2.021　　文献标志码:A　　文章编号:1004-0978(2008)01-0007-06
AnalysesofISSR molecularmarkerand geneticrelationshipofdiferentprovenancesof
Dendranthemamorifolium, D.indicumandD.nankingese　L Lin, QINMin-jian① , HEDan-xia,GUYao-hua(DepartmentofResourcesScienceofTraditionalChineseMedicinalMaterials, KeyLaboratoryofModernTraditionalChineseMedicinesofMinistryofEducation, ChinaPharmaceutical
University, Nanjing210038, China), J.PlantResour.＆Environ.2008, 17(1):7-12
Abstract:AnalysisofgeneticrelationshipsamongnineteenprovenancesofDendranthemamorifoliumRamat., fourprovenancesofD.indicumL., oneprovenanceofD.nankingeseHand.-Mazz.andonehybridprovenanceofD.indicum×D.morifolium`Gongju fromdiferentlocationswascariedoutbyusingISSRmolecularmarkertechnique.TheresultsshowedthatsixprimersofISSRwereselectedfrom
thirty-eightprimersandsixty-sixbandswereamplifiedbythesixprimers.Averagepercentageofpolymorphicbandwas95.5%.Theresultsofclusteranalysisindicatedthattwenty-fiveprovenancescouldbedividedintotwogroupsatλ=16, onegroupincludingD.indicum, D.nankingeseandahybrid, anothergroupincludingnineteenprovenancesofD.morifolium, thelaterwasfurtherdividedintotwogroupsaccordingtogeographicorigins.GeneticrelationshipsamongmostofD.morifolium
provenancesfromtheNorthernofChinawerecloseandgeneticrelationshipsamongmostofD.morifoliumprovenancesfromtheSouthernofChinawerealsoclose.
Keywords:DendranthemamorifoliumRamat.;D.indicumL.;D.nankingeseHand.-Mazz.;D.indicum×D.morifolium`Gongju ;ISSRmolecularmarker;geneticrelationship
　　菊花(DendranthemamorifoliumRamat.)为常用
中药材之一 ,在中国有二千多年的栽培历史 。药用
菊花除亳菊 、滁菊 、杭菊和贡菊 [ 1]外 , 还包括济菊 、
祁菊以及近年来江苏射阳从杭州引种并逐渐形成规
模的白菊花等。由于长期引种栽培及品种选育等原
因 ,造成药用菊花品种(系)混乱 、种质不清 ,为进一
步明确各品种(系)药用菊花间的遗传关系 ,许多学
者采用多种手段对不同品种(系)的药用菊花进行
了研究和探讨 。王德群等[ 2-3]对药用菊花的产地及
品种演变等作了较为全面的调查;何先元 [ 4]和徐文
斌[ 5]等分别对各道地产地或不同栽培型药用菊花
收稿日期:2007-01-23
基金项目:中国药科大学校引进人才科研启动基金(211068)
作者简介:吕　琳(1982—),女 ,河北安国人 ,硕士研究生 ,研究方向
为药用植物种质资源与质量相关性研究。
①通讯作者 E-mail:minjianqin@sina.com
进行了调查并对其内在质量进行了比较;白雁等 [ 6]
利用红外光谱和聚类分析法较明确地区分出不同品
种的药用菊花;还有许多学者对药用菊花野生近缘
种的质量进行了比较分析 ,如吕琳等对不同种源野
菊及菊花脑进行了挥发油成分的比较分析 [ 7] 。
近年来 ,分子标记技术被广泛用于植物种质遗
传多样性研究。用 RAPD和 AFLP等分子标记技术
对观赏菊花的研究证明 ,对于菊花这种高度网状进
化的类群而言 ,分子标记技术是一种极为有效的分
析手段 [ 8-12] ;徐文斌等 [ 13]采用 RAPD技术对药用菊
花进行了研究。由于不同分子标记技术各有优缺
点 ,因此 ,其研究结果可相互佐证 ,为深入了解药用
植物的遗传多样性及种质鉴别奠定分子基础。
ISSR(inter-simplesequencerepeat)标记技术
引物设计较简单 ,不需要预知 SSR两端的碱基序
列 ,多态性高 ,重复性好 ,并且能够提供更多的遗传
信息 ,目前该技术已应用于多种动植物的种质鉴定 、
遗传作图 、基因定位及遗传多样性等方面的研究
中 [ 14] 。
作者采用 ISSR分子标记技术对来源于不同产
区的药用菊花及其近缘植物野菊(D.indicumL.)
和菊花脑(D.nankingeseHand.-Mazz.)种源以及杂
交菊花 `黄金菊 (D.indicum×D.morifolium
`Gongju )进行比较研究 ,以明确这些种源的遗传
关系 ,为药用菊花的规范化栽培提供依据。
1　材料和方法
1.1　材料
25份种源包括药用菊花 19份 、野菊 4份 、菊花
脑 1份和杂交菊花 黄`金菊 1份 ,原产地见表 1。
每个种源随机取样 10株 ,加入硅胶密封 ,于 -20 ℃
冰箱中干燥保存 ,来源于江苏南京的样品均为从中
国药科大学药用植物园中采集的新鲜样品。
1.2　方法
1.2.1　总 DNA的提取及检测　采用改良的 CTAB
法提取基因组总 DNA, 用质量体积分数 0.8%琼脂
糖凝胶电泳后 , 0.5μg· mL-1 EB溶液浸泡 15 ～ 20
表 1　供试的药用菊花 、野菊及菊花脑种源的来源
Table1　OriginsofdiferentprovenancesofDendranthemamorifoliumRamat., D.indicumL.andD.nankingeseHand.-Mazz.
种源　Provenance 产地　Location
杭白菊 D.morifolium`Hangju (Hangbaiju) 江苏射阳 SheyangofJiangsuProvince(栽培 Cultivated)
菊花脑 D.nankingese 江苏南京 NanjingofJiangsuProvince(栽培 Cultivated)
中华贡菊 D.morifolium`Zhonghuagongju 山东汶上 WenshangofShandongProvince(栽培 Cultivated)
茶菊 D.morifolium`Chaju 河南温县 WenxianofHe nanProvince(栽培 Cultivated)
野菊 D.indicum 江西 JiangxiProvince(野生 Wild)
济菊 D.morifolium`Jiju 山东嘉祥 JiaxiangofShandongProvince(栽培 Cultivated)
野菊 D.indicum 安徽黄山 HuangshanofAnhuiProvince(野生 Wild)
大亳菊 D.morifolium`Boju (Daboju) 安徽亳州 BozhouofAnhuiProvince(栽培 Cultivated)
小亳菊 D.morifolium`Boju (Xiaoboju) 安徽亳州 BozhouofAnhuiProvince(栽培 Cultivated)
大白菊 D.morifolium`Hangju (Dabaiju) 江苏射阳 SheyangofJiangsuProvince(栽培 Cultivated)
小白菊 D.morifolium`Hangju (Xiaobaiju) 江苏射阳 SheyangofJiangsuProvince(栽培 Cultivated)
小白菊(怀菊)D.morifolium`Huaiju (Xiaobaiju) 河南温县 WenxianofHe nanProvince(栽培 Cultivated)
黄金菊 D.indicum×D.morifolium`Gongju 江苏南京 NanjingofJiangsuProvince(栽培 Cultivated)
红心菊 D.morifolium`Hangju (Hongxinju) 江苏射阳 SheyangofJiangsuProvince(栽培 Cultivated)
小黄菊 1号 D.morifolium`Hangju (No.1ofXiaohuangju) 江苏射阳 SheyangofJiangsuProvince(栽培 Cultivated)
小黄菊 2号 D.morifolium`Hangju (No.2ofXiaohuangju) 浙江桐乡 TongxiangofZhejiangProvince(栽培 Cultivated)
长瓣菊 D.morifolium`Hangju (Changbanju) 江苏射阳 SheyangofJiangsuProvince(栽培 Cultivated)
滁菊 D.morifolium`Chuju 安徽滁县 ChuxianofAnhuiProvince(栽培 Cultivated)
野菊 D.indicum 江苏南京 NanjingofJiangsuProvince(栽培 Cultivated)
野菊 D.indicum 江苏南京 NanjingofJiangsuProvince(栽培 Cultivated)
祁菊 D.morifolium`Qiju 河北安国 AnguoofHebeiProvince(栽培 Cultivated)
贡菊 D.morifolium`Gongju 安徽歙县 ShexianofAnhuiProvince(栽培 Cultivated)
大洋菊 D.morifolium`Hangju (Dayangju) 浙江桐乡 TongxiangofZhejiangProvince(栽培 Cultivated)
小洋菊 D.morifolium`Hangju (Xiaoyangju) 浙江桐乡 TongxiangofZhejiangProvince(栽培 Cultivated)
异种大洋菊 D.morifolium`Hangju (Yizhongdayangju) 浙江桐乡 TongxiangofZhejiangProvince(栽培 Cultivated)
8 　　　　　　　　　　植 物 资 源 与 环 境 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17卷　
min, Bio-Rad凝胶成像系统检验 DNA质量。提取
到的 DNA样品置于 -20℃冰箱中保存 、备用。
1.2.2　ISSR分析方法及产物检测　任意选取 2份
DNA样品 ,分别用 38个 ISSR引物(其中 36个根据
BritishColumbia大学公布的序列设计 , 2个参考相关
文献[ 15]设计 ,均由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成)进行扩增 ,经过反复实验 ,选择扩增条带
清晰 、反应稳定且多态性较好的 6个 ISSR引物对 25
个 DNA样品进行扩增 。
PCR反应体系的总体积为 20 μL,包括 20 ～ 80
ng模板 DNA, 2.25mmol· L-1 Mg2+ , 1×TaqDNA聚
合酶 缓 冲 液 (含 有 10 mmol·L-1 Tris-HCl、50
mmol· L-1 KCl, pH 9.0), 0.6 μmol· L-1引物 ,
dATP、dGTP、dCTP和 dTTP各 0.4 mmol· L-1 , 1.0U
TaqDNA聚合酶。
PCR扩增程序为:94℃预变性 5min;94℃变性
30 s, 50 ℃、52 ℃或 55 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸 2
min,共 40个循环反应;最后于 72 ℃再延伸 7 min。
反应产物以 DL2000为分子量标记 ,用质量体积
分数 1.5%琼脂糖凝胶电泳后 , 0.5μg·mL-1EB溶
液浸泡 15 ～ 20 min,用凝胶成像系统拍照。如果扩
增条带没有明显多态性 ,则用质量体积分数 5%非变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 0.5 μg· mL-1 EB溶液浸
泡 15 ～ 20 min,再用凝胶成像系统拍照 。
1.3　数据统计与分析
电泳图谱中的每一条带 (DNA片段 )均记为
1个分子标记 ,代表 1个引物的结合位点 。根据各分
子标记的有无及迁移率 ,统计所有二元数据;有带
(显性)记为 “1”,无带(隐性)记为 “0” ,强带和弱带
的赋值均为 “1”。用 SPSS分析软件中的 Jaccard方
法计算样品间的遗传相似系数 (geneticsimilarity,
GS),用 Ward smethod对 ISSR数据进行聚类分析 ,
并建立系统发育树状图。
2　结果和分析
2.1　ISSR扩增产物的多态性分析
通过预实验 ,从 38个 ISSR引物中筛选出扩增
条带清晰 、多态性高且重复性较好的 6个引物 ,并对
25份 DNA样品进行 ISSR分子标记分析 ,其中引物
S3扩增产物的电泳图谱见图 1 , 6个引物的序列及其
扩增结果见表 2。由表 2可见 , 6个引物共扩增出条
带 66条 ,其中多态性条带 63条 ,平均多态性条带百
分率达 95.5%,引物 ISSR1、S3和 S23扩增产物的多
态性条带百分率最高 ,均可达到 100.00%。统计发
现 ,扩增条带的长度为 250 ～ 2 000 bp。
2.2　聚类分析
根据ISSR结果计算供试的药用菊花 、野菊 、菊
M:分子量标记 Marker(DL2000);1.杭白菊 Dendranthemamorifolium `Hangju (Hangbaiju);2.菊花脑 D.nankingese;3.中华贡菊 D.
morifolium`Zhonghuagongju ;4.茶菊 D.morifolium`Chaju ;5.野菊 D.indicum, 江西 JiangxiProvince(野生 Wild);6.济菊 D.morifolium
`Jiju ;7.野菊 D.indicum, 安徽黄山 HuangshanofAnhuiProvince(野生 Wild);8.大亳菊 D.morifolium`Boju (Daboju);9.小亳菊 D.
morifolium`Boju (Xiaoboju);10.大白菊 D.morifolium`Hangju (Dabaiju);11.小白菊 D.morifolium`Hangju (Xiaobaiju);12.小白菊(怀
菊)D.morifolium`Huaiju (Xiaobaiju);13.黄金菊 D.indicum×D.morifolium`Gongju ;14.红心菊 D.morifolium`Hangju (Hongxinju);
15.小黄菊 1号 D.morifolium`Hangju (No.1ofXiaohuangju);16.小黄菊 2号 D.morifolium`Hangju (No.2ofXiaohuangju);17.长瓣菊
D.morifolium`Hangju (Changbanju);18.滁菊 D.morifolium`Chuju ;19.野菊 D.indicum, 原产江苏 JiangsuProvince(栽培于南京
CultivatedinNanjing);20.野菊 D.indicum, 原产湖北 HubeiProvince(栽培于南京 CultivatedinNanjing);21.祁菊 D.morifolium`Qiju ;22.
贡菊 D.morifolium`Gongju ;23.大洋菊 D.morifolium`Hangju (Dayangju);24.小洋菊 D.morifolium`Hangju (Xiaoyangju);25.异种大
洋菊 D.morifolium`Hangju (Yizhongdayangju).
图 1　引物 S3对药用菊花 、野菊和菊花脑的 ISSR扩增图谱
Fig.1　ISSRpaternofDendranthemamorifoliumRamat., D.indicumL.andD.nankingeseHand.-Mazz.amplifiedbyprimerS3
9　第 1期　　　　　　　吕　琳等:不同种源药用菊花 、野菊和菊花脑的 ISSR分子标记及遗传关系分析
花脑及杂交菊花 25个种源的平均遗传相似系数为
0.40,最大值达到 0.58,最小值仅为 0.13。总体上
看 ,由于扩增条带的多态性较高 ,各种源间的遗传相
似系数相对偏低 。
药用菊花 、野菊 、菊花脑及杂交菊花各种源的聚
类分析结果见图 2。取λ=16 ,供试的 25份种源可
表 2　用于药用菊花 、野菊和菊花脑ISSR分析的引物序列及扩增结果
Table2　PrimersequencesusedforISSRanalysisofDendranthemamorifoliumRamat., D.indicumL.andD.nankingeseHand.-Mazz.and
amplificationresults
引物
Primer
序列 1)
Sequence1)
长度 /bp
Length
条带数
Numberofband
多态性条带数
Numberofpolymorphicband
多态性条带百分率 /%
Percentageofpolymorphicband
ISSR1 (CT)8AGG 250-2 000 11 11 100.0
S2 (CT)8A 500-2 000 8 7 87.5
S3 (TC)8A 250-2 000 10 10 100.0
S16 (CT)8RC 250-2 000 16 15 93.8
S18 (CTC)6 700-2 000 8 7 87.5
S23 DVD(TC)7 250-2 000 13 13 100.0
总计 Total 66 63
平均 Mean 11 95.5
　1)R=AorG;D=A, GorT;V=A, CorG.
1.杭白菊 Dendranthemamorifolium`Hangju (Hangbaiju);2.菊花脑 D.nankingese;3.中华贡菊 D.morifolium`Zhonghuagongju ;4.茶菊 D.
morifolium`Chaju ;5.野菊 D.indicum, 江西 JiangxiProvince(野生 Wild);6.济菊 D.morifolium`Jiju ;7.野菊 D.indicum, 安徽黄山
HuangshanofAnhuiProvince(野生 Wild);8.大亳菊 D.morifolium`Boju (Daboju);9.小亳菊 D.morifolium`Boju (Xiaoboju);10.大白菊
D.morifolium`Hangju (Dabaiju);11.小白菊 D.morifolium`Hangju (Xiaobaiju);12.小白菊(怀菊)D.morifolium`Huaiju (Xiaobaiju);
13.黄金菊 D.indicum×D.morifolium`Gongju ;14.红心菊 D.morifolium`Hangju (Hongxinju);15.小黄菊 1号 D.morifolium`Hangju
(No.1ofXiaohuangju);16.小黄菊 2号 D.morifolium`Hangju (No.2ofXiaohuangju);17.长瓣菊 D.morifolium`Hangju (Changbanju);
18.滁菊 D.morifolium`Chuju ;19.野菊 D.indicum, 原产江苏 JiangsuProvince(栽培于南京 CultivatedinNanjing);20.野菊 D.indicum, 原
产湖北 HubeiProvince(栽培于南京 CultivatedinNanjing);21.祁菊 D.morifolium`Qiju ;22.贡菊 D.morifolium`Gongju ;23.大洋菊 D.
morifolium`Hangju (Dayangju); 24.小洋菊 D.morifolium `Hangju (Xiaoyangju); 25.异种 大洋菊 D.morifolium `Hangju
(Yizhongdayangju).
图 2　基于 ISSR分析的 25个药用菊花 、野菊和菊花脑种源的树状图
Fig.2　DendrogramofclusteranalysisbasedonISSRanalysisoftwenty-fiveprovenancesofDendranthemamorifoliumRamat.,
D.indicumL.andD.nankingeseHand.-Mazz.
10 　　　　　　　　　　植 物 资 源 与 环 境 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17卷　
明显分为 2个大组 ,一组包括野菊 、菊花脑及杂交菊
花 ,另一组包含全部的 19个药用菊花种源。取 λ=
14 ,可按不同产地的地理区域将药用菊花组细分成 2
个小组:一组为北方种源 ,另一组为南方种源。聚类
分析结果表明 ,大部分产自南方的菊花种源的遗传
关系较近 ,大部分产自北方的菊花种源也具有较近
的遗传关系 ,与传统的菊花分类结果一致 。
3　结论和讨论
3.1　条带多态性的意义
从 ISSR扩增产物的电泳图谱可以看出 , 25个供
试种源的主条带较为一致 ,说明供试种源间具有一
定的遗传关系 。另外 ,各种源的多态性条带百分率
较高 ,说明 ISSR标记能有效区分这些遗传关系很近
的种源 。
3.2　不同种源间遗传关系的讨论
聚类分析结果表明 , 25个供试种源可聚为两大
组 ,其中野菊 、菊花脑和杂交菊花聚为一组 ,所有药
用菊花聚为另一组。对于菊花来说 ,野菊 、菊花脑和
杂交菊花可被看作外类群 ,其中菊花脑在分类上曾
存在争议 ,有人认为它是野菊的变种 ,后来经染色体
原位杂交技术证明菊花脑应为独立种 [ 8 -9] 。菊花脑
和野菊在外部形态等方面十分相似 ,表明二者具有
很近的亲缘关系 ,本实验结果将它们聚为一大组 ,可
能与 ISSR分子标记所代表的表征性状有关。 黄`金
菊 是神农香菊(D.indicumvar.aromaticum)和贡菊
(D.morifolium`Gongju )的杂交品种 ,花较小 ,接近
于野菊 ,但舌状花和管状花数量比野菊多 ,其亲本之
一的神农香菊是湖北野菊的一个变种 ,研究结果将
黄`金菊 和野菊聚为一组 ,说明扩增出的特异性基
因片断中野菊表型的遗传表达占优势 。
一般认为 ,目前常用的菊花与长江南北分布的
四大名菊(即杭菊 、贡菊 、滁菊和亳菊)有密切的亲缘
关系。传统上认为 ,以长江为界 ,江南的杭菊和贡菊
以茶用为主 ,兼顾药用;江北的滁菊和亳菊以药用为
主 ,兼顾茶用 。据文献记载 ,北方的药用菊花与现在
的亳菊和小亳菊有密切关系 ,济菊 、祁菊以及现在怀
菊品种中的小白菊都是在清代引种于亳菊 ,而亳菊
又来源于早期的怀菊 。一般认为 ,南方的药用菊花
(如杭菊和贡菊等)都是引种于浙江的茶菊 ,通过产
地变迁 、优良品种选育等逐渐发展成现在的多个品
种(系)[ 2-3] 。聚类分析结果显示 ,杭白菊和贡菊的
亲缘关系较近 ,其中产自浙江桐乡的小黄菊和江苏
射阳的小黄菊及长瓣菊的遗传关系较近 ,证实了前
人的推测。在聚为一大组的药用菊花种源中 ,怀菊 、
祁菊 、济菊 、小亳菊 、中华贡菊 、滁菊及江苏射阳栽培
的小白菊遗传距离较近 ,形成一个分支 ,它们大部分
为北方菊花品种(系);而杭白菊 、贡菊 ,江苏射阳栽
培的长瓣菊 、大白菊 、小黄菊 、红心菊 ,浙江桐乡的小
黄菊 、大洋菊 、小洋菊 、异种大洋菊以及河南的茶菊
遗传关系较接近 ,形成另一个分支 ,主要是南方的菊
花品种(系)。上述种源中 ,江苏射阳产的药用菊花
主要引种于杭菊 ,大部分射阳产的药用菊花和杭菊
聚在一起 ,证实了它们之间的亲缘关系 。以上的研
究结果与传统的分类结果基本一致 ,但其中也存在
某些特例 ,其成因分析如下:
1)在南方菊花分支中出现了收集于河南的茶
菊和安徽亳州的大亳菊。文献上未见河南茶菊来源
的具体记载 ,也非市场上菊花药材的主流品种 ,当地
主要以茶用为主 。茶菊的形态与杭菊接近 ,舌状花
白色 、4 ～ 5层;管状花黄色 、数量较多 ,但茶菊花瓣常
带淡紫色。一般认为 ,菊花的花色最初为黄色和白
色 ,以后相继演化出其他颜色 ,其花色一般是偏母性
遗传 ,但是黄色演化出的其他颜色常表现出更强的
遗传能力[ 16] ,因此 ,花瓣淡紫应该是种质渗透的结
果 。
大亳菊当地称之为 “大马牙” ,在市场上也作为
亳菊出售 ,但一般认为其质量较小亳菊差 ,形态上与
小亳菊也有一定的差别 ,花形较大 、管状花数量较
多 。对早期亳菊和后来亳菊的评价完全相反 ,有人
认为大亳菊即为亳菊早期的栽培品种 ,而小亳菊是
清朝从河南引种 、亳州药材市场形成后发展而成的
品种[ 2] ,因此大亳菊和小亳菊的来源不同。本实验
结果显示 ,大亳菊和茶菊及大洋菊 、小洋菊的遗传关
系较近 ,这几种药用菊花在形态上与观赏菊花中的
小花型菊花品种相似 ,推测它们可能由小花型观赏
菊花培育而来 ,这一推测有待进一步研究证实 。
2)北方菊花分支主要包括怀菊中的小白菊 、中
华贡菊 、济菊 、滁菊 、射阳小白菊 、小亳菊和祁菊。其
中 ,中华贡菊种源收集于山东汶上 ,从名称上看似乎
和南方贡菊有一定联系 ,但因其形态和贡菊差异较
大 ,与贡菊的遗传距离也较远 ,据此分析认为 ,中华
贡菊可能是当地培育形成的品种 ,其亲缘关系则与
11　第 1期　　　　　　　吕　琳等:不同种源药用菊花 、野菊和菊花脑的 ISSR分子标记及遗传关系分析
原产北方的药用菊花较为接近 。
聚类分析结果表明 ,产于山东的济菊和滁菊的
遗传关系较近。江苏射阳产的药用白菊花在市场上
也做杭菊出售 , 主要是引种于杭菊选育出的品种
(系),亲缘关系与杭菊也就是南方菊花较近。但在
本研究结果中 ,江苏射阳产的小白菊和北方的小亳
菊聚在一起 ,其原因还有待进一步的研究 。
综上所述 ,本研究结果基本支持药用菊花的传
统分类观点 ,同时也表明使用 ISSR分子标记对亲缘
关系十分相近的种源进行研究有一定优势 。徐文斌
等 [ 13]用 RAPD法对 22种药用菊花进行过研究 ,发现
江苏射阳产菊花与杭菊的亲缘关系很近 ,但大部分
的药用菊花样品仅部分按地区聚类 ,多数单独聚成
一支 ,无法更准确地推断不同地区菊花品种(系)间
的亲缘关系 。本研究结果表明 ,利用 ISSR分子标记
进行分析 ,对不同产地各菊花品种(系)间亲缘关系
的阐明比 RAPD分析更加清楚。有研究表明 , ISSR
分子标记技术的分辨能力较 RAPD更高 ,能更好地
检测出种间的遗传差异性和种内的遗传相似性;尽
管这两种标记对于种内不同基因型个体间遗传差异
的区分趋势相近 ,但结果则不尽相同 [ 17] 。
3.3　对实验方法的讨论
与常用的分子标记方法(如 AFLP、SSR等)相
比 , ISSR分子标记不需要单独设计引物 ,实验成本较
低 ,技术也相对简单;与 RAPD分析方法相比 , ISSR
反应更为稳定 、结果更可靠 ,在遗传多样性研究中有
特殊的优势。但在实验过程中作者也发现 ,有些
ISSR引物反应不稳定 ,可能是由于 ISSR引物含有重
复序列 ,与它结合的基因组 DNA内靶序列在 DNA
复制过程中存在滑动和不均等现象 ,在不同品种或
个体之间的重复次数差异较大 ,易引起引物结合位
点和两结合位点间片段长度的差异 [ 18] 。因此 , ISSR
引物多数为重复序列加锚定碱基 ,以增加其特异性
和稳定性。但有学者认为 ,使用 3′锚定的引物将难
以观察到等位基因 ,使用 5′锚定引物又会降低其特
异性 [ 19] 。因此 ,合适的 ISSR引物需要经过大量的
实验和筛选 。另外 ,虽然 ISSR反应较 RAPD反应稳
定 ,但它对反应浓度尤其是模板浓度较为敏感 ,模板
浓度差异可导致扩增的条带数量发生较大变化 ,虽
然条带数量的变化可能是由于非特异条带的减少而
引起的 ,但模板质量或浓度的差别的确能使实验结
果产生较大差异 ,因此 , ISSR分子标记的最佳反应条
件需要一定时间的摸索。
参考文献:
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