全 文 ：·论著·
裂褶菌培养基形态学观察和 DNA序列分析
万力 1　任强强 1　王启明 2　林元珠 1　白逢彦 2
(1.河北医科大学第四医院皮肤科 ,石家庄 050011;2.中国医学科学院微生物研究所 ,北京 100101)
【摘要】　目的　通过观察裂褶菌在 5种培养基上的生长状态 、扫描电镜及 DNA序列分析 ,了解该菌形态学及分子生物学
等方面的特征。方法　菌落转种于沙氏培养基 (SDA), 麦芽浸膏琼脂 (MEA), 马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA), 玉米粉琼脂
(CMA)和察氏琼脂 (CZA)平皿培养基 , 27℃和 37℃培养 2周 ,观察菌落生长情况 ,进行扫描电镜检测及 DNA序列分析。结
果　菌落在 SDA, MEA和 PDA上生长状态较好 ,呈蓬松白色羊毛状;尿素酶试验阳性 , 放线菌酮耐受试验阴性。光镜下见
分支分隔菌丝 、侧生的钉状突起及类水母体变异子实体。扫描电镜见菌丝分隔处闭锁联合 、侧生钉状突起和泪滴状球形分
泌物。经 26SrDNAD1/D2区序列分析证实该菌株为裂褶菌。结论　裂褶菌只有丝状型一种菌落形态;分支分隔菌丝及分
隔处闭锁联合 ,侧生钉状突起和泪滴状球形分泌为其形态学特征;孢子由类水母状子实体产生。
【关键词】　裂褶菌;形态学;分子生物学;扫描电镜
【中图分类号】　R379.9　　【文献标识码】　A　　【文章编号】　1673-3827(2010)06-0327-05
MorphologyandsequenceDNAanalysisofSchizophylumcommune
WANLi1　RENQiang-qiang1　WANGQi-ming2　LINYnan-zhu1　BAIFeng-yan2
(1.DepartermentofDermatology, ThefourthAffiliatalHospitalofHebeiMedicalUniversity, Shijiazhuang050011;2.China
InstituteofMicrobiologyinAcademiaSinica, Beijing100101)
【Abstract】　Objective　ToobservemorphologicalcharacteristicsofSchizophylumcommuneonfivekindofculturemedia.Meth-
ods　 SchizophyllumcommunewasculturedonSabouraudsAgar(SDA), MaltExtractAgar(MEA), PatatoGlucoseAgar(PDA),
CornMealAgar(CMA)andCzapeksAgar(CZA)respectivelyat37℃ and27℃ fortwoweeks.Scanningelectronmicroscopyand
DNAsequenceanalysiswereperformedafterone-weekculture.Results　WhiteandwoolycoloniesgrowedbeteronSDA, MEAand
PDAwithpositiveresultofureasetestandregativeresultofcycloheximidetolerancetest.Septatusmyceliumwithbrancheswere
foundunderlightmicroscope, andbranchedhyphaewithclampconnections, shortandcurvedlateralpegsandwaterdrop-shapeex-
cretionweredetectedunderscanningelectronmicroscope.Schizophyllumcommunewasidentifiedbysequenceanalysisof26SrDNA
D1/D2.Conclusions　Schizophyllumcommunehadanuniquecolonialmorphologyofhyphomycetewithcharacteristicclampcon-
nections, shortlateralspiculesandwaterdrop-likeexcretion.
【Keywords】　Schizophyllumcommune;morphology;molecularbiology;scanningelectronmicroscope
[ ChinJMycol, 2010, 5(6):327-331]
　　裂褶菌 (Schizophylumcommune)多寄生于
腐木上 ,广泛分布于世界各地 ,是林木常见的致病
性真菌。在致人类疾病方面 ,临床多见吸入其孢子
引起的过敏反应 ,但由该菌引起人体深部组织感染
的病例较为罕见 。我们通过观察该菌在 5种培养
基上的生长状况 、光镜和扫描电镜下的形态特征 ,
并进行 DNA序列分析 ,了解该菌在形态学 、产孢方
作者简介:万力 ,女 (汉族),硕士 ,教授 , 主任医师 , 硕士研究生导
师.E-mail:LiWan@medmail.com.cn
式和分子生物学等方面的特征。
1　材料与方法
1.1　材料
受试菌株　分离自我科门诊的 1例冠状动脉
搭桥术后患者的痰液 ,于 -80℃冰箱冻存。
形态学观察培养基 　沙氏琼脂培养基
(SDA)、麦芽浸膏琼脂培养基 (MEA)、马铃薯葡萄
糖琼脂培养基 (PDA)、玉米粉琼脂培养基
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(CMA)[ 1] 。察氏琼脂培养基 (CZA)采用北京三药
科技开发公司的成品试剂。
生理学实验培养基 　尿素酶培养基 (Urea
Agar)[ 1] ;含放线菌酮沙氏培养基采用法国生物梅
里埃公司 (BioMérieux)的成品试剂 。
1.2　方法
培养基形态观察　菌种复苏与平皿培养:菌株
置常温下复苏 , 3 d后分别转种于 5种培养基 ,各
12个平皿 ,分别置于 27℃和 37℃温箱培养 2周 ,观
察菌落的生长情况 、测量菌落直径并绘制生长曲
线。小培养 (方块法):将受试菌株分别点种于 5
种培养基琼脂块四边中点上 , 27℃和 37℃恒温培
养 2周 ,光镜下观察菌丝生长及孢子产生情况。
生理学实验　分别进行尿素酶和放线菌酮耐
受试验。
扫描电镜下观察　取 27℃和 37℃两个温度
培养 1周生长良好的菌落标本置于 4%的戊二醛
液中固定 ,常规制片后在日立 S-3500N扫描电镜
下观察 。
DNA序列分析 　挑取生长良好的菌丝 ,经
DNA微量提取 (CTAB法),用引物:NL1 (5-GCA
TATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3), NL4 (5-
GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3)扩增 26SrDNA
D1/D2区域 , 用 DNA自动测序仪 (ABIPRISM
3700 GeneticAnalyzer)得到菌株 PCR扩增片段的
原始序列 ,在 GenBank核酸序列数据库中进行同源
序列搜索 (BLASTsearch)。实验菌株 26SrDNA
D1/D2区序列分析结果如下。
ACTCACACTTATGCAGCATCCTAAGCACGAACGTG
GACGAATCCCGGCCTTGCGGCGTGCTGAGTTCCTC
AGTCCCAACCGCAGCATATGACAGGAGGCTATAA
CACACCCGAAGGTGCCACATTCCTCCAGCCTTTCA
ACTGCGGTCAAAACTGATGCTGACCCATCCACCGG
GAAATACGCCAAGCAAAAGCAAGGTTGATCCCCG
GCGGACGCGACTGACTGCAACCGTTTCCCTTTCGA
CAATTTCACGTACTGTTTAACTCTCTTTCCAAAGTT
CTTTTCATCTTTCCCTCACGGTACTTGTTCGCTATC
GGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGCATTTA
CCACCCATTTTGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGA
CTCGTCGAGAGCGCATCACAATGCACTGGTAGTCC
GTGTCAAAGACGGGATTCTCACCCTCTATGACGCT
CCATTCCAGGAGACTTATACACGGTCCAGCACGGA
TAACGCTTCTCTAAATTACAACTCGGACGGCCGGA
GACCGCCAGATTTTAAATTTGAGCTTTTCCCGCTTC
ACTCGCAGTTACTAGGGGAATCCTTGTTAGTTTCTT
TTCCTCCGCTTTTGGATATGCA
SPSS16.0统计软件处理实验数据　在同种培
养基上不同温度生长第 1、7、14天比较菌落直径 ,
用两样本 t检验 (Independent-SampleTtest);同种
温度下不同培养基生长第 1、7、14天菌落直径比
较 ,用单因素方差分析 (One-wayANOVA)。
2　结　　果
2.1　菌落大体形态
SDA　菌落呈蓬松白色羊毛状 ,中央形成同心
状环纹区 ,菌丝浓密厚重 ,堆积高出于培养基表面 ,
不向培养基内部生长 (见图 1)。培养基背面初为
白色 ,其后变为淡黄色。
MEA　菌落大体形态基本同 SDA。培养基背
面亦为淡黄色 。
PDA　菌落亦呈羊毛状。生长略缓慢 ,亦见同
心状环纹区 ,但不及 SDA和 MEA明显。
CMA　菌落呈环状 ,中央区菌丝稀疏周边菌丝
较为浓密 ,培养基背面始终为白色 。
CZA　菌落生长较差 ,菌丝稀疏 。未见同心状
环纹区 ,培养基背面始终为白色 (见图 2)。
2.2　生长曲线
菌落于 5种培养基上第 1周生长较快 ,此阶段
生长速度与时间呈正比 ,两种温度下 5种培养基
上 , 37℃均较 27℃生长快。
2.3　菌落直径
在同种温度不同培养基上生长第 1、7、14天菌
落直径比较无显著性差异 (P>0.05,见表 1、2);
菌落在两种温度同种培养基上生长 ,除第 3天直径
比较无显著性差异 (P>0.05),第 7、14天直径比
较均有显著性差异 (P<0.05,见表 3)。
2.4　小培养光镜下形态
SDA、MEA和 PDA上菌丝生长状况较好 ,结构
直径差别较大且分支分隔明显 ,菌丝表面可见侧生
的钉状突起 (见图 3)。 SDA上菌丝生长状况最
佳 ,且可见类水母体变异体 (见图 4),大小差别较
大 ,破裂后可释出大量孢子;孢子散在呈长圆形 ,大
小不一。 CMA和 CZA上菌落生长较差 ,菌丝稀疏
且纤细 ,未见子实体及孢子产生。
2.5　扫描电镜观察
菌丝结构差别较大 ,直径约 1.5 ～ 6 μm,分隔
·328· 　中国真菌学杂志 2010年 12月 第 5卷 第 6期　ChinJMycol, December2010, Vol5, No.6　
处产生闭锁联合 (见图 5),菌丝表面可见短且弯
曲的侧生钉状突起和泪滴状球形分泌物 (见图
6),未见子实体及孢子结构。
2.6　生理学实验
尿素酶试验为阳性;放线菌酮耐受试验为
阴性 。
图 1　SDA培养基上菌落呈白色羊毛状 ,中央形成同心圆环纹区　图 2　CZA培养基上菌落生长状况不佳 ,菌丝稀疏 ,未见同心圆环纹区　
图 3　透明的分枝分隔菌丝 ,菌丝表面可见钉状体 (酚棉兰染色 , ×400)　图 4　类水母体变异体 (酚棉兰染色 , ×100)　图 5　分隔处产生
闭锁联合 ,在菌丝表面上可见短且弯曲的侧生钉状突起　图 6　菌丝表面的侧生钉状突起和泪滴状分泌物
Fig.1　ColonyonSDA:anteriorviewofwhite, woolycolony, formingconcentriczonesinthecenterofthecolonies　Fig.2　ColonyonCZA:sparse
hyphaewithoutconcentriczones　Fig.3　Clearseptatehyphaewithclampconnectionsandcurvedlateralspicules(×400)　Fig.4　Medusoidfruit
body(×100)　Fig.5　Septatehyphae, withclampconnectionsandshort, curvedlateralspicules(SEM, ×4 000)　Fig.6　Branchedseptate
hyphae, withcurvedspiculesandwaterdrop-shapeexcretion(SEM, ×2 500)
2.7　DNA序列分析
基于 26SrDNAD1 /D2区序列分析的系统发
育树 ,结果显示受试菌株与数据库中 Schizophylum
commune具有 100%同源性 。
3　讨　　论
裂褶菌 (Schizophylumcommune)属担子菌
亚门 ,层菌纲 ,伞菌目 ,裂褶菌科 ,裂褶菌属 [ 2] ,多寄
生于阔叶树及针叶树腐木上 ,是一种食药兼用的真
菌 ,国内外有关该菌的研究主要集中在其生物学特
性 、食用和药用价值 、人工栽培驯化和多糖结构分
析等领域 [ 3] 。1950年 Kligman从甲癣患者中分离
出该菌 ,此后世界各地陆续有该菌致病的报道 。本
研究中受试菌株分离自 1例接受冠状动脉搭桥术
后肺部感染患者的痰液 , 3次不同时间采集标本进
行培养 ,均分离出该菌。
形态学鉴定仍是目前菌种鉴定最主要的方法 。
菌种在不同的培养基上 ,或同一种培养基但温度条
件不同 ,也会形成不同的菌落形态 。本实验中 ,裂
褶菌在 5种培养基上生长状态的差异 ,可能与各种
培养基中所含的营养成分不同有关 。很多培养基
碳源由葡萄糖提供 ,几乎所有的真菌都可以利用这
种碳源;氮源主要是由硝酸盐 、亚硝酸盐 、氨 、尿素 、
氨基酸和其他化合物提供。其他成分如纤维素 、矿
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表 1　27℃条件下在 5种培养基上生长第 3、7、14天菌落直径比较 (cm)
Tab.1　Colonydiameterondiferentmediumat27℃onthethirdday, theseventhdayandthefourteenday(cm)
组别
第 3天菌落直径 第 7天菌落直径 第 14天菌落直径
例数 平均直径 例数 平均直径 例数 平均直径
SDA 6 0.41±0.14 6 4.05±0.46 6 5.66±0.49
MEA 6 0.39±0.16 6 3.77±0.26 6 5.50±0.39
PDA 6 0.31±0.16 6 3.50±0.33 6 4.77±0.37
CMA 6 0.40±0.09 6 3.45±0.40 6 5.40±0.50
CZA 6 0.37±0.07 6 3.80±0.66 6 5.70±0.59
F 0.62 F 1.99 F 4.24
P 0.65 P 0.13 P 0.09
　　　Notes:comparisonbetweenrandomtwomedia(P>0.05)
表 2　37℃条件下在 5种培养基上生长第 3、7、14天菌落直径比较 (cm)
Tab.2　Colonydiameterondiferentmediumat37℃ onthethirdday, theseventhdayandthefourteenday(cm)
组别
第 3天菌落直径 第 7天菌落直径 第 14天菌落直径
例数 平均直径 例数 平均直径 例数 平均直径
SDA 6 0.48±0.12 6 6.42±0.63 6 8.90±0.02
MEA 6 0.33±0.11 6 6.25±0.57 6 8.40±0.45
PDA 6 0.36±0.05 6 5.43±0.44 6 8.17±0.20
CMA 6 0.39±0.15 6 6.28±0.40 6 8.38±0.30
CZA 6 0.40±0.09 6 6.48±0.48 6 8.70±0.59
F 1.87 F 4.54 F 2.34
P 0.15 P 0.07 P 0.08
　　　Notes:comparisonbetweenrandomtwomedia(P>0.05)
表 3　27℃和 37℃条件下 , 在同种培养基上生长第 1、7、 14天菌落直径比较 (cm)
Tab.3　Colonydiameteronthesamemediumat27℃and37℃ onthethird, seventhandfourteenday(cm)
组别 例数
第 3天菌落直径
27℃ 37℃
t P
第 3天菌落直径
27℃ 37℃
t P
第 3天菌落直径
27℃ 37℃
t P
SDA 6 0.42 0.48 -1.03 0.33 4.05 6.42 -7.80 0.00 5.63 8.90 -9.63 0.00
MEA 6 0.39 0.33 0.88 0.40 3.77 6.25 -10.11 0.00 5.50 8.40 -12.63 0.00
PDA 6 0.31 0.36 -0.79 0.45 3.50 5.43 -8.97 0.00 4.77 8.77 -21.00 0.00
CMA 6 0.40 0.39 0.12 0.91 3.45 6.28 -12.83 0.00 5.40 8.38 -13.22 0.00
CZA 6 0.30 0.40 -2.21 0.05 3.80 6.48 -8.47 0.00 5.70 8.70 -9.30 0.00
·330· 　中国真菌学杂志 2010年 12月 第 5卷 第 6期　ChinJMycol, December2010, Vol5, No.6　
物质 、氨基酸 、维生素等在培养基中的蛋白胨中已
含有 [ 4] 。文献报道裂褶菌菌丝生长的最适碳 、氮源
分别为葡萄糖和蛋白胨 ,不同 C/N比对裂褶菌菌
丝生长有明显影响 ,在 10︰ 1 ～ 100︰ 1范围内均
可生长 ,其中最佳 C/N比为 40︰ 1,研究发现裂褶
菌利用单糖的能力要高于双糖和多糖 [ 5] ;有机氮作
为氮源的裂褶菌菌丝生长明显优于无机氮源 [ 6] 。
SDA培养基中富含葡萄糖和蛋白胨 ,因此裂褶菌在
SDA上生长状况最佳 。MEA培养基属于天然培养
基 ,营养成分比较全面 ,含有多种糖类 (葡萄糖 、蔗
糖和麦芽糖等);PDA培养基亦属天然培养基 ,主
要含有较多的淀粉和多种糖类[ 7] ,故该菌在此两种
培养基上亦可较好的生长 。 CMA培养基中糖类和
蛋白胨含量均较低;CZA的主要成分为多种无机
盐 ,以蔗糖为主要碳源 ,且两者缺乏必要有机氮源 。
以上结果表明:裂褶菌对培养基中营养成分要求较
高 ,培养基中碳 、氮的来源不同及其比例的差异对
裂褶菌生长均有较明显影响;该菌利用无机盐的能
力可能较差。本研究裂褶菌的放线菌酮耐受试验
为阴性 ,表明放线菌酮可抑制其生长;尿素酶试验
呈阳性。
扫描电镜在观察真菌细胞表面微细结构方面
起着不可替代的作用 ,本实验扫描电镜发现:裂褶
菌菌丝直径结构差别较大 ,分隔处具有闭锁联合 、
弯曲的侧生钉状突起及泪滴状球形分泌等特征性
表现 ,以上结构特点与文献报道相同 ,但未发现孢
子及子实体等结构 。
近年来分子生物学在病原真菌学研究领域的
十分活跃 ,广泛应用于病原真菌的分型 、鉴定和亲
缘关系研究 ,揭示种内不同菌株间的细微差异 ,从
而弥补了表型分型的不足 。本实验通过对受试菌
株大亚基 rRNA基因 (26SrDNA)中 D1 /D2区域
的碱基序列分析及其系统发育树亲缘关系的分
析 ,证实此菌株为裂褶菌 。目前该方法多处于实
验室研究阶段 ,尚不能完全代替传统的真菌镜检
和培养 ,形态学鉴定仍然是分类 、分型的基础 。因
此将形态学与分子生物学鉴定相结合 ,可使真菌
鉴定更加准确。
培养观察过程中 ,该分离菌株仅在 37℃条件
下 SDA培养基上见类水母体变异体及孢子产生 ,
但均未见担子菌典型的有性繁殖结构--担孢子的
产生 。裂褶菌是植物常见的腐生菌 ,在自然界中生
长的最适温度为 22 ～ 25℃,子实体形成温度为 14
～ 20℃,孢子萌发最适温度为 21 ～ 26℃[ 8] ,主要以
有性繁殖方式进行增殖 。而本实验受试菌株在 5
种培养基上 37℃条件下生长状态均较 27℃为好 ,
文献报道 [ 9]大多数条件致病性真菌不能在 37℃生
长 ,能够使之在这个温度下生存的耐热特性对于真
菌在人体内生长变得尤为重要。因此最适生长条
件及增殖方式的变化亦可能是由于生存微环境改
变使裂褶菌细胞内调控增殖的基因表达改变所致 ,
这种改变可能使其获得对人体侵袭性的基本条件
之一 。这说明裂褶菌增殖形式的多样性及菌丝发
育的复杂性 ,对不同生长条件下裂褶菌的形态和产
孢方式的了解 ,有助于临床上对裂褶菌感染的鉴
定 ,也为进一步的生理 、生化 、营养 、免疫学和分子
生物学等方面的鉴定工作提供了实验室依据。
参 考 文 献
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[收稿日期 ] 　2010-08-12
[本文编辑 ] 　卫凤莲
·331·　中国真菌学杂志 2010年 12月 第 5卷 第 6期　ChinJMycol, December2010, Vol5, No.6