全 文 ：收稿日期:2011-01-12; 修订日期:2011-05-22
基金项目:国家自然科学基金青年基金(No． 30701087) ;
成都医学院校基金(No． 09z036)
作者简介:钟世红(1980-) ，女(汉族) ，四川隆昌人，现任成都医学院药学
院讲师，博士学位，主要从事中药品种、质量与资源研究工作．
* 通讯作者简介:古 锐(1979-)，男(汉族)，四川自贡人，现任成都中医药
大学副研究员，博士学位，主要从事民族药可持续开发与利用研究工作．
红毛五加叶的高效液相色谱指纹图谱研究
钟世红1，卫莹芳2，古 锐2* ，杨 静1
(1．成都医学院药学院，四川 成都 610083; 2．成都中医药大学，四川 成都 611131)
摘要:目的 建立红毛五加叶的 HPLC指纹图谱。方法 迪马钻石 C18色谱柱;乙腈 － 0． 05%磷酸水溶液梯度洗脱系统，检
测波长:203 nm;柱温:25 ℃;流速:0． 8 ml·min －1。结果 对 18 批红毛五加叶指纹图谱进行评价，确定了 14 个共有峰，指
认了第 8 号色谱峰为绿原酸，其中第 13 号色谱峰为第 1 大色谱峰，根据光谱图推测，为咖啡酰类物质。结论 该研究可为
红毛五加叶质量控制提供参考。
关键词:红毛五加叶; 指纹图谱; 高效液相色谱; 绿原酸
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2011． 10． 041
中图分类号:R284． 1 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2011)10-2413-02
HPLC Fingerprint Study on the Leaf of Acanthopanax giraldii
ZHONG Shi-hong1，WEI Ying-fang2，GU Rui2* ，YANG Jing1
(1． Pharmacological School，Chengdu Medical College，Chengdu 610083 China;2． Chengdu University of TCM，
Chengdu 611131，China)
Abstract:Objective To establish the HPLC fingerprint of leaf of Acanthopanax giraldii． Methods Separation was performed on
Dikma Diamond － C18 chromatographic column，acetonitrile － 0． 05% phosphate as mobile phase with gradient elution． The detec-
tion wavelength was 203 nm，the column temperature was 25 ℃，the flow speed was 0． 8 ml·min －1 ． Results 18 batches of leaf of
Acanthopanax giraldii were evaluated and fourteen common chromatographic peaks were found out． The No． 8 peaks was identified
to be chlorogenic acid． Conclusion The study can afford scientific basis for quality control of leaf of Acanthopanax giraldii．
Key words:Leaf of Acanthopanax giraldii; Fingerprint; HPLC; Chlorogenic acid
红毛五加 Acanthopanax giraldii Harms为五加科五加属植物，
传统药用部位为茎皮，即红毛五加皮，为《四川省中药材标准》所
收载，主治风寒湿痹、足膝无力等证。由于市场需求持续增长、价
格攀升等因素影响，产地普遍存在无序、过度砍伐现象，药材产量
呈逐年下降趋势。为了缓解资源压力，有必要对红毛五加植株进
行综合开发利用。红毛五加叶目前已受到关注，具有进一步开发
成新药材的前景。如四川省阿坝州地区已推出了红毛五加叶保
健茶、饮料等系列产品。但是，关于红毛五加叶的研究甚少［1 ～ 4］。
本文采用 HPLC法建立了红毛五加叶的指纹图谱，利用中药材指
纹图谱整体性与模糊性的特点，对红毛五加叶进行质量评价，为
红毛五加叶的进一步开发利用提供参考。
1 仪器与试药
1． 1 仪器 高效液相色谱仪(Waters2695，美国) ，超声清洗器
(AS5150A 天津，功率:180W，频率:40 KHZ) ，电子天平(Sartorius
BS224S 北京)。
1． 2 样品与试药 样品采自阿坝州，经成都中医药大学卫莹芳教
授鉴定为红毛五加 Acanthopanax giraldii Harms 的干燥叶。见表
1。绿原酸(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号
110753 － 200413)。乙腈(色谱纯，Fisher) ，水为超纯水，其余试剂
均为分析纯。
2 方法与结果
2． 1 色谱条件 色谱柱为迪马钻石 C18色谱柱(4． 6 mm × 250
mm，5 μm) ;流动相 A为乙腈，流动相 B为 0． 05%磷酸水溶液，梯
度洗脱程序见表 2;检测波长 203 nm;柱温 25 ℃;流速:0． 8 ml·
min －1;记录 100 min色谱图;进样量 10 μl。
表 1 红毛五加叶样品来源
编号 样品来源 采集时间
1 茂县石大关乡阳雀寨 2007 － 07
2 茂县石大关乡阳雀寨 2008 － 07
3 茂县石大关乡小牛寨 2008 － 10
4 茂县石大关乡小牛寨 2008 － 10
5 茂县石大关乡阳雀寨 2008 － 10
6 小金县达维乡木尔寨沟 2007 － 05
7 小金县达维乡红军坪 2008 － 08
8 小金县达维乡红军坪 2008 － 08
9 小金县达维乡红军坪 2008 － 08
10 小金县达维乡木尔寨沟 2008 － 08
11 小金县日隆镇双桥沟 2008 － 08
12 小金县日隆镇双桥沟 2008 － 08
13 小金县科牛村香路堂沟 2008 － 08
14 小金县科牛村香路堂沟 2008 － 08
15 小金县科牛村小太子坡 2008 － 08
16 马尔康县梭磨乡坎竹沟 2008 － 08
17 红原县刷经寺镇 329 沟 2008 － 08
18 红原县刷经寺镇 2 队 2008 － 08
表 2 流动相梯度洗脱程序
时间 t /min A(乙腈) (%)
0 2
15 7． 5
20 10
35 12
45 20
55 17
60 19
80 30
100 30
2． 2 对照品溶液的制备 取绿原酸适量，精密称定，加 50%甲醇
配制成含绿原酸 0． 129 mg · ml －1的对照品溶液。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL ． 22 NO． 10 时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 10 期
2． 3 供试品溶液的制备 取红毛五加叶粉末(中粉)1． 0 g，精密
称定，精密加入 50%甲醇 40 ml，称定重量，回流提取 1． 0 h，放
冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，
即得。
2． 4 方法学考察
2． 4． 1 重复性实验 取本品粉末(中粉)1． 0 g，共 6 份，按“2． 3”
项下方法制备各供试品溶液，进样测定，各色谱峰的相对保留时
间和相对峰面积 RSD 值均小于 3%，经相似度软件处理，6 批样
品相似度均大于 0． 999，表明方法的重复性良好。
2． 4． 2 精密度实验 取同一份供试品溶液，连续进样 5 次，各色
谱峰的相对保留时间和相对峰面积 RSD值均小于 3%，经相似度
软件处理，相似度均大于 0． 999，表明方法的精密度良好。
2． 4． 3 稳定性实验 取同一份供试品溶液，分别在 0，2，4，8，12，
24 h进样测定，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积 RSD 值
均小于 3%;经相似度软件处理，相似度均大于 0． 999，表明供试
品溶液在 24 h内稳定。
2． 5 红毛五加叶指纹图谱的建立及分析
2． 5． 1 红毛五加叶指纹图谱及共有峰的标定 按上述确定的条
件，分别制备供试品溶液，各进样分析，采用“matlab 6． 5． 1 计算
机辅助相似度评价系统”软件，对 18 批红毛五加叶的指纹图谱进
行评价，生成对照指纹图谱。见图 1。
a，b －红毛五加叶 HPLC指纹图谱 c －绿原酸对照品色谱图
图 1 红毛五加叶的指纹图谱
共确定了 14 个共有色谱峰，8、13 号色谱峰为两个主要色谱
峰。经与对照品色谱图相对照，结合二级管阵列检测器对色谱峰
的光谱图进行分析，确认了红毛五加叶指纹图谱中的第 8 号色谱
峰为绿原酸，其中第 13 号色谱峰为红毛五加叶指纹图谱中的第
1 大色谱峰，波谱特征显示其为一种咖啡酰类化合物。
2． 5． 2 红毛五加叶样品指纹图谱分析 分别计算 18 批不同来源
样品的相似度;各样品 14 个共有峰与总峰面积百分比;绿原酸(8
号色谱峰)与总峰面积百分比。见表 3。
由相似度计算结果可知，样品的相似度不高，推测不同生态
环境对叶成分积累影响较大。统计 14 个共有峰与总峰面积的比
值，最低为 21． 30%，最高达 87． 63%，平均为 49． 83%。统计绿原
酸与总峰面积的比值，其中 10 个样品的绿原酸面积百分比大于
10%，最低为 2． 16%，最高达 35． 81%，平均为 11． 96%。
表 3 样品相似度、共有峰与总峰面积百分比、绿原酸与总峰面积百分比
样品
编号
相似
度
共有峰 /
总峰面积(%)
绿原酸 /
总峰面积(%)
样品
编号
相似
度
共有峰 /
总峰面积(%)
绿原酸 /
总峰面积(%)
1 0． 84 49． 32 15． 64 10 0． 73 52． 87 3． 17
2 0． 62 45． 29 16． 38 11 0． 80 47． 24 13． 81
3 0． 78 37． 63 8． 42 12 0． 61 21． 30 5． 47
4 0． 77 48． 06 10． 60 13 0． 89 31． 74 2． 64
5 0． 49 34． 80 9． 63 14 0． 76 38． 59 11． 00
6 0． 89 57． 06 21． 94 15 0． 79 79． 83 35． 81
7 0． 86 51． 33 5． 01 16 0． 81 52． 92 11． 88
8 0． 75 39． 71 2． 16 17 0． 75 87． 63 24． 24
9 0． 70 57． 23 2． 48 18 0． 95 64． 31 14． 94
2． 5． 3 不同产地的红毛五加叶指纹图谱的主成分分析 对 18 批
样品进行主成分分析。结果见图 2。
图 2 红毛五加叶样品主成份投影图
由图 4 可知，15 号样品的投影远离其它样品投影，推测是由
于该样品的第 13 号色谱峰显著高于其它样品。其中 9、16、13、17
号样品的投影为离群样品，推测是由于以上样品的第 8 号色谱峰
(即绿原酸)面积大于其它样品。
2． 5． 4 红毛五加叶和茎皮的指纹图谱比较分析 选择来源于同
一植株的红毛五加叶和茎皮样品，在茎皮指纹图谱的相同条件下
(乙睛 － 0． 3%磷酸二氢钠水溶液梯度洗脱) ，同法制备叶的供试
品溶液进行测试分析，并比较二者图谱。见图 3。
a －红毛五加茎皮 b －红毛五加叶 箭头所示为绿原酸
图 3 红毛五加叶和茎皮指纹图谱比较
由图 3 比较可知，二者的色谱峰差异较大。经已知对照品色
谱图比较和色谱峰的光谱特征分析，确认了二者的共有峰为绿原
酸，且均为二者指纹图谱中的主要色谱峰。
3 讨论
色谱条件的选择 分别比较了磷酸水溶液、磷酸二氢钠水溶
液、醋酸水溶液与乙腈或甲醇的二元梯度洗脱系统，最终确定采
用 A:乙腈 － B:0． 05%硫酸水溶液系统作为流动相，色谱峰数目
较多且峰形较好。分别考察了 Hypersil ODS2 C18柱(4． 6 mm ×
250 mm，5 μm)、迪马钻石 C18柱(4． 6 mm × 250 mm，5 μm)及 A-
POLLO C18柱(4． 6 mm × 250 mm，5 μm) ，3 种色谱柱均能分离样
品，其中以迪马钻石 C18柱色谱峰较多，分离度好，遂选择该柱用
作红毛五加叶指纹图谱分析。使用 DAD检测器进行 200 ～ 400
nm波段扫描，综合考虑色谱峰的数目、高度，及紫外吸收效应，选
择 203 nm为最佳测定波长。
红毛五加叶指纹图谱分析 对采自阿坝州 4 县 6 乡镇的 18
批红毛五加叶样品进行了 HPLC指纹图谱分析。确定了 14 个共
有色谱峰。根据各色谱峰的波谱特征，结合文献报道可知，该指
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时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 10 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL． 22 NO． 10
纹图谱中主要成分为以绿原酸为代表的咖啡酰类成分。18 批样
品的相似度不高，推测不同生态环境对叶成分积累影响较大。统
计 14 个共有峰与总峰面积的比值，平均为 49． 83%;绿原酸与总
峰面积的比值平均为 11． 96%。
红毛五加叶与茎皮指纹图谱比较分析 来源于同一植株的红
毛五加叶与茎皮指纹图谱比较可知，二者的成分差异较大。绿原
酸均为二者的主要成分之一，叶中绿原酸含量普遍高于茎皮;茎
皮的主要成分刺五加苷 E 在叶中含量极低或无;叶中不含刺五
加苷 B，该成分在茎皮中存在，但含量较低。
本研究建立了红毛五加叶的指纹图谱，能有效反映红毛五加
叶的化学特征，可为其进一步开发利用提供依据。
参考文献:
［1］ 程东亮，邵 宇，杨 立． 红毛五加叶的三萜皂苷［J］． 植物学报，
1994，36(1) :75．
［2］ 张莅峡，刘 泓． 红毛五加茎皮、叶及果实挥发油的 GC － MS比较
分析［J］．中国中医基础医学杂志，2001，7(5) :24．
［3］ 李 莹，袁 玮，刘 超，等． 反相高效液相色谱法测定藏药材红
毛五加中金丝桃苷的含量［J］．时珍国医国药，2009，20(7) :1617．
［4］ 钟世红，卫莹芳，古 锐，等．红毛五加叶中常春藤皂苷元的高效液
相色谱法测定［J］．时珍国医国药，2010，21(1) :6．
收稿日期:2011-01-13; 修订日期:2011-06-28
基金项目:国家自然科学基金(No． 30973960)
作者简介:楼彩霞(1983-) ，女(汉族) ，浙江义乌人，现为中央民族大学中
国少数民族传统医学研究院在读博士研究生，硕士学位，主要从事中药和
民族药药理学研究工作．
* 通讯作者简介:朴香兰(1965-) ，女(朝鲜族) ，吉林图们人，现任中国民
族大学中国少数民族传统医学研究院副研究员，博士研究生导师，博士学
位，主要从事民族药物开发和应用研究工作．
连翘不同极性部位对酪氨酸酶活性抑制作用研究
楼彩霞，田燕泽，朴香兰*
(中央民族大学 中国少数民族传统医学研究院，北京 100081)
摘要:目的 研究连翘对酪氨酸酶活性的抑制作用。方法 将连翘用 80%的乙醇水溶液回流提取，得到总提取物，再用不
同极性的有机溶剂石油醚、二氯甲烷、正丁醇进一步萃取，得到不同极性部位。将总提取物和各部位浸膏溶于不同体积
的溶剂，以 L －酪氨酸为底物，加入酪氨酸酶，使终浓度为 1． 0，0． 5，0． 2，0． 1，0． 04 mg·ml －1，测定药物干预前后反应体系
在 475 nm波长处吸光度值变化，计算各组分对酪氨酸酶活性的抑制率。结果 在各组分中，连翘的二氯甲烷部位对酪氨
酸酶活性的抑制率最高，当终浓度为 1． 0 mg·ml －1时，抑制率为 57． 3%，抑制率随着浓度的增加而升高，其 IC50为 0． 57
mg·ml －1;其他组分也均有不同程度的抑制作用，其中正丁醇部位、水溶部位和总提取物随浓度的增加具有双向调节作
用。结论 连翘具有较好的抑制酪氨酸酶活性的作用，可以抑制黑色素的形成。此实验为进一步研究连翘中酪氨酸酶活
性抑制成分及其作用机理提供基础。
关键词:连翘; 极性部位; 酪氨酸酶抑制
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2011． 10． 042
中图分类号:R284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2011)10-2415-02
Inhibitory Effect of Different Polar Extracts from Forsythia suspensa on Tyrosinase Activity
LOU Cai-xia，TIAN Yan-ze，PIAO Xiang-lan*
(Institute of China Minority Traditional Medicine，Minzu University of China，Beijing，100081，China)
Abstract:Objective To study the inhibitory effect of Forsythia suspensa on tyrosinase activity．Methods The fruits of Forsythia
suspensa were refluxing with 80% ethanol to yield the ethanol extract of Forsythia suspensa． The ethanol extracts was then sus-
pensed with water，and fractionationed with petroleum ether，methylene chloride，and normal butanol． These fractions and the etha-
nol extract of Forsythia suspensa were measured tyrosinase inhibitory effect at concentration of 1． 0，0． 5，0． 2，0． 1 and 0． 04 mg·
ml －1 at 475 nm． Results The methylene chloride fraction of Forsythia suspensa showed the strongest tyrosinase inhibitory effect
with the inhibition of 57． 3% at 1． 0 mg·ml －1 ． The IC50 value of the methylene chloride fraction of Forsythia suspensa was 0． 57
mg·ml －1 ． The other fractions also showed inhibitory effect on tyrosinase activity． The ethanol extract and normal butanol，water
fractions showed diphase regulation function with increasing concentration． Conclusion Forsythia suspensa has tyrosinase inhibitory
activity，blocking the formation of melanin． The test will provide experimental evidence for further research on the effective of the
constituents from Forsythia suspensa and their mechanism of tyrosinase inhibitory effect．
Key words:Forsythia suspensa; Different polar extracts; Tyrosinase inhibitory effect
酪氨酸酶(TYR)作为生物体黑色素合成的限速酶，是有多个
基因位点编码产物的酪氨酸酶基因家族共同组成的含铜多功能
糖蛋白，含有不同催化活性的酶，如酪氨酸羟化酶、多巴氧化酶和
5，6 －二羟基吲哚氧化酶等组成的多酶复合体。酪氨酸酶在黑色
素合成的多个阶段起调控作用，对其调节可直接影响黑色素的合
成。酪氨酸酶活性的大小，关系到生成黑色素的量与质［1］。
连翘为木犀科(Oleaceae)连翘属植物连翘 Forsythia suspensa
(Thunb．)Vah1．的干燥果实，主要具有清热解毒，消肿散结的功效，
常用于治疗急性风热感冒、痈肿疮毒、淋巴结结核、尿路感染等症。
本课题组在研究连翘的过程中，发现其除了上述功效外，还具有抑
制酪氨酸酶活性的作用。目前，国内针对连翘抑制酪氨酸酶活性
作用的相关研究甚少，是一个尚待深入研究的课题。本实验从连
翘不同极性的萃取部位着手，研究其抑制酪氨酸酶活性的作用效
果及程度。作为一个前期的活性筛选实验，也为今后深入研究连
翘中抑制酪氨酸酶活性的有效成分及作用机理提供方向。
1 材料与仪器
连翘(长白山地区采集，由延边大学农学院鞠玉琳教授鉴
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL ． 22 NO． 10 时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 10 期