全 文 ：团笼砚忍普
裂褶菌胞外多糖的粘度性质及其构象研究
周 林 郭祀远 蔡妙颜 李 琳
(华南理工大学轻工食品学院 , 广州 , 5 1 0 6 40)
摘 要 采用高效凝胶渗透色谱 (G P C )测定 了裂褶 菌胞 外多糖 ( S P G ) 的分 子量 ;借 助乌 氏粘度计和旋转粘度计
研究了温度 、 pH 、 变性剂 (脉 )和金属离子 ( N a 十 、 K 十 、 M犷十 、 aCz + )对裂褶多糖溶液粘度的影响 ; 采用 刚果红染色
法分 析 了 N a 0 H 和盐的浓度对 SP G 构象的影响 。 研究表明 , 所分离的裂褶多糖的重均分子 量 ( M w )和数均分
子量 ( M n) 分别 为 2 . 5 x l0 7 u 和 1 . 2 义 1 0、 , 特性粘数为 6 25 . 29 m L 心。 质 量浓度为 0 . 01 0 % 的 SP G 表 现为牛顿
流体 , 大于此浓度则表现为非牛顿流体 。 随着温度的升高 ( 20 一 7 0℃ ) , 其相对粘度 逐渐降低 。 0 . 1 一 0 . 3 m ol 屯
H CI 和 0 . 1 m ol 态 N aO H 的加入使其粘度有所增加 , 随着酸和碱 浓度的增加 , SP G 溶液粘度逐渐降低 。 但加入 不
同浓度的 H O , 其粘度均大于对照 值 ; 而浓度 大于 0 . 5 m ol 乙 的 N a O H 则会使其粘度降低至对照值以下 。 不同浓
度的金属离子 的加入可使 s P G 溶液的粘度增加 ,但 M扩十 、 c扩十 比 N a 十 、 K + 对 S P G 粘度的影响较大 。 0 . 1一 0 . 7
om l 龙 脉使其粘度有所增加 。 刚果红实验表明 , N a 0 H 可 以使 S P G 的三 螺旋结构解体 , 而不 同浓度的 N a 十 、 K +
都可 以稳定 其构象 , 其中 K 千 更为显著 。
关键 词 裂褶 多搪 , 粘度 ,构象
裂褶菌胞外 多糖 ( S e h ioz p h y l la n , S P G )是 由裂褶
菌真菌发酵产生的一种 中性的胞外 多糖 , 具有 各(1 -
6) 葡萄糖昔分支的 各(1 一 3) 一 D 葡聚糖结构 ,其中主链
上每隔 3 个葡萄糖单元产生 1 个分支 。 它具有 良好
的抗肿瘤活性 , 还可用于食 品工业 、 日化工业等「’ 〕 。
其粘度性质和构象变化规律对于指导生产和应用研
究都十分重要 。 T ak as ih 和 P en g 等研究 了裂褶多糖
在 N aO H 和 D MOS 溶液中的粘度变化 , 主要探讨了
其构象变化规律 2[, 3〕。 本研究则主要考虑 了其在食
品和 日化工业 中的应用前景 , 对裂褶多糖 的特性粘
数 、 分子量以及引起裂褶多糖溶液粘度变化 的因素 ,
如温度 、酸 、碱 、盐 、变性剂等进行研究 , 为进一步开发
裂褶多糖的应用提供实验依据 。
材料与方法
1
.
1 材料与设备
裂褶多糖的分离纯化 ,参考文献 〔4 」的方法 。 刚
果红 ( A R )购自美 国 iS g m a 一川击ihc 公司 , 其余试剂均
为国产分析纯 。
U V 2 1 02 P C 紫 外可见 分光光 度计 , 尤尼 柯 (上
海 )仪器有限公 司 ; B or k f i e ld D i g i t a l V i s e o m e t e r D V -
I 旋转粘度计 (转子 50 0 转筒 U L八 ) , 美 国 B r o k -
f i e l d 公 司 ; W a t e r s 高效 凝胶 渗 透 色谱 (W a t e r S 7 1 7
p l u s a u t o s a m p l e r
,
W a t e r s 1 5 2 5 B i n a r y 泵 , W a t e r s 2 4 1 4
第一作者 :博士研究生 。
收稿 日期 : 2 0 0 5 一 07 一 0 7
示差折光检测器 ) ; H Q 45 B 气 浴恒温摇床 , 中科 院武
汉科学仪器 厂 ; 5 01 型超级恒温器 , 上海实验仪器厂
有限公司 。
1
.
2 实验方法
1
·
2
.
1 特性粘数的刚定 5[]
准确称取 75 m g 经 冷冻干燥 的 S P G , 充分溶解
后用蒸馏水定容至 25 m L , 玻璃沙芯漏斗过滤后用硫
酸 一苯酚法精确测定其浓 度 。 取 10 m L S P G 水溶液
加入乌氏粘度计于 25 ℃恒温水槽中测定 S P G 溶液的
流出时间 ,采用逐步稀释法求出样品的特性粘数 。
1
.
2
.
2 相对粘度和表观粘度的测定
相对粘度的测定采用乌氏粘度计 , 用秒表分别测
定溶剂和溶液的流出时间 ,计算其 比值 ,得到特定温
度下的相对粘度 ;表观粘度 的测定采用 Br o kf iel d 旋
转粘度计 ,在 25 m L 的三角瓶中加人 10 m L 0 . 09 7 %
的 S P G 溶液 , 以及 6 m L 浓度分别为 0 . 1 、 0 . 3 、 0 . 5 、
0
.
7 m o l几 的 酸 、 碱 、 盐 、 脉 溶 液 ( H C I 、 N a O H 、 K C I
等 ) , 对照则加人 6 m L 蒸馏水 。 置于 2 5℃ , 8 0 r m/ i n
的摇床上振荡 20 m in , 然后倒人带夹套的 U L厅 转
筒 (超级恒温 器 25 ℃恒 温 ) ,设 定不同的转 速 , 3 m in
后待读数稳定读出其粘度值并计算相应剪切速率 。
1
.
2
.
3 G P C 法测 定分子量
T S K G 5 0 0 0 P W
x一+ G 3 0 0 0 Pw 刁两柱依 次串联 , 1
m g / m L S p G 上样 量 2 0 拌L , 流动相 为 0 . 0 2 m o l几
K姚 P 0 4 , 流速 0 . 6 m Lm/ in , 柱 温 40 ℃ 。 标 准 品为
W a t e r s D e x t r a n 系列 ,峰位分子量分别为 4 4 0 0 、 9 9 0 0 、
2 0 0 5年第 3 , 卷第 , , 期 (总第 2 , 5期 )
DOI : 10. 13995 /j . cnki . 11 -1802 /ts . 2005. 11. 001
2 4 1 0 0 0
、
4 35 0 0
、
2 14 0 0 0
、
6 9 1 0 00
、
2 7 7 0 0 0
、
4 01 0 0 0u
。 标
准 品 和样 品均 用 0.2 0m o l L /K从 P q溶 解 并 经
0
.
2 拌 m微 孔滤膜 过滤 , 实验用 水为超 纯水 。 随机
B er ez e 软件进行数据分析 。
1
.
2
.
4 刚果红 实验 l6[
1
.
2
.
4
.
1 N a O H 对 S P G 构象的影响
配制 5 . 0 x 10 ’ “ m ol 几 的刚果红溶液 , 0 . 002 %
和 0 . 0 0 4 % S P G 溶液 , N a O H 浓度系列为 0 . 1一 0 . 7
m o l/ L
。 将刚果红 、 S P G 溶液和 N a O H 溶液按体积比
1 : 1 : 2 混合并摇匀 , 2 5℃ 静置 20 m in 后用紫外 可见
分光光度计于 4 0 0 一 6 0 0 n m 进行扫描 , 利用随机 U -
N IC O 软件读取其最大吸收波长 。
1
.
2
.
4
.
2 N a
+ 、
K
十对 S P G 构象的影响
取一定量的 1 . 2 . 2 中含 N a CI 和 K CI 的 S P G 溶
液 , N a O H 浓度为 0 . 5 m ol 几 ,其余同 1 . 2 . 4 . 1 方法进
行 。
配置一系列不同质 量浓度 的 S P G 溶液 , 固定其
他测量条件 , 记 录其在不 同转速 下 的粘 度 , 作 出粘
度 一 剪切速率 曲线 (图 2 ) 。 可 以看到 , 在 0 . 10 3 % 一
0
.
0 3 1 % 的质量分数范围内 , S P G 的粘度 随着剪切速
率的增加而 降低 , 表现为非牛顿流体的剪切稀化现
象 。 当 S P G 的质量分数为 0 . 01 0% ,其粘度基本不随
剪切速率变化 , 即表现为牛顿流体特性 。 这和大多数
高分子溶液的流变学特性一致 。
一一峨) . 1吸, 3%
. 。月8 2%
. , 、 , 、 一门 r J
-
~ , . - 吸入飞夕〕 `
,陀
一 , () :`)1 l%
了、 日七, J 曰公一 - . M ,” ,珊 }
洲溯4(x)2阴
2
.己任、侧舒婆书截
2 结果与讨论
2
.
1 特性粘数和分子 t
特性粘数作为反映高分子溶液粘度 特性 的一个
物理量 ,不随其浓度而改变 。 将 S P G 的比浓粘度与
其对应的浓度作图 ,可得一直线 。 通过计算可以得到
s P G 的特性粘数为 6 25 . 29 m L电 。 其 G P C 洗脱曲线
见图 1 , 测定其峰位 ( M p ) 、重均 ( M w )和数均分子
量 ( M n )分 别 为 3 . 8 x 10 7 u 、 2 . 5 x 10 7 u 和 1 . 2 火
10 7 u
。
M w / M n = 2
.
1 表 明样品分子量分布较分散 。
国内其他研究者报道的 S P G 的分子量主要在 10 5 一
10 6 4[, 7
, “ ] , 而多糖的分子量可能影响其理化性质和生
理活性 。
剪切速率 s/
图 2 不同浓度的 S P G 溶液的表观
粘度 一 剪切速率曲线
2
.
3 温度对 S P G 溶液粘度的影响
质量分数为 0 . 097 % 的 S P G 溶液 , 温度从 2 0℃
升至 70 ℃时 ,相对粘度逐渐降低 , 且趋势未发生 明显
变化 (图 3 ) 。
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一 ::池一一一一一一一止2 (卜 3《 ) 4吸} 凡吸》 以卜 丁暇,
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3 J价 1叹》 `M ) 15 1价 2叹)」了1 2 5 . 《拍 3 ( )注贾)
洗脱时间 ,而 n
图 1 S P G 的凝胶渗透色谱洗脱曲线
( ST K G 5 0 0 0 PW
: , + G 3 0 0 0 Pw
x l两柱 串联 , 4 0℃ ,
0
.
0 2 om l
/ L K H Z P O ;
,
0
.
6 m L m/
i n )
2
.
2 S P G 溶液浓度对其粘度的影响
图 3 温度对 SP G 溶液 (0 . 0 9 7 % )粘度的影响
iK at m盯 a 的研究也表 明 , 当温 度高于 13 5℃ 时 ,
sP G 由三螺旋结构解聚为单线圈结构 1 9 3。 而 s P G 解
聚后的松散构象使其粘度有所增加 , 因而可以推断 ,
随着温度的升高 , S P G 构象发生改变时其粘度 降低
的幅度会有所改变 。 类似的现象出现在和 S P G 具有
相似结构的从苦腐病菌中分离 的葡聚糖 的结构研究
中「’ 0〕。 因而在 2 0 一 7 0℃ , s P G 溶液构象仍然十分稳
定 。 考虑到进行膜过滤时即使低浓度 的 S P G 溶液仍
然十分粘稠 , 因而生产时可以适当提高处理的温度以
2 { 2 0 5 v
o l卫 1塑口鲤匹鱼鱼到旦
皿怒 l蛋易
加快分离速度而又不会造成其构象以及活性的破坏 。
2
.
4 p H 对 s PG 溶液粘度的影响
图 4显示 , 随着 N a O H 的加人 , S P G 的粘度先略
有增加 , 然后逐渐降低 。 一定浓度的 N a O H 可 以使
S P G 的三螺旋结构解体 , 变为无规卷曲构象 , 粘度会
增加 。 另一方面 , 三螺旋结构 的解体 又会导致 S P G
分子量的减少 ,使粘度降低 。 T ak as hi 〔2〕发现 , s P G 在
D M S O 中的分子量仅为在水溶液 中的 1 3/ 。 因而可
以推断 , 当 N a 0 H 的浓度较低时 , S P G 的三螺旋结构
未被破坏 , 因而分子量基本没有发生变化 , 但是 由于
部分氢键遭破坏 , 分子链的伸展加剧 , 因而粘度 略有
增加 ; 随着 N a O H 浓度的增加 , S P G 的三螺旋结构逐
渐解体 ,虽然无规则构象导致 粘度有所增加 ,但是相
对于分子量的影响来说小得多 , 因而仍表现为粘度的
降低 。 加人 H CI 时 , S P G 溶液粘度 的变化规律 与加
入 N a O H 类似 (图 5 ) ,但其粘度整体上表现为增加 。
可 以推测实验条件下其三螺旋结构没有解体 。
大值 。 这可能是由于多糖分子链 中存在的经基与某
些金属离子发 生络合 作用 , 形成 蛋 一 箱 结 构 , 导致
s P G 分子量加 大 ,溶液粘度增加〔“ 1。 可 以考虑开发
富集钙 、 铁 、 锌 、硒等的多糖保健品 。
一:、周ù门m筋式.口`zuj侧护挥邵豁
O J 》 0」 0 2 0 . 3 ( )一 4 0 一 5 ( ). 6 ( ). 7 () . 8
盐浓度m/ of · L一 ,
军
图 6 金属离子对 SP G 溶液粘度的影响
2
.
6 服浓度对 S P G 溶液粘度的影响
0
.
1一 0 . 7 m ol 几 的脉均使 S P G 溶液的表观粘度
有所增加 。 当脉的浓度为 0 . 3 m ol 几 时 , S P G 的表观
粘度有最大值 (图 7 ) 。 这 可能是 由于部分氢键 被破
坏 , S P G 的三螺旋结构有所伸展 。
( }干一 ,一尸 . ~一一一0诬) ( ) . 1 ( )之 《) . 3 ( ) 4 〔〕石 0乃 叹)万 ( )月N a 0 H 浓度 /m o l · L一 ,图 4 N aO H 浓度对 S P G 溶液 (0 , 09 7 % )粘度 的影响
己云、纂赵豁粥
(’)洲翎加.己三、划犷婆豁邵
腮的浓脚m of · L 一 ,
阳78角
科花m阴的M淞:。dujl振赵豁邵
( )注) 0 . 1 ( )2 ( ) 3 〔)滩 砚)石 ( )力 )`丁
H C I浓度 /m o I L一 ,
图 5 H C I浓度对 SP G 溶液 ( 0 . 0 97 % )粘度 的影响
2
.
5 金属离子对 S P G 溶液粘度的影响
图 6 说明 , 不同浓度的 N a 十 、 K + 、 M g Z + 、 e a Z 十 的
加人均可使 S P G 溶液的粘度增加 。 但各种金属离子
使其粘度增加的能力并不相 同 。 其 中 N a 十 、 K 十 对其
粘度的影 响较小 , 而 M犷十 、 c 扩+ 的影响较大 。 当加
人的金属离子的浓度为 0 . 3 m ol 几 时 ,其粘度 出现最
图 7 脉的浓度对 S P G 溶液 ( 0 . 103 % )粘度的影响
2
.
7 刚果红实验
2
.
7
.
1 N a O H 的浓度对 S P G 构象的影响
以 纯 的 刚 果 红 溶 液 作 为 空 白 , 0 . 0 2 % 和
0
.
0 4 % S P G 的加人均使刚果红的最 大吸收波长向
长波方 向移动 , 随 N a O H 浓度的升高 , 复合物 的最大
吸收波长逐渐减少 (图 8 ) ,说明 S P G 高度有序的螺旋
结构逐渐解体 。 其 他研 究者也有相似 的报 道比 ` 2二。
由图 8 还 可 以 发 现 , 当 SP G 浓 度 为 0 . 0 0 2 % 时 ,
N a O H 浓 度 分 别 为 0 . 2 一 0 . 3 m o l / L 和 0 . 4 一 0 . 5
m ol 几 , S P G 和刚果红的复合物出现相对稳定 区域 ,
表明 s P G 存在多股螺旋构象 :6[ , 同时也说明用 刚果
红染色法进行多糖构象的研究 ,存在刚果红 一 多糖浓
度的最适配 比问题 。
2四些型盆翌鱼笙叼 期 (总第 2 , 5 期 )l 3
一一 刚果红 ( ) 4不 同浓度的金属离子的加人使 S PG 溶液的
粘度增加 ,但 M g Z + 、 C aZ 十 比 N a 十 、 K + 对 s P G 粘度的
影响较大 。 0 . 1一 0 . 7 m ol 几 脉使 S P G 溶液的粘度有
所增加 。 刚果红实验表明 , N a 0 H 可 以使 S P G 的三
螺旋结构解体 , 而不同浓度的 N a 干 、 K + 可 以稳 定其
构象 。 且同样的浓度条件下 ,和 K + 作用的 S P G 溶液
构象更为稳定 。
州绷柳姗已`ù串努邻叠报垠
f加. 1 〔卜2 硬加二弓 〔)滩 哎)石 ( )石 ( )了
N aO H 浓度 /m o 一 L 一 ,
图 8 N aO H 浓度对 SP G 构象的影响
参 考 文 献
2
.
7
.
2 N a
+ 、
K
+ 对 S P G 构象的影响
不同浓度的 N a + 、 K 十均使 S P G 和刚果红形成的
复合物的最大吸收波长红移 , 说明 N a 十 、 K 十都 可以
起到稳定 S P G 构象的作用 。 且 同样的浓度条件下 ,
和 K 十作用 的 S P G 溶液构象更为稳定 。
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2 叹). 3 ( ) 4 ( ) . 5 (卜石 () , 了 () 8
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任u、率侧邻岑袱竭
盐的浓度l m 川 · L 一 ,
图 9 盐浓度对 SP G 构象的影响
3 结 论
( 1 )所 分离 的裂 褶菌 胞外 多 糖 的特 性粘 数 为
6 2 5
.
2 9 m L馆 , 其 重 均分 子量 ( M w ) 、 数 均分 子 量
( M n )和峰位分子量 ( M p )分别为 2 . 5 X 10 , 、 1 . 2 X
1 0 7 和 3 . 8 火 10 7。
(2) 质量浓度为 0 . 01 0 % 的 S P G 表现为 牛顿 流
体 ,大于此浓度则表现为非牛顿流体 。 温度从 20 一
70 ℃时其相对粘度逐渐降低 ,但其构象十分稳定 。
( 3) 低浓度 H CI 和 N a 0 H 的加人使 SP G 溶液 的
粘度有所增加 , 随着酸和碱浓度的增加其粘度逐渐降
低 。 大于 0 . 1 m ol / L 的 N a 0 H 使 SP G 三螺旋结构逐
渐解体 , S P G 因分子量的减少粘度降至对照值以 下 。
但加入 0 . 1一 0 . 7 mo l / L 的 H CI , 其粘度整体上表现
为增加 。
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m e a s u r e d by G e l P e mr
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0 1 0 % ( w t% ) S P G a q u eo u s s y s t e m b e h a v e s a s N e w t o n i a n
f lu id s a n d i t s v i s e o s it y d e e r e a s e s w i t h t h e i n e r e a s i n g o f t e m p e r a t u r e for m 2 0℃ t o 7 0℃ . T h e v i s co s i t y o f S P G so l u -
t io n i n e er a s e s w i t h 0
.
1一 0 . 3 m o l几 h y d or e h lo r i e a e id o r 0 . 1 m o l / L so d iu m h y d or x id e so lu t i o n , b u t i t d e e r e a s e s
w i t h h i g h e r e o n e e n t r a t io n o f h y d or
e h lo r i e a e i d o r s o d i u m h y d r o x i d e so l u t i o n
.
H o w e v e r t h e v is co s i t y o f S P G a q e o u s
w i t h a b o v e 0
.
5 m o lL/ so d i
u m h y d or x i d e so lu t io n 15 sm a l le r t h a n t h a t o f b l a n k w h i e h e o n t a i n s d is t il l e d w a t e r o f t h e
s a m e V o lu m e a s t h e so d i
u m h y d r o x id e
,
w h i l e t h e v i s e os i t y o f S P G a q e o u s w i t h 0
.
1一 0 . 7 m o lL/ h y d or e h lo r i e a e id
15 h i g h e : t h a n t h a t o f b la n k
.
T h e v i s e o s i t y o f S p G a q e o u s c a n b e im p or
v e d b y a l l o f N a
+ ,
K
+ ,
M犷+ , C a Z + a n d 15
o b v io u s l y i n e er a s e d e v e n m o r e b y M g Z
十 ,
e a Z
十 t h a n N a
十 ,
K
+
.
T h e e o n g o r e d e o lo u r a t io n e x p e r im e n t s h o w e d t h a t
t h e t ir p le h e l i x s t r u e t u er o f S P G e a n b e d es t r o y e d b y s o d i u m h y d or x id e so l u t i o n a n d t h e o dr e r e d s r r u e t u er ca n be
s t a b li z e d b y e e r t a i n e o n e e n t r a t i o n s o f N a
十 a n d K
十 , e s p e e ia l ly b y K
十 i n t h e e x p e r im e n t
.
K e y w o r d s s e h i z o p h y l l a n
, v i s e o s i t y
, e o n f or m
a t i o n
ha 一} 5