全 文 ：分离与提取
2012年第 38卷第 8期(总第 296期) 197
径向流耦合超滤分离纯化铜藻多糖及其烟丝保润的应用*
邵平1，杨君2，黄芳芳2，叶超凡1，孙培龙1
1(浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江 杭州，310014) 2(浙江中烟工业有限责任公司技术中心，浙江 杭州，310008)
摘 要 研究铜藻提取液通过径向流色谱快速脱除蛋白质的工艺参数，以蛋白质脱出率和多糖保留率为考查指
标，考察进样浓度、进样量、进样速度以及洗脱速度参数的影响。结果表明:当上样流速 5 mL /min，洗脱速度 40
mL /min，上样量 100 mL，上样浓度 5mg / mL时，蛋白质脱除率为 74. 35%，多糖保留率为 80. 75%。利用超滤技
术将通过径向流后和未通过径向流的铜藻多糖分离为 10 ku以下、10 ～ 100 ku 和 100 ku 以上各 3 个组分，通过
对比多糖组分的蛋白质脱除率，得出径向流耦合超滤较单一法蛋白质脱除率上都有提高，耦合法脱除率达 95%
以上。对铜藻多糖各组分的保润性能进行测定，结果显示，铜藻多糖无论在防止解吸还是防止吸湿方面都有提
高。
关键词 铜藻，径向流，超滤，多糖，保润
第一作者:博士，副教授(孙培龙教授为通讯作者)。
* 浙江省重大科技攻关项目(2011C12040) ，浙江省科技创新团队
专项(2009Ｒ50029)
收稿日期:2012 － 04 － 05，改回日期:2012 － 08 － 23
铜藻俗称“丁香屋”(中国南麂岛) ，隶属于马尾
藻属。铜藻是北太平洋西部特有的暖温带性海
藻［1］，是提取褐藻胶的重要原料，因富含有益的生源
要素而被广泛应用到医药、食品、饲料和有机肥料方
面。研究表明，铜藻藻体含褐藻酸、褐藻淀粉、甘露醇
及多种氨基酸、多糖、蛋白质、维生素等。铜藻具有消
痰软坚、清热利水的功效。近年来，国内外专家对于
铜藻的研究主要集中在铜藻养殖和生物学研究，对
于铜藻多糖的研究较少。由于其含有多个羟基可以
进一步探索其保湿保润作用，铜藻多糖具有良好的保
湿保润作用，因此铜藻多糖的开发和用途是一个有
待于进一步研究的新课题。
铜藻粗提液中有大量蛋白质，需要去除。朱尊权
等人［2］通过将羊栖菜的粗提液加入乙醇，混匀后在
4℃下静置 8 h 以上，再经离心、过滤，脱除了部分蛋
白质，但无论从脱除效果或时间上都不理想。径向流
色谱法(radial flow chromatography，ＲFC)是近十几年
来发展起来的一种新型的色谱分离分析技术，它采用
特殊的径向流动设计，分离速度快、处理量大、压降
小，便于线性放大［3 － 4］，在农产品［5］、基因工程产
品［6］、血液制品［7］和生物样品［8］等的分离纯化中已
得到广泛应用，但纯化效果有限，如蛋白质一般脱除
率在 80%左右;利用超滤技术纯化多糖，不同的超滤
膜的纯化效率不同，但纯化效率较高的超滤膜，其蛋
白质脱除率也在 80%左右，两者单独使用纯化得到
的多糖纯率尚未达到保润剂所需要求。而利用径向
流耦合超滤的方法不仅在分离纯化效果上与轴向相
当，可达到 95%以上甚至 99%，且该方法又继承了处
理速度快、处理量大优点，是一种新型的适用于工厂
化的多糖分离纯化方法。
本项研究的目的在于利用径向流色谱脱除铜藻
提取液中大部分蛋白质，然后通过超滤将提取液分为
3 个组分并进一步脱除蛋白质，通过测定保润性能及
感官评定得到较好的多糖组分。
1 材料与试剂
铜藻多糖提取液:通过超声提取仪提取铜藻多
糖，经过离心、过滤及浓缩得到提取液。
烟丝:由浙江中烟工业有限责任公司提供。
苯酚、浓硫酸、氢氧化钠、亚硫酸钠、3，5-二硝基
水杨酸、碳酸钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、硫酸铜、盐酸、
牛血清蛋白、弱碱性阴离子交换剂(A103S)。
2 仪器设备
FS-1200 型直插式超声波细胞破碎器(上海生析
仪器) ，V-1800PC型可见分光光度计(上海美谱达仪
器) ，CＲ21GⅡ型高速冷冻离心机(日本日立仪器) ，
AL104 电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司) ，
ALPHA2-4LD plus型真空冷冻干燥机(德国 Christ 公
司) ，HWS-150 型恒温恒湿箱(上海森信实验仪器有
限公司) ，径向流色谱柱(SUPEＲFLO-250 COLUMN，
美国 Sepragen公司) ，超滤系统［(Congent M 美国密
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理博公司) ，超滤膜:改良聚醚砜复合膜(PES) ，膜面
积 0. 1 m2，膜分子质量:100、10 ku，其中 100 ku膜为
tpye C，10 ku膜为 type A］。
3 实验方法
3. 1 铜藻多糖分离及其保润工艺流程
铜藻提取液→经径向流去除蛋白质→经超滤分离铜藻多糖得到 3 个组分→按比例添加到烟丝中→评吸
↘ ↓
经超滤分离铜藻多糖得到 3 个组分→各组分多糖蛋白质脱除率对比
3. 2 径向流色谱脱除铜藻多糖中蛋白质的工艺流程
离子交换剂预处理→装柱→上样→洗脱→收集洗脱液→浓缩→干燥→铜藻多糖
↑ ↑
铜藻提取液→离心 填料再生
填料弱碱性阴离子交换剂(A103S)预处理 :2%
NaOH溶液浸泡 2 ～ 4 h → 纯水洗涤至中性 → 3%
HCl溶液浸泡 2 ～ 4 h → 纯水洗涤至中性→2%
NaOH溶液浸泡 2 ～ 4 h → 纯水洗涤至中性。
装柱:将经过预处理的离子交换剂脱气后，手动
装填于径向流色谱柱中;装柱后，用 5 倍体积纯水先
反向冲洗柱子，再用 5 倍体积纯水正向冲洗柱子，以
使柱子平衡。
铜藻提取液:按照需要的多糖浓度配置得到的铜
藻提取液，在 10 000 r /min下离心除去不溶物。
上样、洗脱:将一定量的铜藻多糖溶液用恒流泵
于一定流速下上样，然后用蒸馏水洗脱至苯酚-硫酸
法无多糖检出。
收集洗脱液:将收集的洗脱液分别用苯酚-硫酸
法［9］及 Folin-酚法［10］测定其中的多糖和蛋白质含量。
填料再生:所用离子交换剂经再生后可重复使
用，即利用 2 mol /L NaCl 溶液洗脱，至洗脱液无色透
明，且用 Folin-酚法基本无蛋白检出，再用蒸馏水洗
脱至无 NaCl。
3. 3 利用超滤分离铜藻多糖工艺流程
铜藻多糖溶液→经 10 ku的超滤膜→收集滤过液→冷冻干燥
↓
截留液再经 100 ku的超滤膜→收集滤过液→冷冻干燥
↓
收集截留液→冷冻干燥
超滤:用水泵于一定流速使铜藻多糖溶液通过不
同规格的超滤膜，膜压力控制在 2. 068 × 105 Pa以下。
收集截留液:将收集的截留液分别用苯酚-硫酸
法及 Folin-酚法测定其中的多糖和蛋白质含量，并浓
缩至黏稠液体。
收集滤过液:将收集的滤过液分别用苯酚-硫酸
法及 Folin-酚法测定其中的多糖和蛋白质含量，并浓
缩至黏稠液体。
3. 4 多糖回收率和蛋白质脱出率的计算方法
多糖回收率 /% =洗脱液中的多糖总量 /上样液
中的多糖总量 × 100
蛋白质脱出率 /% = ( 1 －洗脱液中的蛋白质总
量 /上样液中的蛋白质总量) × 100
3. 5 铜藻多糖的保润性能测定及应用
3. 5. 1 解湿实验
将平衡后的烟丝放入底部有 38%的 H2SO4 的干
燥器中，并将干燥器放入温度 22℃ ± 1℃，相对湿度
40% ±2%条件下。将每次取出的样品(烟丝 +称量
瓶)进行称量(精确至 0. 0001 g) ，前 2 d 每天取样 2
次，之后每天取样不少于 1 次，至质量恒定。根据样
品起始含水率和各时间点样品与起始样品的重量差
计算样品的即时含水率。
3. 5. 2 吸湿实验
平衡后的烟丝放入温度 22℃ ± 1℃，相对湿度
40% ±2%条件下。将每次取出的样品(烟丝 +称量
瓶)进行称量(精确至 0. 0001 g) ，前 2 d 每天取样 2
次，之后每天取样不少于 1 次，至质量恒定。根据样
品起始含水率和各时间点样品与起始样品的重量差
计算样品的即时含水率。
试样的水分质量百分含量:
W /% =
m － m0 ( 1 － w0 )
m × 100
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式中:W，试样的几时含水率(%) ;
m0，恒重的烟丝质量(g) ;
W0，初始含水率(%) ;
m，样品的即时重量(g)。
空白烟丝平衡→添加提取液或蒸馏水→平衡→
卷制成卷烟→感官评定
平衡条件:在恒温(22℃ ± 1℃)恒湿(60% ±
2%)条件下平衡 48 h。
添加提取液或蒸馏水:将 3 种组分及铜藻粗提液
按多糖添加量为烟丝质量的万分之二添加，并添加相
等质量蒸馏水作为空白对照。
卷制卷烟:按每支卷烟 0. 7 g 烟丝打制成评吸样
品烟。
4 实验结果与讨论
4. 1 径向流色谱脱除铜藻多糖中蛋白质实验结果
4. 1. 1 上样浓度对径向流色谱纯化铜藻多糖的影响
确定上样量 50 mL，上样流速 5 mL /min，洗脱流
速 40 mL /min的条件下，测定了上样浓度对径向流色
谱纯化铜藻多糖的影响，结果见图 1。
图 1 上样浓度对径向流色谱纯化铜藻多糖的影响
通过图 1 可以看出，随着上样浓度的增大，蛋白
脱除率有一定的降低;多糖回收率随上样浓度的增加
下降显著。蛋白脱除率的降低是由于随着上样浓度
的增大，溶液黏度增大，使得样品在柱内扩散速度变
慢，未能与离子交换剂充分接触时，就已经随流动相
一起流出，从而降低了纯化效率。而过低的上样浓
度，会大大降低分离纯化速率。因此，确定合适的最
大上样浓度，即可在达到较高的纯化效率的同时保持
较高的分离速率。综合考虑认为 5 mg /mL 是较为适
宜的上样浓度。
4. 1. 2 上样量对径向流色谱纯化铜藻多糖的影响
确定上样浓度 5 mg / mL，上样流速 5 mL /min，洗
脱流速 40 mL /min时，测定了上样量对径向流色谱纯
化铜藻多糖的影响，结果见图 2。
图 2 上样量对径向流色谱纯化铜藻多糖的影响
实验结果显示，随着上样量的增大，蛋白脱除率
随上样量增大的变化趋势先是较为平缓，当上样量达
到 150 mL时，急剧下降，当上样量为 200 mL时，蛋白
脱除率降低至 60%。多糖回收率则随上样量的增
大，总体呈缓慢下降的趋势。一定体积的离子交换剂
的交换容量是一定的，当上样量超过一定体积时，离
子交换剂交换吸附达饱和状态，过多的蛋白质及多糖
等物质未被交换吸附直接流出柱外，而未能达到纯化
作用。当分离过程以蛋白质脱除为主要目的时，上样
量取 100 mL较为适宜。
4. 1. 3 上样流速对径向流色谱纯化铜藻多糖的影响
在确定上样浓度 5 mg /mL，上样量 50 mL，洗脱
流速 50 mL /min时，测定了上样流速对径向流色谱纯
化铜藻多糖的影响，结果如图 3 所示。
图 3 上样流速对径向流色谱纯化铜藻多糖的影响
实验结果显示，随着上样流速的增大，蛋白质脱
除率呈现下降趋势，但多糖回收率的变化不大。上样
流速增加使得样品未能充分得吸附到填料上，从而降
低蛋白质脱出率。上样流速过低会导致分离时间增
加，在保证分离效果和分离效率的情况下，上样流速
选择 5mg /mL。
4. 1. 4 洗脱流速对径向流色谱纯化铜藻多糖的影响
在确定上样浓度 5 mg /mL，上样量 50 mL，上样
流速 5 mL /min的条件下，测定了洗脱流速对径向流
色谱纯化铜藻多糖的影响，结果如图 4 所示。
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图 4 洗脱流速对径向流色谱纯化铜藻多糖的影响
图 4 可以看出，在洗脱流速较低时(＜ 30 mL /
min) ，蛋白脱除率随洗脱流速的增加有所增加;随着
洗脱流速继续增大，蛋白脱除率变化较为平缓;当洗
脱流速大于 50 mL /min时，蛋白脱除率随洗脱流速的
增加下降较快。总体来说多糖回收率则随洗脱流速
的增加，洗脱流速对径向流色谱纯化铜藻多糖的影响
较为平缓。即使洗脱流速达 50 mL /min时，蛋白脱除
率能达 75%。这主要是因为径向流色谱柱的特殊径
向流动设计，使得即使在较高体积流速下，柱内线速
度仍保持较低，操作中也始终能保持较低的工作压
力。综合考虑，洗脱流速定为 40 mL /min较为适宜。
考察了 4 个参数对铜藻多糖的蛋白质脱除率和
多糖回收率的影响，得到较好的工艺参数为:上样流
速 5 mL /min，洗脱速度 40 mL /min，上样量 100 mL，
上样浓度 5mg / mL，此条件下的蛋白质脱除率为
74. 35%，多糖保留率为 80. 75%。
4. 2 利用超滤分离铜藻多糖结果
将经过径向流色谱和未经过径向流色谱的 2 种
铜藻提取液分别利用超滤分离，图 5 显示的是 2 种提
取液各组分的蛋白质脱除率对比。从图 5 中可以看
出，10 ku以下的蛋白质脱除率达到 95%以上，10 ku
到 100 ku部分由于物质干重较少，蛋白质的脱除率
达到 99%以上，都比仅经过径向流后的脱除率高，这
说明超滤过程不仅将提取液中的各成分按分子质量
大小区分开，同时具有进一步脱除蛋白质的作用。另
外经过径向流耦合超滤的提取液的各组分与仅经过
超滤的提取液相应各组分，蛋白质的脱除率都是有一
定程度的提高，这说明径向流与超滤的耦合比起单独
使用两种技术在去除蛋白质的功效上都有所提高。
图 5 各组分蛋白质脱除率的对比
测定各组分的多糖含量，图 6 为铜藻提取液中多
糖各组分的分布情况。从图 6 中可以看出，分子质量
10 ku以下的多糖含量达到 38%，100 ku 以上的多糖
含量有 39. 2%，而 10 ～ 100 ku只有 3. 56%，说明铜藻
多糖主要集中在 10 ku以下和 100 ku以上。
图 6 多糖各组分的分布
4. 3 铜藻各组分的多糖的保润性能及感官评定结果
解吸实验测定结果如表 1 所示。
表 1 解吸试验即时含水率计算结果
含水率 /%
测定时间 /h 4 8 12 24 36
空白样 11. 154 11. 030 10. 889 10. 006 9. 759
铜藻粗提液 11. 2765 11. 116 11. 0132 10. 0386 9. 8846
10 ku以下 11. 2563 11. 1879 11. 1026 10. 2035 9. 8946
10 ～ 100 ku 11. 294 11. 206 11. 084 10. 110 9. 952
100 ku以上 11. 3159 11. 156 11. 0532 10. 0786 9. 9246
含水率 /%
测定时间 /h 60 84 108 132 156
空白样 8. 538 7. 613 7. 455 7. 435 7. 413
铜藻粗提液 8. 8446 8. 0596 7. 7295 7. 3819 7. 3723
10 ku以下 9. 0264 8. 2164 7. 8439 7. 5133 7. 5076
10 ～ 100 ku 8. 919 8. 130 7. 812 7. 457 7. 450
100 ku以上 8. 8846 8. 0996 7. 7695 7. 4219 7. 4123
分离与提取
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根据差量法测得的解吸试验即时含水率(表 1) ，
并通过图 7 可以看出，铜藻多糖提取液相比蒸馏水能
有效减缓水分的失去，并且最终铜藻多糖对于烟丝水
分的保留略强于蒸馏水，并且 3 个组分的多糖的保润
性能与粗提液差异不大。
图 7 解吸试验即时含水率
吸湿实验测定结果:
图 8 吸湿试验即时含水率
根据差量法测得的吸湿试验即时含水率(表 2) ，
并通过图 8 可以看出，铜藻多糖提取液相比蒸馏水能
有效防止水分的吸收，并且最终的含水率要略低于蒸
馏水，3 种组分的多糖相差无异。
表 2 吸湿试验即时含水率计算结果
含水率 /%
测定时间 /h 4 8 12 24 36
空白样 11. 3758 14. 2510 16. 0556 17. 1756 17. 8139
铜藻粗提液 11. 8152 13. 6120 14. 9408 15. 8763 16. 3135
10 ku以下 11. 7393 13. 2632 14. 4650 15. 0650 15. 7026
10 ～ 100 ku 11. 6394 12. 9690 14. 3683 15. 0271 15. 7653
100 ku以上 11. 9859 13. 5456 14. 6530 15. 2365 15. 9965
含水率 /%
测定时间 /h 60 84 108 132 156
空白样 18. 5369 19. 0563 19. 1368 19. 1865 19. 1886
铜藻粗提液 16. 8365 17. 4032 17. 7352 18. 1654 18. 5638
10 ku以下 16. 5236 17. 2326 17. 9265 18. 2125 18. 3639
10 ～ 100 ku 16. 4896 17. 3032 17. 7186 18. 0983 18. 3654
100 ku以上 16. 5634 17. 4563 17. 8365 18. 2835 18. 6782
将 4 种不同的提取液进行感官评定。结果表明:
(1)添加了提取液的烟丝烟气干燥感都有所改善，生
津感和圆润感都有所增加;(2)10 ku和 10 ～ 100 ku 2
个组分的刺激感下降较多，可能与脱除了大部分蛋白
质有关;(3)10 ku 以下和 10 ～ 100 ku 的多糖添加到
烟丝中后无论从提高生津感和圆润感还是烟气的细
腻柔和程度都是各组分中最出色的，因此该组分的多
糖较为适合添加到烟丝中改善吸食的口感。
表 3 铜藻各组分多糖添加到烟丝中的评吸结果
提取液 感官评定结果
铜藻粗提液
烟气较柔和、细腻和生津感，烟气干燥感下降，对
卷烟风格特征无影响。
＜ 10 ku
生津感、圆润感增加 ，烟气细腻柔和，干燥感下
降，刺激性较粗提液下降。
(10 ～ 100 ku) 生津感，细腻柔和度都有改善，刺激性下降。
＞ 100 ku 圆润度，细腻柔和度略有提升，但刺激性较大 。
5 结论
通过径向流各影响条件的单因素实验得到径向
流脱除铜藻多糖提取液较优工艺参数为上样流速 5
mL /min，洗脱速度 40 mL /min，上样量 100 mL，上样
浓度 5 mg / mL，此条件下的蛋白质脱除率为
74. 35%，多糖保留率为 80. 75%，耦合法脱除率达
95%以上。将经过径向流后的铜藻提取液通过超滤
分成 10 ku 以下、10 ～ 100 ku 和 100 ku 以上 3 个组
分，将 3 组分的多糖提取液进行保润性能测定，得出
铜藻多糖无论在防止解吸还是防止吸湿方面较蒸馏
水都有一定提高。对铜藻提取液进行感官评定，得到
分子量在 10 ku 以下或 10 ～ 100 ku 组分较为适合作
为保润剂添加到烟丝中。
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202 2012 Vol. 38 No. 8 (Total 296)
参 考 文 献
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Separation of Sargassum Horneris Polysaccharides by Ｒadial
Flow Chromatography Coupling Ultrafiltration and Its Application
in Tobacco Moisture Ｒetention
Shao Ping1，Yang Jun2，Huang Fang-fan1，Ye Chao-fan1，Sun Pei-long1
1(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China)
2(China Tobacco Zhejiang Industrial CO．，LTD，Hangzhou 310008，China)
ABSTＲACT The process parameters of deproteinized of Sargassum Horneris extraction through radial flow chroma-
tography was studied． Sample concentration，sample volume，sample flow-rate and elution flow-rate were studied on
the influence of the deproteinization rate and polysaccharide recovery rate． The result showed that in the condition of
sample flow-rate 5mL /min，the elution flow-rate 40mL /min，the sample volume 100mL and the sample concentration
5mg /mL，the deproteinization rate was 74． 35% and the polysaccharide recovery rate was 80． 75% ． Furthermore，ul-
trafiltration was applied to separate the polysaccharides of passed and residues of the radial flow chromatography into
three groups:less than 10ku，between 10ku and 100ku and above 100ku． The comparison of protein removal rates
from polysaccharides indicated that ultrafiltration coupled radial flow chromatography improved the protein removal
rates to 96% ． The moisture retention capacity of polysaccharides of Sargassum Horneri indicated that the ability of
preventing desorption and moisture was both improved．
Key words sargassum horneris，radial flow chromatography，ultrafiltration，polysaccharides，moisture retention